CN116999423A - 左旋丹参素及其酯在制备防治肝病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及左旋丹参素及其酯用于制备防治肝病药物的应用，属于医药技术领域。所公开的左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯具有显著的抗炎、抗氧化、降脂、保肝的作用。因此，左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯可应用于防治肝病，特别是肝硬化、肝纤维化、肝炎、脂肪肝或肝衰竭的药物，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯在制备防治肝病药物中的用途，特别是肝硬化、肝纤维化、肝炎、脂肪肝或肝衰竭的药物。
背景技术
丹参是临床常用药物，具有祛瘀止痛、凉血消炎痈、安神除烦等功效，在心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等疾病治疗中成效显著。在肝病治疗方面，丹参及其主要成分对四氯化碳、D-氨基半乳糖、醋氨酚、酒精等制备的肝损伤模型具有明显的保护作用。(中国中药杂志，2015，40(04)：588-593.；中国当代医药，2017，24(29)：4-6+10.；中西医结合学报，2004(02)：145-148.；江苏临床医学杂志，1997(05)：324-326.)。
丹参素(danshensu，DSS)又名D(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸或(R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸,是丹参水溶性活性成分之一,相对分子质量为198.17，分子式为C9H10O5。天然植物来源的丹参素均为右旋异构体。文献中，有关丹参素的合成、衍生物以及生物活性报道较多，如丹参素具有心脑血管疾病防治(心肌保护、脑保护、抗动脉粥样硬化、血栓形成)、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗肝脏纤维化、脏器损伤保护等(西北药学杂志,2011,26(04)：310-312；CN112516124A，山西医药杂志，2006(02)：108-110+186；中西医结合肝病杂志，1999(02):30-32.；中西医结合肝病杂志，1996(03):29-30+32-56.)。右旋丹参素异丙酯具有血管扩张、抗炎、抗氧化、抑制自由基所致的大鼠心律失常、保护心肌细胞、降脂、抗缺氧等生物活性(中国药理学通报,2023(08):1541-1547；中草药,2013,44(01):59-64.；中国中药杂志,2011,36(08):1094-1096.；心脏杂志,2011,23(01):27-30+34.中草药,2009,40(01):82-86.)。对于手性化合物，尤其是对映异构体间的生物活性往往有较大的不确定性。因此，随着潜在右旋丹参素系列药物的不断开发，其左旋异构体(L(-)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸或(S)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸或左旋丹参素)及其酯类衍生物也逐渐备受关注。
然而，现有技术中除左旋丹参素的化学与生物合成报道外，相关生物活性鲜有报道(CN104744242)，尤其左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯的毒性以及相应对映异构体间的药效学比较至今未有报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了一种左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物在制备防治肝病药物中的用途，特别是肝硬化、肝纤维化、肝炎、脂肪肝或肝衰竭的药物中的用途。
左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物结构通式(I)如下所示：
结构通式(I)中：
R选自氢、烷基、环烷基、杂烷基、杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基。
药学上可接受的盐包括：Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等。
发明人采用硫代乙酰胺诱导的斑马鱼肝损伤模型评价左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的保肝活性。结果表明：所述左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物与其部分相应右旋异构体以及阳性药比较，具有显著的保肝活性。
另一方面，本发明还分别采用斑马鱼抗炎模型和小鼠抗炎模型研究左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的抗炎活性。证明左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物具有显著的抗炎活性，从而可以用于治疗或预防肝炎。
另一方面，本发明还采用细胞模型研究左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的抗氧化活性。证明左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物具有显著的抗氧化活性，从而可以用于肝保护。
另一方面，本发明还采用细胞模型研究左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的降脂活性。证明左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物具有显著的降脂活性，从而可以用于治疗或预防脂肪肝。
基于上述研究结果完成了本发明。本发明的研究表明左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物至少通过抗炎、抗氧化、降脂实现肝脏保护作用，可单独或者作为有效成分应用于防治肝病的药物中，特别是肝硬化、肝纤维化、肝炎、脂肪肝或肝衰竭的药物中。
本发明中，左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物可以和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以和其他与左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物不发生拮抗作用的治疗药物组成复方制剂。这些制剂可以是药学上允许的任意一种类型，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射液、膜剂、胶囊、脂质体、纳米制剂等。
左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的用量为0.1-400μM，可以根据给药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型和严重程度变化，可以一次或者多次使用。
本发明的突出优点是对比左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯与(右旋)丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的肝脏保护活性，并进一步肯定左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯类衍生物的肝脏保护活性，其活性好，毒性低，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为左、右旋丹参素及其酯对T3(L-FABP:EGFP)系斑马鱼的毒性作用；
图2为左、右旋丹参素及其酯对斑马鱼肝脏的保护活性；(A)化合物对斑马鱼幼鱼相对肝面积的影响；(B)化合物对斑马鱼幼鱼肝脏相对荧光强度的影响；(C)代表性斑马鱼实验图片；
图3为左、右旋丹参素及其酯在斑马鱼模型上的抗炎作用；(A)数据统计图；(B)代表性斑马鱼实验图片；
图4为左、右旋丹参素及其酯在细胞层面的抗氧化作用；(A)不同浓度S-DSS对WRL68细胞活力的影响；(B)不同浓度R-DSS对WRL68细胞活力的影响；(C)不同浓度S-IDHP对WRL68细胞活力的影响。不同浓度化合物干预WRL68细胞24h后，CCK-8法检测细胞活力，**p<0.01vs Control，n＝6；(D)WRL68细胞内ROS的含量影响。**p<0.01vs Control，#p<0.05、##p<0.01vs PAOA，n＝3。
图5为左、右旋丹参素及其酯在人肝细胞WRL68上的降脂作用；(A)WRL68细胞内TG含量；(B)WRL68细胞内TC含量；*p<0.05、**p<0.01vs Control，#p<0.05、##p<0.01vs PAOA，n＝3。
具体实施方式
除非有特殊说明，本文中的科学与技术术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除非另有说明，本文中的术语根据本领域技术人员的常规认识理解。
本发明涉及的左、右旋丹参素及其酯在抗炎、抗氧化以及肝脏保护作用的浓度范围为0.1-400μM。
R-DSS：(R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸)或右旋丹参素；
R-DSS-Na：(R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸钠盐或右旋丹参素钠盐；
S-DSS：(S)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸或左旋丹参素；
S-DSS-Na：(S)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸钠盐或左旋丹参素钠盐；
R-IDHP：右旋丹参素异丙酯
S-IDHP：左旋丹参素异丙酯
R,S-IDHP：左、右旋丹参素异丙酯或混旋丹参素异丙酯(R,S-IDHP给药组中R-IDHP与S-IDHP含量关系是：1:1)
以下实施例所用药物均为市售产品。
实施例1：左旋丹参素及其酯对斑马鱼的毒性作用研究
1.实验方法：
挑选发育良好的3dpf T3(L-FABP:EGFP)系斑马鱼，斑马鱼在无菌24孔板中培养，对待测化合物(R-DSS、R-DSS-Na、S-DSS、S-DSS-Na、R-IDHP、S-IDHP)进行耐受性评价，给药浓度分别是50、100、250、500、1000、1500、2000、2500、5000、8000μmol/L(溶剂为水)；各孔溶液体系终体积为2mL，待加药完毕后，将15条幼鱼加入至相对应的孔中，加盖并标记；
加药完毕后将培养板放置于光照培养箱中，每隔4h观察一次，记录死亡数量并移除死亡幼鱼，统计于给药24h后终止，实验重复三次。LC50在1000μmol/L以上属于低毒物质。
2.实验结果：
由图1可知，R-DSS：LC50>5000μmol/L；R-DSS-Na：LC50>5000μmol/L；S-DSS：LC50>5000μmol/L；S-DSS-Na：LC50>5000μmol/L；R-IDHP：LC50＝1220μmol/L；S-IDHP：LC50＝1468μmol/L。因此，R-DSS及其钠盐，S-DSS及其钠盐，R-IDHP与S-IDHP属于低毒性化合物，在1000μmol/L以下对斑马鱼模式动物无毒性。
实施例2：左旋丹参素及其酯对斑马鱼肝脏的保护活性研究
1.原理：
硫代乙酰胺(TAA)可上调脂肪肝相关基因fabp、lepr及rbp4，以及肝纤维化相关基因TGF-β1TGF-βr2的表达水平，表达诱导肝脏的脂肪变性和纤维化。同时TAA可作用于细胞色素-450酶，使其形成活性氧，活性氧可通过消耗ATP和NADP，损伤DNA和蛋白质及损耗谷胱甘肽从而诱发氧化应激和细胞死亡，最终脂质过氧化产物导致肝脏的纤维变形。
2.实验方法：
采用3dpf的发育良好的转基因T3(L-FABP:EGFP)系斑马鱼，在收集受精卵的6h后按照30μL/mL的比例加入PTU(1mg/mL)；使用无菌24孔板，实验设置正常对照组、模型组(硫代乙酰胺)、阳性组(水飞蓟宾，silymarin)及不同浓度(25、50、100μmol/L)的R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP、R,S-IDHP给药组，每组3个重复孔，每孔10条斑马鱼；其中正常对照组未摄入硫代乙酰胺造模，模型组、阳性组及给药组均摄入等量的硫代乙酰胺(7mM，溶剂为水)，每孔加入60μL PTU，最终各孔溶液体系终体积为2mL，连续给药三天至6dpf。
每天进行换药处理，加盖标记并转移至光照培养箱中，培养箱温度控制在28.5℃±0.5℃，于6dpf使用荧光显微镜对每条鱼进行观察，采集图像，为了让统计结果更加准确，幼鱼需保证在两眼重合状态下采集图像，使用三卡因对其麻醉；使用软件IPP 5.1对图像中的斑马鱼的肝脏大小及肝脏荧光强度进行统计，实验重复三次。
3.实验结果
由图2可知，R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP、R,S-IDHP均可以提高硫代乙酰胺造成的肝脏面积缩小，并且S-DSS和S-IDHP显著增强斑马鱼肝脏荧光强度。说明R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP、R,S-IDHP均具有较好的肝保护作用。
实施例3：左旋丹参素及其酯在斑马鱼模型上的抗炎活性研究
采用硫酸铜诱导的炎症模型评价化合物的抗炎活性。
1.原理：
炎症是免疫系统对组织损伤和感染的一种反应，主要特点就是白细胞(粒细胞、巨噬细胞)会聚集在感染组织周围，斑马鱼的免疫系统非常类似于哺乳动物。创伤发生时，中性粒细胞、巨噬细胞对创伤性炎症几乎同时作出应答，中性粒细胞迁移速度快，先募集到损伤部位，随后巨噬细胞才到达；数小时后，炎症开始消退，巨噬细胞和中性粒细胞离开损伤部位。硫酸铜损伤斑马鱼神经丘(斑马鱼体表侧线器的末稍器官)，造成神经丘细胞死亡，斑鱼的中性粒细胞发生免疫应答，聚集在神经丘周围，吞噬死亡的细胞。
2.实验方法：
实验采用3dpf的发育良好的Tg(Lyz：EGFP)转基因品系斑马鱼，在收集受精卵的6h后按照30μL/mL的比例加入PTU(1mg/mL)；使用无菌24孔板，实验设置正常对照组、模型组、阳性组(白藜芦醇(res)和吲哚美辛(Indomethacin))及不同浓度(25、50、100、150μmol/L)的R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP、R,S-IDHP给药组，每组3个重复孔，每孔10条斑马鱼；其中正常对照组与模型组不加药，阳性组及待测化合物给药组用各剂量化合物与斑马鱼共孵育3h后，除对照组外，其余各组用20μmol/L硫酸铜处理1h制备炎症模型。随后使用荧光显微镜对每条鱼进行观察，采集图像。为了让统计结果更加准确，幼鱼需保证在两眼重合状态下采集图像，使用三卡因对其麻醉；使用软件IPP 5.1计算躯干部荧光炎症粒细胞迁移个数，实验重复三次。
3.实验结果：
由图3可知，R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP、R,S-IDHP均有显著的抗炎活性。在较高浓度(100μmol以上)下，R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP、R,S-IDHP均较阳性药白藜芦醇与吲哚美辛抗炎活性好，其中，S-DSS和S-IDHP有显著的抗炎活性。
实施例4：左旋丹参素及其酯在小鼠耳肿胀模型上的抗炎作用研究
1.材料与方法
1.1实验动物
昆明系小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，雄性，购于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(豫)2020-0005。实验前在本实验室适应性饲养3d，室温20～24℃。
1.2实验药品与仪器
二甲苯溶液(批号：20230414，国药集团化学试剂有限公司)；吲哚美辛(批号：I26251LL31，天津希恩思生化科技有限公司)；电子分析天平(XS105DU，梅特勒-托利多科技有限公司)，打孔器、手术剪、移液枪、灌胃针。
1.3实验方法
1.3.1实验动物的选择与分组
KM雄性小鼠140只，(20±2)g，适应性喂养3天，随机分成14组，每组10只；实验药物分低、中、高剂量组进行试验；模型组灌胃等体积的生理盐水作空白对照，吲哚美辛作阳性对照药物。实验分组及给药剂量见表1。
表1实验分组及给药剂量
1.3.2化合物对小鼠耳肿胀的影响
1.3.2.1给予抗炎药物
分组后的实验动物适应性喂养3天后，每日灌胃给药1次，每次灌胃体积为10mL/kg即0.1mL/10g，连续给药4天；模型组灌胃等体积的生理盐水作空白对照。
1.3.2.2建立小鼠耳廓肿胀急性炎症模型
末次给药(第4天)30min后，在小鼠右耳正反两表面用移液枪各滴加20μL二甲苯，均匀涂抹。左耳不做任何处理，作平行对照。
1.3.2.3取耳片计算肿胀度
造模1h后，将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基部剪下两耳，对齐后用直径6毫米的打孔器在左右耳的同一部位打下圆形耳片。
用电子天平称重，以左右两耳片重量之差衡量肿胀程度，以肿胀率和抑制率衡量抗炎作用强度。
肿胀度(mg)＝右耳片重(肿胀耳)-左耳片重(对照耳)。
肿胀率(％)＝肿胀度/左耳片重(对照耳)×100％
肿胀抑制率(％)＝(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100％。
1.3.3统计方法
各组实验数据结果以(x±s)表示，采用SPSS20.0软件对数据进行方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
表2实验组和对照组小鼠耳廓肿胀度
由表2可以得出，在小鼠耳廓肿胀抗炎实验中，R-DSS、S-DSS、R-IDHP、S-IDHP与空白对照比均有显著的抗炎活性。S-DSS和S-IDHP有显著的抗炎活性。
实施例5：左旋丹参素及其酯在细胞模型上的抗氧化活性研究
1.材料与方法
1.1实验细胞
该实施例实验中使用的细胞为人肝细胞WRL68，购于上海富衡生物科技有限公司；WRL68细胞使用DMEM培养液，培养液中含有10％ FBS和1％青霉素、链霉素混合物，于37℃5％ CO2条件下培养。
1.2实验药品与仪器
S-DSS、R-DSS、S-IDHP和R-IDHP，DMEM培养基和胰蛋白酶-EDTA(0.25％)及PBS购自美国HyClone公司；细胞培养用胎牛血清FBS购自澳洲Noverse公司；棕榈酸(palmiticacid,PA)、油酸(oleic acid,OA)、牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司，TG、TC测定试剂盒购自南京建成生物公司。二氧化碳培养箱(Thermofisher,BB150)；倒置显微镜(Olympus，CKX53)；流式细胞仪；酶标仪(Thermo Fisher，MK3)
1.3实验分组
正常培养的细胞为对照组(Control)；PAOA诱导的细胞为实验组(PAOA)；PAOA诱导细胞脂肪化后，分别加入不同药物为干预组(S-DSS、R-DSS、S-IDHP和R-IDHP)。
1.4实验方法
1.4.1CCK-8法检测PAOA及各种化合物对细胞活力的影响
各细胞以5 000个每孔的密度接种至96孔板培养24h，分别加入不同浓度的PAOA(PA、OA以摩尔比1：2配制)或不同浓度的S-DSS、R-DSS、S-IDHP和R-IDHP(由PBS配制)，每组6个复孔，培养24h后每孔加入100μL的CCK8工作液，培养箱内孵育1h，设定酶标仪于450nm处测定各孔的吸光度值并计算细胞存活率。
1.4.2细胞内ROS水平检测
收集经处理的细胞，加入ROS工作液，37℃避光孵育30min后，离心弃去染色液并加入PBS洗涤细胞，于Ex/Em＝488nm/525nm下使用流式细胞仪检测。
1.4.3数据统计分析
使用GraphPad prism 9.3.1软件进行数据处理及绘图,计量资料采用均数±标准误表示,组间差异比较采用单因素方差分析。
2.结果
2.1化合物浓度筛选
检测不同浓度化合物干预下的细胞存活率，由图4(A、B、C)可知，S-DSS、R-DSS、S-IDHP在100μmol·L-1及以下浓度时细胞活力无明显降低，结合前期研究发现R-IDHP在100μmol·L-1对细胞无明显毒性，因此后续实验选用100μmol·L-1的浓度作为干预脂肪化细胞的最适浓度。
2.2细胞内ROS含量
通过流式细胞术检测人肝细胞WRL68内ROS的含量(图4D)，结果发现，PAOA诱导后ROS荧光强度显著增强，而经S-DSS、R-DSS、S-IDHP和R-IDHP干预后，ROS水平显著降低，说明四种化合物可抑制脂肪化细胞内ROS的产生，具有显著的抗氧化性；其中，S-DSS与S-IDHP有显著的抗氧化作用。
实施例6：左旋丹参素及其酯在人肝细胞WRL68上的降脂活性研究
实验材料与方法同实施例5。
1.细胞内TG(甘油三酯)、TC(总胆固醇)含量检测
收集经处理的细胞，加入200μL 2％TritonX-100裂解液，裂解35分钟后按下表3加入试剂。
表3样品配制
上述表中的标准品为TG、TC测定试剂盒内的商品化产品，样本为细胞样品)、工作液为TG、TC测定试剂盒内的商品化产品。
孔内液体震荡混匀，37℃孵育10分钟，使用酶标仪测定各孔吸光度(TG测定波长为546nm，TC测定波长为510nm)并计算TG、TC含量。
2.实验结果
结果如图5所示，细胞经PAOA诱导后，与正常组相比，细胞内TG、TC的含量显著增加；药物浓度：100μmol·L-1。
经不同化合物干预后，S-DSS的对细胞内TG的累积并无明显效果，R-DSS、S-IDHP和R-IDHP显著降低了TG的含量；同时S-DSS和R-IDHP可以显著抑制细胞内TC的累积，R-DSS和S-IDHP可以降低TC的含量，但无明显差异。说明四种化合物对TG、TC的累积具有抑制作用，同时也说明S-DSS、R-DSS、S-IDHP和R-IDHP具有降脂的作用；S-DSS与S-IDHP降脂效果显著。
Claims (4)
1.左旋丹参素、其药学上可接受的盐以及其酯用于制备保肝药物或预防和治疗肝病药物的应用，
所述左旋丹参素结构式如(I)所示，且R选自氢；
所述左旋丹参素酯的结构式如(I)所示，且R选自烷基、环烷基、杂烷基、杂环基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为Na+、K+、Mg2+、Zn2 +、Ca2+、Cu2+或Fe2+盐。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肝病包括肝硬化、肝纤维化、肝炎、脂肪肝或/和肝衰竭。
4.根据权利要求1-3所述应用，其特征在于，左旋丹参素及其药学上可接受的盐以及其酯的浓度为0.1-400μM。
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