CN117003779B - 一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针及其制备方法 - Google Patents
一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具备圆偏振荧光（CPL）性能的三磷酸腺苷（ATP）探针，该探针包括两个结构单元：一个基于罗丹明B的触发单元和一个CPL响应单元；ATP触发前，罗丹明B单元处于闭环状态，无荧光发出，当被ATP触发开环后，罗丹明B单元发射出橙黄色荧光，并通过共振能量转移（FRET）把部分能量传递给CPL响应单元，从而激活CPL，发射出圆偏振光；本发明的分子探针可以在低浓度的溶液状态下检测ATP，并根据CPL强度反映ATP的含量。根据本发明CPL分子探针可以在细胞水平上对ATP响应并高分辨率成像，自动过滤背景荧光的干扰，CPL成像与传统荧光成像相比具有更高的清晰度和准确度。
Description
技术领域
本发明涉及荧光分析和有机合成技术领域，具体说是一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针及其制备方法。
背景技术
三磷酸腺苷（ATP）是机体内肌肉收缩、酶催化、细胞器运输和神经元膜电位的维持等生理活动的主要能源物质。在线粒体中，ATP是通过一系列称为氧化磷酸化的化学和生物过程将磷酸酯加到二磷酸腺苷（ADP）中产生的。机体内ATP的含量与细胞代谢和细胞凋亡有很密切的联系，许多疾病如心血管疾病、帕金森综合症及阿尔兹海默症的发生都伴随着ATP含量异常。因此，对ATP的检测在生命科学及医学临床研究中具有重要意义。
目前ATP的检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、生物荧光法、电化学以及荧光生物传感器检测等。高效液相色谱法需要耗费大量的有机溶剂，对环境污染大，检测费用高，且难以达到微量检测水平；基于荧光素酶的ATP检测方法受基质中成分荧光淬灭的影响较大，准确度低；相比之下，荧光传感器具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点。ATP荧光传感器的检测原理主要是通过静电作用、氢键作用或π-π相互作用，传感器与ATP相互作用，从而改变荧光分子的结构，使其发光光谱发生变化，以此检测ATP。然而传统荧光信号极易受到自发荧光影响，尤其是需要定量的时候，因为自发干扰荧光几乎覆盖了整个紫外可见光，甚至近红外区域。所以荧光探针领域一个需要亟待解决的问题就是怎样克服自发荧光。
近年来，随着圆偏振荧光（Circular Polarized Luminescence，CPL）技术的发展，一些研究者正在将CPL引入生物成像领域。圆偏振发光（CPL）指物质在一定波长的光激发下选择性地发出左旋和右旋圆偏振光，反映的是物质在激发态的手性，其在3D显示、量子通讯、信息存储、生物检测等高新技术领域有着广阔应用前景。与非偏振荧光光谱相比，CPL能排除其它非手性发光基团的干扰，在分子传感与检测上能表现出更高的灵敏度与分辨率。CPL传感器几乎可以完全避免用普通荧光传感器出现的假阳性信号，这是由于CPL只能由手性发光材料射出，这就完全避免了非手性干扰物质发出的普通荧光，故CPL成像中的噪音信号理论值接近零，使超高清成像成为可能。
发明内容
为解决传统荧光探针的缺点主要是极易受背景自发荧光的干扰，从而降低了分辨率和准确度的问题，本发明的目的是提供一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针及其制备方法。将CPL引入到了荧光探针的设计中，利用圆偏振光的手性特点自动过滤背景自发荧光。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针，结构式如R-BPD-RB所示：
；
R-BPD-RB。
本发明还包括一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，反应路线如下：
。
本发明涉及的CPL探针具有较好的生物安全性，可用来检测ATP的含量。该探针包括两个结构单元：一个基于罗丹明B的触发单元和一个CPL响应单元。ATP触发前，罗丹明B单元处于闭环状态，无荧光发出。当被ATP触发开环后，罗丹明B单元发射出橙黄色荧光，并通过共振能量转移（FRET）把部分能量传递给CPL响应单元，从而激活CPL，发射出圆偏振光。
上述一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
①制备化合物1：在对羟基苯甲醛中加入过量1,2-二溴乙烷，然后加入碳酸钾，搅拌反应10~15小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：将步骤①所得化合物1和NaN3溶解于DMSO中，在95~105℃下搅拌反应5~7小时，向其中加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：将步骤②所得化合物2和2,4-二甲基吡咯溶解于四氢呋喃中，滴加三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应2~3小时，依次加入三乙胺和三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应2~3小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入二氯甲烷中，用去离子水水洗，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：将步骤③所得化合物3溶解于三氯甲烷中，加入CS2，搅拌5~10分钟后加入三苯基膦，反应10~15小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：将步骤④所得化合物4和三氯化铝溶解于无水二氯甲烷中，在氮气保护下35~45℃下反应5~6小时，得到反应液2，备用；
将联二萘酚溶解于无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至45~55℃，避光反应10~15小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将罗丹明B和二乙烯三胺溶解于乙醇中，加热回流反应10~15小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先将步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于乙腈，得到乙腈溶液，将化合物5溶解于二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在20~35℃下反应3~4小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
优选地，步骤中①中对羟基苯甲醛、1,2-二溴乙烷和碳酸钾的摩尔比为1：3~5：2~3。
优选地，步骤②中，步骤①所得化合物1、NaN3、DMSO、水、乙酸乙酯的摩尔体积比为1mol：1.2~2mol：1.5~2L：1~1.5L：1~1.2L。
优选地，步骤③中，步骤②所得化合物2、2,4-二甲基吡咯、四氢呋喃、三氟乙酸、2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌、三乙胺、三氟化硼乙醚、二氯甲烷和去离子水的摩尔体积比为1mol：1.5~2mol：10~12L：10~15ml：1~2mol：1~2L：1~2L：0.5~0.8L：0.5~1L。
优选地，步骤④中，步骤③所得化合物3、三氯甲烷、CS2和三苯基膦的摩尔体积比为1mol：15~20L：1.5~2L：1~1.5mol。
优选地，步骤⑤中，步骤④所得化合物4、三氯化铝、无水二氯甲烷和联二萘酚、无水乙腈的摩尔体积比为1mol：2~3mol：25~30L：1.2~2mol：0.5~1L。
优选地，步骤⑥中，罗丹明B、二乙烯三胺和乙醇的摩尔体积比为1mol：25~28mol：12~15L。
优选地，步骤⑦中，步骤⑥所得中间体RB-NH2、乙腈、化合物5、二氯甲烷的摩尔体积比为2~3mol：5~10L：1mol：5~8L。
本发明相比现有技术具有如下优点：
本发明的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针，在低浓度的溶液状态下检测ATP，并根据CPL强度反映ATP的含量。根据本发明的CPL分子探针可以在细胞水平上对ATP响应，并高分辨率成像，自动过滤背景荧光的干扰，与传统荧光成像相比增加清晰度和准确度。
本发明的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针，因为探针中罗丹明结构单元跟ATP形成氢键导致五元杂环开环，在568nm附近出现了一个新的吸收峰，并随着ATP浓度的增加表现出吸收强度增加的趋势。更主要的，在568nm附近增加了一个新的发射峰，并随着ATP浓度的增加，两个发射峰强度表现出比率型变化，表明探针能够被ATP激活。该探针能够把ATP跟ADP和AMP明显区分开，对ATP表现出更高的特异性响应。特别的，该探针只在溶酶体pH范围内对ATP特异性响应。探针具有强的圆二色性，514nm附近表现出负的Cotton效应。探针可用于检测活细胞中的ATP。
附图说明
图1为探针分子核磁共振H谱图；
图2为探针分子核磁共振C谱图；
图3为探针分子质谱图；
图4为在ATP存在下探针分子的紫外-可见吸收光谱图；
图5为在ATP存在下探针分子的荧光光谱图；
图6为ATP浓度-光比率线性图；
图7为探针对不同底物的选择性对比图；图中10为柠檬酸，18为丙氨酸，19为谷氨酸，20 为谷胱甘肽，21为半胱氨酸，22为高半胱氨酸；
图8为探针在不同pH条件下对ATP 的响应对比图；
图9为探针分子在不同浓度ATP条件下的CD图；
图10为图9中波长480~560nm探针分子在不同浓度ATP条件下的CD局部放大图；
图11为探针分子在有无ATP下的CPL图；
图12为探针分子检测细胞内ATP图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针及其制备方法，以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1 一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针，结构式如R-BPD-RB所示：
；
R-BPD-RB。
上述检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，反应路线如下：
。
实施例2 实施例1所述的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
①制备化合物1：在122g对羟基苯甲醛中加入561g 1,2-二溴乙烷，然后加入276g碳酸钾，搅拌反应10小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：取206.1g步骤①所得化合物1和70.2g NaN3溶解于1.35L DMSO中，在95℃下搅拌反应5小时，向其中加入0.9L水，用0.9L乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：取152.8g步骤②所得化合物2和114g 2,4-二甲基吡咯溶解于8L四氢呋喃中，滴加8ml三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入181.6g 2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应2小时，依次加入0.8L三乙胺和0.8L三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应2小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入0.4L二氯甲烷中，用0.4L去离子水水洗，合并有机相后用80g无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：取245.4g步骤③所得化合物3溶解于9L三氯甲烷中，加入0.9LCS2，搅拌5分钟后加入157.2g三苯基膦，反应10小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：取212.5g步骤④所得化合物4和133g三氯化铝溶解于12.5L无水二氯甲烷中，在氮气保护下35℃下反应5小时，得到反应液2，备用；
将171.8g联二萘酚溶解于0.25L无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至45℃，避光反应10小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将479g罗丹明B和2.58kg二乙烯三胺溶解于乙醇中，加热回流反应10小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先取210.8g步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于1L乙腈，得到乙腈溶液，将184.6g化合物5溶解于1L二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在20℃下反应4小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
实施例3 实施例1所述的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
①制备化合物1：在122g对羟基苯甲醛中加入935g 1,2-二溴乙烷，然后加入414g碳酸钾，搅拌反应15小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：取206.1g步骤①所得化合物1和117g NaN3溶解于1.8L DMSO中，在105℃下搅拌反应7小时，向其中加入1.35L水，用1.08L乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：取152.8g步骤②所得化合物2和152g 2,4-二甲基吡咯溶解于9.6L四氢呋喃中，滴加12ml三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入363.2g 2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应3小时，依次加入1.6L三乙胺和1.6L三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应3小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入0.64L二氯甲烷中，用0.8L去离子水水洗，合并有机相后用100g无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：取245.4g步骤③所得化合物3溶解于12L三氯甲烷中，加入1.2LCS2，搅拌10分钟后加入235g三苯基膦，反应15小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：取212.5g步骤④所得化合物4和199.5g三氯化铝溶解于15L无水二氯甲烷中，在氮气保护下45℃下反应6小时，得到反应液2，备用；
将286.3g联二萘酚溶解于0.5L无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至55℃，避光反应15小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将479g罗丹明B和2.88kg二乙烯三胺溶解于15L乙醇中，加热回流反应15小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先取316.2g步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于2L乙腈，得到乙腈溶液，将184.6g化合物5溶解于1.6L二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在35℃下反应3小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
实施例4 实施例1所述的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
①制备化合物1：在122g对羟基苯甲醛中加入654.5g 1,2-二溴乙烷，然后加入331g碳酸钾，搅拌反应12小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：取206.1g步骤①所得化合物1和81.9g NaN3溶解于1.44L DMSO中，在98℃下搅拌反应5.5小时，向其中加入0.99L水，用0.94L乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：取152.8g步骤②所得化合物2和121.6g 2,4-二甲基吡咯溶解于8.4L四氢呋喃中，滴加8.8ml三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入217.9g 2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应2.4小时，依次加入0.9L三乙胺和0.96L三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应2.5小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入0.48L二氯甲烷中，用0.48L去离子水水洗，合并有机相后用95g无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：取245.4g步骤③所得化合物3溶解于9.6L三氯甲烷中，加入1.08LCS2，搅拌6分钟后加入183.4g三苯基膦，反应11小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：取212.5g步骤④所得化合物4和146.3g三氯化铝溶解于13L无水二氯甲烷中，在氮气保护下38℃下反应5.5小时，得到反应液2，备用；
将200g联二萘酚溶解于0.4L无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至48℃，避光反应11小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将479g罗丹明B和2.68kg二乙烯三胺溶解于13L乙醇中，加热回流反应12小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先取232g步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于1.2L乙腈，得到乙腈溶液，将184.6g化合物5溶解于1.2L二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在25℃下反应3.5小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
实施例5 实施例1所述的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
①制备化合物1：在122g对羟基苯甲醛中加入748g 1,2-二溴乙烷，然后加入303g碳酸钾，搅拌反应14小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：取206.1g步骤①所得化合物1和87.8g NaN3溶解于1.53L DMSO中，在100℃下搅拌反应6.5小时，向其中加入1.26L水，用1.04L乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：取152.8g步骤②所得化合物2和144g 2,4-二甲基吡咯溶解于9.2L四氢呋喃中，滴加11.2ml三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入327g 2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应2.5小时，依次加入1.4L三乙胺和1.5L三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应2小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入0.5L二氯甲烷中，用0.7L去离子水水洗，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：取245.4g步骤③所得化合物3溶解于10.8L三氯甲烷中，加入0.96L CS2，搅拌8分钟后加入220g三苯基膦，反应14小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：取212.5g步骤④所得化合物4和186.2g三氯化铝溶解于14L无水二氯甲烷中，在氮气保护下42℃下反应5.5小时，得到反应液2，备用；
将257.6g联二萘酚溶解于0.4L无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至52℃，避光反应14小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将479g罗丹明B和2.78kg二乙烯三胺溶解于14L乙醇中，加热回流反应14小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先取295g步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于1.6L乙腈，得到乙腈溶液，将184.6g化合物5溶解于1.4L二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在30℃下反应3.5小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
实施例6 实施例1所述的检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
①制备化合物1：在122g对羟基苯甲醛中加入过量1,2-二溴乙烷，然后加入345g碳酸钾，搅拌反应13小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：取206.1g步骤①所得化合物1和93.6g NaN3溶解于1.62L DMSO中，在102℃下搅拌反应5.5小时，向其中加入1.8L水，用0.99L乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：取152.8g步骤②所得化合物2和122g 2,4-二甲基吡咯溶解于8.8L四氢呋喃中，滴加11.2ml三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入272.4g 2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应2~3小时，依次加入1.2L三乙胺和1.2L三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应2~3小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入0.48L二氯甲烷中，用0.48L去离子水水洗，合并有机相后用95g无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：取245.4g步骤③所得化合物3溶解于10.2L三氯甲烷中，加入0.96L CS2，搅拌7分钟后加入210g三苯基膦，反应12小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：取212.5g步骤④所得化合物4和166.25g三氯化铝溶解于13L无水二氯甲烷中，在氮气保护下40℃下反应5.5小时，得到反应液2，备用；
将214.7g联二萘酚溶解于0.4L无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至50℃，避光反应12小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将479g罗丹明B和2.68kg二乙烯三胺溶解于14L乙醇中，加热回流反应12小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先取263.5g步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于1.2L乙腈，得到乙腈溶液，将184.6g化合物5溶解于1.2L二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在30℃下反应3.5小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
上述实施例中化合物2的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR (400 MHz, acetone-d 6): δ 9.94 (s, 1H), 7.92 (d, 2H, J = 8.84 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 8.72 Hz),4.38 (t, 2H, J = 9.76, 4.84 Hz), 4.38 (t, 2H, J = 9.64, 4.88 Hz)。
上述实施例中化合物3的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.21 (d, 2H, J = 11.30 Hz), 7.05 (d, 2H, J = 11.30 Hz), 6.00 (s, 2H), 4.23(t, 2H, J = 9.92, 4.92 Hz), 3.69 (t, 2H, J = 9.92, 4.92 Hz), 2.57 (s, 6H),1.45 (s, 6H)。
上述实施例中化合物4的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR (400 MHz, acetone-d 6): δ 7.35 (d, 2H, J = 8.52 Hz), 7.24 (d, 2H, J = 8.52 Hz), 6.13 (s, 2H),4.42 (t, 2H, J = 10.00, 4.96 Hz), 4.13 (t, 2H, J = 10.00, 4.96 Hz), 2.51 (s,6H), 1.48 (s, 6H);
HRESI-MS: m/z calcd. for C22H22BF2N3OS: 425.1545; found: [M+Na]+448.1471。
上述实施例中化合物5的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR (400 MHz, acetone-d 6): δ 8.56 (s, 2H), 7.90 (d, 2H, J = 8.12 Hz), 7.45 (d, 2H, J = 6.60 Hz),7.39 (t, 2H, J = 14.08, 7.00 Hz), 7.26-7.19 (m, 4H), 7.06 (d, 2H, J = 6.20Hz), 5.98 (s, 2H), 4.43 (t, 2H, J = 10.04, 5.00 Hz), 4.14 (t, 2H, J = 10.00,5.12 Hz), 1.63 (s, 6H), 1.50 (s, 6H);
核磁共振碳谱数据如下：13C NMR (100 MHz, acetone-d 6): δ 159.1, 155.7,152.8, 143.0, 141.8, 138.9, 133.8, 133.3, 131.0, 129.8, 128.2, 127.1, 126.4,126.0, 124.3, 122.6, 120.9, 115.5, 95.5, 66.3, 44.8, 14.9, 14.2。
HRESI-MS: m/z calcd. for C42H32BI2N3O3S: 923.4149; found: [M-H]-922.0275。
上述实施例中化合物中间体RB-NH2的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6): δ 7.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.50 (m, 2H), 7.03 (m, 1H), 6.35 (m,6H), 3.35-3.31 (m, 8H), 3.18 (t, J = 6.50 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 8.00 Hz, 2H),2.18 (m, 4H), 1.09 (t, J = 8.00 Hz, 12H)。
核磁共振碳谱数据如下：13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): δ 184.0, 167.2,153.8, 153.2, 148.9, 132.2, 131.4, 128.6, 128.1, 123.7, 122.3, 108.2, 105.7,97.97, 64.6, 51.7, 51.3, 50.5, 48.3, 44.9, 44.0, 41.0, 40.9, 37.5, 12.0.
HRESI-MS: m/z calcd. for C32H41N5O2: 527.3260; found: [M+H]+ 528.3353。
上述实施例中探针分子BDP-RB的核磁共振氢谱图如图1所示，对应数据如下：1HNMR (400 MHz, acetone-d 6): δ 8.56 (s, 2H), 7.90 (d, 2H, J = 8.12 Hz), 7.86(d, 1H, J = 8.03 Hz), 7.56 (m, 2H), 7.38 (t, 4H, J = 14.08, 7.00 Hz), 7.21(m, 4H), 7.08 (t, 3H, J = 13.88, 5.20 Hz), 6.44 (m, 4H), 5.97 (s, 2H), 4.29(t, 2H, J = 10.04, 5.00 Hz), 4.04 (m, 2H), 3.42 (dd, 6H, J = 14.04, 7.00 Hz),2.65 (m, 2H), 2.38 (t, 2H, J = 11.68, 5.80 Hz), 1.62 (s, 6H), 1.47 (s, 6H),1.17 (t, 2H, J = 13.96, 6.92 Hz)；
核磁共振碳谱图如图2所示，对应数据如下：13C NMR (100 MHz, acetone-d 6): δ159.7, 155.6, 153.3, 152.8, 149.0, 143.0, 142.0, 138.9, 133.8, 133.3, 132.5,131.0, 129.6, 128.6, 127.1, 126.4, 126.0, 124.2, 123.7, 122.5, 120.9, 115.3,108.3, 105.5, 97.6, 95.5, 44.0, 14.9, 14.3, 13.4, 12.0.
质谱图如图3所示，数据如下HRESI-MS: m/z calcd. for C74H73BI2N8O5S:1450.3607; found: [M+H]+ 1451.3834。
在ATP存在下探针分子的紫外-可见吸收光谱如图4所示，由图4可以看出，探针在524nm附近表现出一个主吸收峰。当加入ATP后主吸收峰基本没有变化，但是在568nm附近出现了一个新的吸收峰，并且该新峰随着ATP浓度的增加表现出吸收强度增加的趋势，这是因为探针中罗丹明结构单元跟ATP形成氢键导致5元杂环开环，证明探针能够被ATP激活。
在ATP存在下探针分子的荧光光谱如图5所示，由图5可以看出，有两个发射峰。这是因为探针本身表现出一个发射主峰在532nm附近，这是探针中BODIPY结构单元的特征发射；579nm附近的发射峰属于罗丹明开环后的特征发射，此处峰很弱是因为探针中的罗丹明结构单元只有极少部分处于自然开环状态。随着ATP浓度的增加，罗丹明结构单元跟ATP形成氢键导致5元杂环开环部分越来越多，从而579nm附近的发射峰逐渐增强。同时由于荧光共振能量转移的原因，BODIPY结构单元发射的绿光被开环罗丹明结构吸收，导致532nm附近的发射峰逐渐减弱，从而整个探针表现出针对ATP的比率型荧光变化。
准备9等份相同浓度的探针溶液，然后加入不同量的ATP，在相同的激发条件下测试荧光光谱（激发波长485nm），并计算每个荧光光谱中579nm和532nm处两个发射峰的荧光强度比。然后荧光强度比为纵坐标，ATP浓度为横坐标，作图，得ATP浓度-光比率线性图（图6），由图6的结果可以看出在579nm时，ATP浓度x和光比率y呈现线性关系，y=6.544x+0.2779，R2=0.9938；在532nm时，ATP浓度x和光比率y呈现线性关系，y=0.3027x+1.54，R2=0.9944。
准备22等份相同浓度的探针溶液，其中1份加入20μL空白溶剂，剩下的21份加入相同体积的不同底物，包括ATP、ADP、AMP、活性氧自由基、阳离子、阴离子和氨基酸等。在相同的激发条件下测试荧光光谱（激发波长485nm），并计算每个荧光光谱中579nm和532nm处两个发射峰的荧光强度比。然后荧光强度比为纵坐标，各种底物为横坐标，作柱状图，得探针对不同底物的选择性对比图（图7），由图7可以看出，该探针对磷酸腺苷表现出高特异选择性，对其它底物响应很弱。尤其是，该探针能够把ATP跟ADP和AMP明显区分开，对ATP表现出更高的特异性响应，这归因于探针结构中的三胺链与ATP之间更有利于形成氢键以及更强的离子相互作用。（其中两个波长对应的荧光强度作比，就是峰面积比或者峰高比）。
准备5组，每组11等份相同体积不同pH的缓冲盐溶液，使pH分别为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8。然后分别加入相同量的探针溶液，保持pH值不变。第一组不加ATP，其余4组加入不同量ATP固体，使其浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.4mM和0.5mM，且调节pH值保持不变。在相同的激发条件下分别测试5组样品的荧光光谱（激发波长485nm），并计算每个荧光光谱中579nm和532nm处两个发射峰的荧光强度比。然后荧光强度比为纵坐标，pH值为横坐标，作图，得探针在不同pH条件下对ATP 的响应对比图（图8），由图8可以看出，在不同的ATP浓度下，该探针都只在与溶酶体内环境相近的酸性pH条件下才会对ATP响应，而在细胞质pH≥6.5范围内几乎无响应，说明该探针可以用于特异性检测溶酶体内ATP。
探针分子在不同浓度ATP条件下的CD图如图9和图10所示。由图9可以看出，探针具有强的圆二色性，524nm附近表现出负的Cotton效应，352nm附近表现出正的Cotton效应，分别对应了探针中BODIPY结构单元的紫外可见吸收光谱峰。由图10可以看出，加入ATP后CD谱图变化不显著，这一趋势也与紫外可见吸收光谱表现相似。
探针分子在有无ATP下的CPL图如图11所示，可以看出，探针在530nm附近表现出一个强的正信号，对应BODIPY单元的荧光光谱信号。当加入ATP后，该信号明显减弱，同时在585nm附件出现了新的正向信号峰，这一变化趋势同荧光光谱一致，证明探针中的罗丹明结构单元被ATP激活开环，发生荧光共振能量转移，同时BODIPY结构单元中的手性也随着能量转移传递到了罗丹明结构单元。能量和手性的共同传递导致绿色CPL信号转化为红色信号，表现出CPL信号的比率型变化。
探针分子检测细胞内ATP图，如图12所示，其中图12中的（a）为Hela细胞与探针共染色5分钟时在绿光通道下的共聚焦荧光图像，图12中的（b）为Hela细胞与探针共染色5分钟时在红光通道下的共聚焦荧光图像，图12中的（c）为Hela细胞与探针共染色5分钟时绿红两个通道共聚焦荧光图像叠加，图12中的（d）为Hela细胞与探针共染色30分钟时在绿光通道下的共聚焦荧光图像，图12中的（e）为Hela细胞与探针共染色30分钟时在红光通道下的共聚焦荧光图像，图12中的（f）为Hela细胞与探针共染色30分钟时绿红两个通道共聚焦荧光图像叠加。可以看出细胞与探针共孵育5分钟内只可以看到强大的绿色荧光，几乎没有显示红色荧光，这说明从BODIPY结构单元到罗丹明结构单元的荧光共振能量转移过程还没有被ATP激活。随着时间的延长，红色荧光逐渐出现。然后，共染色的细胞分别在两个通道上显示绿色和红色荧光，说明罗丹明结构单元被ATP激活。这个结果表明，该探针可用于检测活细胞中的ATP。
Claims (10)
1.一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针，其特征在于，结构式如R-BPD-RB所示：
；
R-BPD-RB。
2.权利要求1所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，反应路线如下：
。
3.根据权利要求2所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①制备化合物1：在对羟基苯甲醛中加入过量1,2-二溴乙烷，然后加入碳酸钾，搅拌反应10~15小时，过滤，滤饼用乙醚洗涤后真空干燥，得到化合物1；
②制备化合物2：将步骤①所得化合物1和NaN3溶解于DMSO中，在95~105℃下搅拌反应5~7小时，向其中加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压浓缩后通过硅胶色谱柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=5:1作为淋洗剂，得到化合物2；
③制备化合物3：将步骤②所得化合物2和2,4-二甲基吡咯溶解于四氢呋喃中，滴加三氟乙酸，体系在氮气保护下室温反应至无化合物2剩余，向其中加入2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌，继续反应2~3小时，依次加入三乙胺和三氟化硼乙醚，在氮气保护下避光反应2~3小时，得到反应液1；
将所得反应液1加入二氯甲烷中，用去离子水水洗，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，减压浓缩通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物3；
④制备化合物4：将步骤③所得化合物3溶解于三氯甲烷中，加入CS2，搅拌5~10分钟后加入三苯基膦，反应10~15小时，将反应液减压蒸馏并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=8:1作为淋洗剂，得到化合物4；
⑤制备化合物5：将步骤④所得化合物4和三氯化铝溶解于无水二氯甲烷中，在氮气保护下35~45℃下反应5~6小时，得到反应液2，备用；
将联二萘酚溶解于无水乙腈中，滴加到反应液2中，滴加完毕，升温至45~55℃，避光反应10~15小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比正己烷：乙酸乙酯=4:1作为淋洗剂，得到化合物5；
⑥制备中间体RB-NH2：将罗丹明B和二乙烯三胺溶解于乙醇中，加热回流反应10~15小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=10:1作为淋洗剂，得到中间体RB-NH2；
⑦制备探针化合物R-BPD-RB：先将步骤⑥所得中间体RB-NH2溶解于乙腈，得到乙腈溶液，将化合物5溶解于二氯甲烷中加入乙腈溶液中，在20~35℃下反应3~4小时，减压浓缩并通过硅胶柱纯化，采用体积比二氯甲烷：乙醇=40:1作为淋洗剂，得到探针化合物R-BPD-RB。
4.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤中①中对羟基苯甲醛、1,2-二溴乙烷和碳酸钾的摩尔比为1：3~5：2~3。
5.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤②中，步骤①所得化合物1、NaN3、DMSO、水、乙酸乙酯的摩尔体积比为1mol：1.2~2mol：1.5~2L：1~1.5L：1~1.2L。
6.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤③中，步骤②所得化合物2、2,4-二甲基吡咯、四氢呋喃、三氟乙酸、2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌、三乙胺、三氟化硼乙醚、二氯甲烷和去离子水的摩尔体积比为1mol：1.5~2mol：10~12L：10~15ml：1~2mol：1~2L：1~2L：0.5~0.8L：0.5~1L。
7.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤④中，步骤③所得化合物3、三氯甲烷、CS2和三苯基膦的摩尔体积比为1mol：15~20L：1.5~2L：1~1.5mol。
8.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤⑤中，步骤④所得化合物4、三氯化铝、无水二氯甲烷和联二萘酚、无水乙腈的摩尔体积比为1mol：2~3mol：25~30L：1.2~2mol：0.5~1L。
9.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤⑥中，罗丹明B、二乙烯三胺和乙醇的摩尔体积比为1mol：25~28mol：12~15L。
10.根据权利要求3所述的一种检测三磷酸腺苷的圆偏振荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤⑦中，步骤⑥所得中间体RB-NH2、乙腈、化合物5、二氯甲烷的摩尔体积比为2~3mol：5~10L：1mol：5~8L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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