CN108888623A - 酪氨酸蛋白激酶jak2抑制剂bx795的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酪氨酸蛋白激酶JAK2抑制剂BX795的应用，涉及生物技术领域，BX795对酪氨酸蛋白激酶JAK2的酶活性有强烈的抑制作用，BX795对JAK2参与的炎症信号传导通路具有下调作用，并且，对JAK2参与的炎症信号传导通路的下游转录因子同样具有下调作用。此外，还可以明显缓解小鼠结肠炎症状，减轻炎症反应。这一发现，对于丰富和完善炎症分子及细胞生物学研究具有重要的理论意义，将BX795应用在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中，能够有效抑制结肠炎症，从而大大提高结肠炎的治疗效果，为临床实验提供依据，同时为结肠炎等炎症疾病的预防、治疗开辟一个新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种酪氨酸蛋白激酶JAK2抑制剂BX795的应用。
背景技术
结肠炎是一种遗传因素，环境因素和免疫因素共同参与的肠道非特异性炎症性疾病。病变主要位于结肠的黏膜区，以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，也可遍及整个结肠。其病因学和发病机制目前尚不清楚，治疗进展缓慢且缺乏特异性，其发病率在我国有逐年上升的趋势，被世界卫生组织列为现代难治病之一。因此，对结肠炎等炎症疾病进行基础和临床研究意义非常重大，研究成果有助于人类更好地认识炎症和其他重大疾病的发生发展机理，从而为预防和治疗这些疾病提供理论和临床依据。
Janus激酶(Janus kinase,JAK)是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，不同类型的JAK异型体合称为JAKs家族。JAK2作为JAK家族的一员，其结构与JAK家族的其他成员具有高度的同源性。JAK2广泛分布于体细胞的胞质中，它参与造血和免疫等系统的信号传导，对红细胞的生成及免疫细胞的活化也有重要作用。JAK2活性异常性升高会导致各种疾病的发生，例如急性呼吸窘迫综合征、脂肪肝、尿毒症等等都已被证明与JAK2/STATs 通路有着密切的联系。所以，JAK2活性的控制对于相关疾病的治疗具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供BX795作为酪氨酸蛋白激酶JAK2抑制剂中的应用，以缓解现有技术中存在的对JAK2活性的控制尚有不足的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供BX795在制备抑制酪氨酸蛋白激酶 JAK2酶活性的产品中的应用。
本发明的第三个目的在于提供BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶 JAK2酶参与的传导通路的产品中的应用。
本发明的第四个目的在于提供BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶 JAK2酶参与的炎症反应的产品中的应用。
本发明的第五个目的在于提供BX795在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
本发明的第六个目的在于提供一种预防和/或治疗结肠炎的药物，该药物能够有效缓解结肠炎症状，减轻炎症反应，
本发明提供了BX795作为酪氨酸蛋白激酶JAK2抑制剂中的应用，所述BX795的化学结构式如式I所示：
本发明还提供了BX795在制备抑制酪氨酸蛋白激酶JAK2酶活性的产品中的应用。
本发明还提供了BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2参与的传导通路的产品中的应用；
所述传导通路包括TAK1-MKK信号通路或TBK1-AKT信号通路。
本发明还提供了BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2酶参与的炎症反应的产品中的应用。
本发明还提供了BX795在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
另外，本发明还提供了一种预防和/或治疗结肠炎的药物，所述药物包括BX795或BX795的类似物。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂；
优选地，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂；
优选地，所述注射制剂包括注射液或粉针剂。
进一步地，所述药物的有效给药剂量为1-20mg/kg/天，优选为3-15 mg/kg/天。
进一步地，所述结肠炎包括溃疡性结肠炎、伪膜性结肠炎、乙状结肠炎或缺血性结肠炎中的一种或多种。
本发明的发明人通过研究发现，BX795对酪氨酸蛋白激酶JAK2的酶活性有强烈的抑制作用，BX795对JAK2参与的炎症信号传导通路具有下调作用，并且，对JAK2参与的炎症信号传导通路的下游转录因子同样具有下调作用。此外，还可以明显缓解小鼠结肠炎症状，减轻炎症反应。本发明提供的抑制剂BX795的对酪氨酸蛋白激酶JAK2活性具有显著抑制效果，可以缓解结肠炎症状这一发现，对于丰富和完善炎症分子及细胞生物学研究具有重要的理论意义，将BX795应用在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中，能够有效抑制结肠炎症，从而大大提高结肠炎的治疗效果，为临床实验提供依据，同时为结肠炎等炎症疾病的预防、治疗开辟一个新的方向。
本发明提供的用于预防和/或治疗结肠炎的药物，该药物的活性成分为 BX795，因此，能够有效抑制结肠炎症，对结肠炎起到明显的预防和/或治疗作用，同时安全无毒，副作用小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的不同浓度的BX795对细胞的产生的毒性情况的结果图；
图2为本发明实施例2提供的BX795对JAK2激酶活性的抑制情况的结果图；
图3为本发明实施例3提供的BX795对TBK1-AKT信号通路的调控情况的结果图；
图4为本发明实施例4提供的BX795对TAK1-MKK信号通路的调控情况的结果图；
图5为本发明实施例5提供的BX795对MAPKs基因表达的调控情况的结果图；
图6A为本发明实施例6提供的BX795对炎症细胞内LPS诱导产生的一氧化氮产量的调控情况的结果图；
图6B为本发明实施例6提供的BX795对炎症细胞内LPS诱导产生的肿瘤坏死因子产量的调控情况的结果图；
图6C为本发明实施例6提供的BX795对炎症细胞内LPS诱导产生的前列腺素E2产量的调控情况的结果图；
图7为本发明实施例7提供的BX795对炎症细胞内LPS诱导产生的炎症相关基因表达的调控情况的结果图；
图8为本发明实施例8提供的BX795对细胞核内转录因子表达的调控情况的结果图；
图9A为本发明实施例9提供的利用体外激酶测试检测BX795对JAK2 活性的调控情况结果图；
图9B为本发明实施例9提供的利用蛋白芯片检测BX795对JAK2活性的调控情况结果图；
图10A为本发明实施例10提供的BX795对DSS诱导的小鼠结肠炎的缓解情况的结果图；
图10B为本发明实施例10提供的BX795对DSS诱导的小鼠结肠炎的缓解情况的结果量化图；
图10C为本发明实施例10提供的BX795发挥抗结肠炎的调控分子机制情况的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了BX795作为酪氨酸蛋白激酶JAK2抑制剂中的应用，其中，所述BX795的化学结构式如式I所示：
BX795的分子式为：C23H26IN7O2S·xHCl。
BX795是一种小分子抑制剂，目前为止，其对JAK2有着很好的抑制作用。同时，鉴于其对JAK2激酶自身活性的抑制、在细胞内部的发生及在动物体内的临床模拟实验结果证明，将BX795开发成为具有临床应用价值的治疗剂是非常可行且有前景的。
需要注意的是，本发明所述的BX795，既可以为实验室制备得到的，也可以是市售直接购得的，只要满足式(Ⅰ)的化学结构式即可。
本发明还提供了BX795在制备抑制酪氨酸蛋白激酶JAK2酶活性的产品中的应用。
其中，产品例如可以为，但不限于药物、试剂或试剂盒。
本发明还提供了BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2参与的传导通路的产品中的应用。
传导通路包括TAK1-MKK信号通路或TBK1-AKT信号通路。
其中，产品例如可以为，但不限于药物、试剂或试剂盒。
本发明还提供了BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2酶参与的炎症反应的产品中的应用。
典型的炎症反应可以为：结肠炎、胰腺炎、关节炎、神经炎症、胃粘膜炎症或根尖周炎。
此外，本发明还包括BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2酶参与的免疫系统疾病、癌症等其他疾病的产品中的应用。
其他疾病例如可以为：脓毒症、真菌性角膜溃疡、系统性红斑狼疮、结直肠癌、白血病、骨髓增生性疾病、心肌缺血、肝纤维化、急性肝损伤等。
本发明还提供了BX795在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
本发明的发明人通过研究发现，BX795对酪氨酸蛋白激酶JAK2的酶活性有强烈的抑制作用，BX795对JAK2参与的炎症信号传导通路具有下调作用，并且，对JAK2参与的炎症信号传导通路的下游转录因子同样具有下调作用。此外，还可以明显缓解小鼠结肠炎症状，减轻炎症反应。本发明提供的抑制剂BX795的对酪氨酸蛋白激酶JAK2活性具有显著抑制效果，可以缓解结肠炎症状这一发现，对于丰富和完善炎症分子及细胞生物学研究具有重要的理论意义，将BX795应用在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中，能够有效抑制结肠炎症，从而大大提高结肠炎的治疗效果，为临床实验提供依据，同时为结肠炎等炎症疾病的预防、治疗开辟一个新的方向。
另外，本发明还提供了一种预防和/或治疗结肠炎的药物，包括BX795 或BX795的类似物。
其中，BX795的化学结构式如式I所示，BX795的类似物含有与式I 所示的结构有90％以上类似的分子结构。
本发明提供的用于预防和/或治疗结肠炎的药物，该药物的活性成分为 BX795，因此，能够有效抑制结肠炎症，对结肠炎起到明显的预防和/或治疗作用，同时安全无毒，副作用小。
在一些优选的实施方式中，药物还包括药学上可接受的辅料。
药学上可接受的辅料是指生产药品和调配处方时，使用的的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋型、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。
典型但非限制性的药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
当口服用药时，上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。
任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂。
其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
在一些优选的实施方式中，药物的有效给药剂量为1-20mg/kg/天，例如可以为，但不限于1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天、8mg/kg/天、10 mg/kg/天、12mg/kg/天、15mg/kg/天、18mg/kg/天或20mg/kg/天。
在一个优选的实施方式中，给药频率例如可以为，但不限于每天两次、每天一次、每两天一次、每周一次或每月一次给药。或者，可以以缓释制剂的形式给予本发明提供的药物，在这种情况下，需要较少的给药频率。
给药剂量和频率根据制剂在用药者体内的半衰期而不同，此外，也可以根据是预防性处理还是治疗性处理而不同。在预防性应用中，以相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直至疾病的进展被延缓或停止，并优选地直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善，在此之后，可以给予患者预防方案。
优选为3-15mg/kg/天。
当给药的有效剂量在优选范围内时，对结肠炎的预防和/或治疗作用更明显，见效更快。
在一些优选的实施方式中，结肠炎包括溃疡性结肠炎、伪膜性结肠炎、乙状结肠炎和缺血性结肠炎。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。
如无特别说明，以下各实施例中使用的实验动物小鼠，品种为C57BL/6 小鼠；提取总RNA使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，逆转录反应使用逆转录试剂盒(Takara公司)，实时荧光定量PCR技术检测转录因子等的表达水平的方法参见Chen，C.，等.Real-timequantification of microRNAs bystem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res 33，e179，2005。
如无特别说明，以下各实施例中的BX795的分子结构式如式I所示，来源于美国抑制剂公司Selleckchem的官方网站；细胞株为巨噬细胞 RAW264.7，来源于中科院上海细胞生物所。
实施例1 不同浓度的BX795对细胞产生的毒性情况
分别用含10％FBS的RPMI1640培养液预孵育4组RAW264.7细胞，细胞密度为1×106细胞/mL。孵育18小时后，分别将不同剂量的化合物 BX795加入3组细胞悬液中，使其中三组的细胞悬液中BX795的终浓度为 1.25μM、2.5μM和5μM，其余1组为对照组，不加入BX795。孵育24小时，然后加入10μL MTT溶液(10mg/mL in PBS，pH 7.4)，继续孵育细胞 3小时。3小时候后孵化停止。在每个孔中加入15％的十二烷基硫酸钠以溶解结晶紫沉淀，570～630nm(OD570-630)的吸光度检测吸光值，使用 Biotech PrimaMax 250微板阅读器测量，测试化合物的细胞毒性效应。
结果如图1所示，从图1中可以看出，与不加BX795的对照组相比， BX795的终浓度为1.25μM、2.5μM和5μM对细胞的毒性作用均不明显，不会引起细胞大量死亡。说明一定剂量的BX795安全无毒，副作用小。
实施例2 BX795对JAK2激酶活性的抑制情况
检测BX795对纯化蛋白JAK2的影响，采用Millipore(Billerica MA) 公司的激酶检测服务。用蛋白免疫印迹法检测BX795对JAK2激酶的作用，具体为：
将RAW264.7细胞(5×106细胞/mL)分为9组，其中1组为空白对照组，不做处理。另外8组平均分为BX795处理组和非BX795处理组。其中， BX795处理组使用5μM BX795处理RAW264.7细胞。30分钟后，分别梯度时间将BX795处理组和非BX795处理组进行处理LPS(1μg/mL)2分钟、5分钟、15分钟和30分钟，去上清，冷PBS洗2次，裂解液冰上处理 30分钟，离心，提取蛋白，取30μg蛋白进行SDS-PAGE分离，电转膜至 PVDF上，经封闭后依次加入JAK2和P-JAK2(购自Cell Signaling公司) 抗体，辣根过氧化物酶标二抗，最后经ECL系统显色，图像分析。
结果如图2所示，从图2中可以看出LPS可以持续诱导活性JAK2的表达，且BX795处理后能够在不同时间段全部明显抑制磷酸化的JAK2活性。说明BX795可以显著抑制JAK2激酶的活性。
实施例3 BX795对TBK1-AKT信号通路的调控情况
将RAW264.7细胞(5×106细胞/mL)分为7组，其中1组为空白对照组，不做处理。另外6组平均分为BX795处理组和非BX795处理组。其中， BX795处理组使用5μM BX795处理RAW264.7细胞。30分钟后，分别梯度时间将BX795处理组和非BX795处理组进行处理LPS(1μg/mL)，处理时间分别为2分钟、5分钟和15分钟，去上清，用冷PBS洗三次，加入300 μL裂解缓冲液裂解20分钟(20mM Tris-HCl,pH 7.4；2mM EDTA,2mM EGTA,50mM b-glycerophosphate,1mM sodium orthovanadate,1mM dithiothreitol,1％Triton X-100,10％glycerol,10mg/mL10ug/mL aprotinin,10 ug/mL pepstatin,1mM benzimide and2mM hydrogen peroxide)。在4℃下离心10分钟，收集上清蛋白，储存在-20℃，直到使用。细胞裂解物用免疫印迹法进行分析。蛋白质是10％SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离，PVDF转膜后，在室温下，用TRIS缓冲盐水孕育60分钟(3％BSA,20mM NaF,2mM EDTA and 0.2％Tween20)。特异性一级抗体(TBK1,p-TBK1,AKT,p-AKT)在4℃条件下将膜孵育60分钟，使用相同缓冲液洗涤3次，每次10分钟。辣根过氧化物酶二抗在4℃条件下将膜孵育60分钟，缓冲液洗涤3次。ECL系统检测。
结果如图3所示，从图中可以看出LPS可以持续诱导活性TBK1和AKT 的表达，且BX795处理后能够在5分钟和15分钟明显抑制磷酸化的TBK1 和AKT活性，说明BX795可以调控TBK1-AKT信号通路发挥作用。
实施例4 BX795对TAK1-MKK信号通路的调控情况
检测方法同本发明实施例3，其中，特异性一级抗体为MKK4/7， P-MKK4/7，MKK3/6，P-MKK3/6，TAK1，P-TAK1和β-actin。
结果如图4所示，从图中可以看出LPS可以持续诱导活性TAK1和 MKKs的表达，且BX795处理后能够在5分钟和15分钟明显抑制磷酸化的 MKK3/6和MKK4/7的活性，说明BX795可以调控MKKs信号通路发挥作用。
实施例5 BX795对MAPKs基因表达的调控情况
检测方法同本发明实施例3，其中，特异性一级抗体为ERK，P-ERK， P38，P-P38，JNK，P-JNK和β-actin。
结果如图5所示，从图中可以看出LPS可以持续诱导活性MAPKs的表达，且BX795处理后能够明显抑制磷酸化的MAPKs的活性，尤其是 p-JNK的活性，说明BX795可以通过调控MAPKs，尤其是JNK信号通路发挥作用。
实施例6 BX795对炎症细胞因子的影响
本实施例检测BX795对炎症细胞内LPS诱导产生的一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-a)和前列腺素(PGE2)产量的调控情况。分别用含 10％FBS的RPMI1640培养液预孵育4组RAW264.7细胞，至细胞密度为1 ×106细胞/mL。然后，分别将不同剂量的化合物BX795加入3组细胞悬液中，使其中三组的细胞悬液中BX795的终浓度为1.25μM、2.5μM和5μM，其余1组为对照组，不加入BX795。处理30分钟后，再加入脂多糖(LPS 1 μg/mL)处理24小时。
其中，NO的检测具体为：
采用Griess试剂法，取处理后的细胞上清与griess试剂反应，经酶联仪读数，分析。
结果如图6A所示，从图中可以看出BX795可以明显抑制NO的表达，说明BX795能够通过抑制NO的表达从而达到抗炎的治疗效果。
PGE2，TNF-a的检测具体为：
使用R&D systems公司的ELISA试剂盒，按说明书操作，经酶联仪读数，分析。
结果如图6B和6C所示，从图中可以看出BX795可以明显抑制TNF-a 和PGE2的表达，说明BX795能够通过抑制TNF-a和PGE2的表达从而达到抗炎的治疗效果。
实施例7 BX795对炎症细胞内LPS诱导产生的炎症相关基因表达的调控情况
检测BX795对炎症相关基因表达的调控作用，具体为：
分别用含10％FBS的RPMI1640培养液预孵育3组RAW264.7细胞，至细胞密度为1×106细胞/mL。然后，分别将不同剂量的化合物BX795加入2组细胞悬液中，使其中三组的细胞悬液中BX795的终浓度为2.5μM和 5μM，其余1组为对照组，不加入BX795。BX795处理RAW264.7细胞1 小时后，LPS(1μg/mL)处理5小时，之后收集细胞总RNA，采用实时定量PCR检测炎症因子基因转录水平。
结果如图7所示，从图7中可以看出，与不加BX795的对照组相比， BX795处理后的细胞中与炎症相关的各细胞因子和炎症介质的表达量均有所下降，说明BX795可以下调LPS诱导的众多细胞因子和炎症介质的表达水平。
实施例8 BX795对细胞核内转录因子表达的调控情况
将RAW264.7细胞(5×106细胞/mL)分为9组，其中1组为空白对照组，不做处理。另外8组平均分为BX795处理组和非BX795处理组。其中， BX795处理组使用5μM BX795处理RAW264.7细胞。30分钟后，梯度时间将BX795处理组和非BX795处理组进行处理LPS(1μg/mL)，处理时间分别为15分钟、30分钟、60分钟和120分钟。
核裂解物是在三步程序中制备的。第一步，BX795和LPS处理后，收集细胞，预冷的1mL PBS洗涤，并在500μL裂解缓冲液中溶解(50mM KCl, 0.5％Nonidet P-40,25mM HEPES(pH 7.8),1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,10mg/mL leupeptin,20mg/mLaprotinin,and 100mM 1,4-dithiothreitol(DTT))在冰上4分钟，然后将细胞裂解物在19326×g转速下离心1分钟。第二步，细胞核沉淀在洗涤缓冲液中洗涤一次(与裂解缓冲液相同，但没有NIDIDE-P40)。最后一步，用提取缓冲液(lysis buffer containing 500mMKCl and 10％glycerol)处理细胞核。核提取缓冲混合物在负80℃冷冻，然后在冰上融化。离心19326×g，5分钟，收集上清液，作为核提取物。可溶性细胞裂解物进行后续的免疫印迹蛋白电泳，抗体分别为从CST公司采购的c-jun(CST#9165)，c-fos(CST#4384)，p65 (CST#8242)，p-IRF3(CST#29047)和p-ATF2(CST#9221)。
结果如图8所示，从图中可以看出LPS可以持续诱导活性MAPKs的表达，且BX795处理后能够明显抑制磷酸化的MAPKs的活性，尤其是 p-JNK的活性，说明BX795可以通过调控MAPKs，尤其是JNK信号通路发挥作用。
实施例9 BX795对JAK2激酶的直接抑制情况
纯化的蛋白激酶JAK2、JAK3和TAK1分别与反应液混合，加入MgATP (10mM)，样品组分别加入BX795(5μM)，对照组加入DMSO，室温下反应40分钟，加入5mL终止液，3％的磷酸缓冲液。吸取10mL反应液点加到P30Filtermat上，用75mM的磷酸缓冲液洗涤3次，最后用甲醇冲洗一次，干燥，用闪烁法测量放射性强度。
蛋白芯片检测BX795对JAK2活性的影响，纯化收集JAK2的底物，将其点加在芯片上，Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记激酶 JAK2，洗去多余的标记分子，与芯片杂交孵育，样品组分别加入不同浓度的药物BX795(0-100uM)，温育30分钟，共聚焦荧光扫描仪在特定的波长下激发荧光，获得反应结合信号，扫描分析结果。
结果如图9A和9B所示，从图中可以看出BX795可以在体外明显的抑制JAK2的活性，在5uM作用下可以抑制其活性在1％以下，同时对JAK3 和TAK1都有明显抑制效果，说明PP2是JAK2的高效抑制剂。
实施例10 BX795对DSS诱导的小鼠结肠炎的缓解情况
采用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)刺激法。小鼠对DSS 致溃疡性结肠炎比较敏感，且病灶部位与人类相似(乙状结肠和直肠)，因此可以作为实验研究理想动物。
将小鼠分为3组，2组为对照组，每组7只，用3％的DSS连续自由饮用7天，同时从第一天起，每天每只小鼠使用BX795灌胃，终浓度为5mg/kg，每天2次，连续7天。观察并记录体重的变化。在第8天，处死小鼠，解剖，取出结肠和直肠，PBS清洗干净，观察长度和生理变化。
此外，随机选取各组结肠0.1g，提取蛋白质，western blot检测BX795 发挥调控作用的分子机制。
结果如图10A、10B和10C所示，从图10A和图10B中可以看出3％的DSS可以明显诱导小鼠结肠炎的发生，同时小鼠口服不同浓度的BX795 (10mg/kg和20mg/kg)可以明显抑制结肠炎的发生，说明BX795是一种具有明显治疗效果的抗溃疡性结肠炎药物；从图10C中可以看出，BX795 通过调控活性的TBK1和JAK2信号通路从而达到抗结肠炎的作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.BX795作为酪氨酸蛋白激酶JAK2抑制剂中的应用，所述BX795的化学结构式如式I所示：
2.BX795在制备抑制酪氨酸蛋白激酶JAK2酶活性的产品中的应用。
3.BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2参与的传导通路的产品中的应用；
所述传导通路包括TAK1-AP1信号通路或TBK1-AKT-NK-KB信号通路。
4.BX795在制备抑制由酪氨酸蛋白激酶JAK2酶参与的炎症反应的产品中的应用。
5.BX795在制备预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。
6.一种预防和/或治疗结肠炎的药物，其特征在于，所述药物包括BX795或BX795的类似物。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂；
优选地，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂；
优选地，所述注射制剂包括注射液或粉针剂。
9.根据权利要求6-8任一项所述的药物，其特征在于，所述药物的有效给药剂量为1-20mg/kg/天，优选为3-15mg/kg/天。
10.根据权利要求5所述的应用或权利要求6-8任一项所述的药物，其特征在于，所述结肠炎包括溃疡性结肠炎、伪膜性结肠炎、乙状结肠炎或缺血性结肠炎中的一种或多种。
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