CN116987792A - 一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用 - Google Patents
一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116987792A CN116987792A CN202310965793.XA CN202310965793A CN116987792A CN 116987792 A CN116987792 A CN 116987792A CN 202310965793 A CN202310965793 A CN 202310965793A CN 116987792 A CN116987792 A CN 116987792A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- haplotype
- seq
- sow
- molecular marker
- pig
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108091028232 Mir-184 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 7
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 102100028727 Bone morphogenetic protein 15 Human genes 0.000 description 1
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 108050006583 Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000695360 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 1
- 101000602926 Homo sapiens Nuclear receptor coactivator 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000613820 Homo sapiens Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 101000665882 Homo sapiens Retinol-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000578500 Ninox novaeseelandiae Species 0.000 description 1
- 102100037223 Nuclear receptor coactivator 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040557 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 102100038246 Retinol-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004994 reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学中猪遗传标记筛选技术领域，提供了一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用，所述单倍型分子标记位于如SEQ ID No.1所示猪miR‑184基因核心启动子，包括如SEQ ID No.1所示序列第37bp处的C>T等位基因突变、69bp处的A>C等位基因突变、226bp处的A>G等位基因突变以及294bp处的C>T等位基因突变。本发明通过提供猪miR‑184基因核心启动子序列、一种与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关的单倍型分子标记及其检测技术和应用，可用于该单倍型分子标记的快速分型、选留或辅助选育优势母本群体，同时，为加快母猪高效生产性状的遗传改良和优良母本新品系地培育提供技术支持，对进一步提升我国生猪种业核心竞争力具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学中猪遗传标记筛选技术领域，具体地说是一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用。
背景技术
众所周知，母猪产仔窝重与仔猪初生重作为两个重要的经济性状具有较强关联性，即在总产仔数和产活仔数稳定的情况下增加产仔窝重可有效提高仔猪初生重，而后者与仔猪断奶重、断奶成活率、180日龄体重以及生长速率和日增重等性状均呈现正相关。因此，在实际生产过程中提高上述两个性状可有效节约饲养成本、增加生产效益。相关研究指出通过改善饲料配方、加强饲养管理或进行遗传改良可潜在有效改善上述两个重要经济性状，但前两者主要治标，且需要在整个生产过程中施加人为监控，因此大大增加了劳动强度和管理难度。后者可以治本，但上述两个性状均为中低遗传力性状，使用常规育种手段进展缓慢，需要依靠基于大量有效遗传标记的分子育种技术进行遗传改良。目前，采用包括基因组重测序、简化基因组测序和全基因组关联分析等方法，同时结合群体验证在猪基因组中鉴定了多个潜在因果突变位点与候选基因，如NCOA1、OPN、RBP4、PRL、IGF2、MSTN、BMP7和BMP15等，但上述基因均为编码蛋白基因，而占据超过猪98％基因组的非编码区域尚未广泛关注和深入研究；
微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是哺乳动物体内广泛存在的一类长度介于21-25nt的内源性非编码RNAs，拥有与编码蛋白基因相似的5'调控区序列结构和转录调控模式，其主要通过碱基互补配对方式在转录或转录后水平调控靶基因表达，进而参与生物体多种重要的生物学过程。近年来，相关研究发现miRNAs能够通过直接或间接作用途径影响猪多种重要经济性状，包括排卵数和产仔数等繁殖性状、日增重和剩余采食量等生长性状以及肌内脂肪沉积和肌纤维分化等肉质性状，但目前已知的与猪重要经济性状显著相关的突变位点较少，特别是尚未鉴定到与母猪产仔窝重与仔猪初生重性状显著关联的分子标记。本实验室前期发现miR-184在母猪生殖系统中特异性高表达且能够通过调控类固醇激素合成影响卵巢和子宫发育以及母猪发情周期，同时其在高繁殖力母猪个体卵巢和子宫中的表达水平显著高于低繁殖力个体，表明其与母猪繁殖力性状潜在相关。然而，目前尚未在miR-184基因上发现与母猪产仔窝重和仔猪出生重等重要经济性状关联的分子标记，有待进一步研究。
为此，本领域技术人员提出了一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用来解决背景技术提出的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用；本发明的目的在于提供猪miR-184基因的核心启动子序列；本发明的另一目的在于提供一种与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关的单倍型分子标记，以及该单倍型分子标记的快速检测技术和优势母本的选留方法；本发明的又一目的在于提供上述单倍型分子标记在选留和辅助选育具有优势产仔窝重和仔猪初生重性状的母本核心群体中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记，包括单倍型分子标记和猪miR-184基因核心启动子，所述单倍型分子标记位于猪miR-184基因核心启动子区中，猪miR-184基因核心启动子序列由300个核苷酸构成，相应核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
扩增所述猪miR-184基因核心启动子序列的特异性引物对，该特异性引物对的正反向引物核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
进一步的，所述与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关的单倍型分子标记，该单倍型分子标记包含4个完全连锁的突变位点，分别位于如SEQ IDNo.1所示的猪miR-184基因核心启动子中第37、69、226和294bp处，突变ID和单碱基突变类型分别为rs80863443C>T、rs325104443A>C、rs80839828A>G和rs3208024226C>T，形成单倍型分别为H1(CAAC)和H2(TCGT)；该单倍型分子标记在大白母猪群体中存在3种单倍型组合(H1H1、H1H2和H2H2)，H2H2型经产母猪产仔窝重和仔猪初生重高于H1H2型母猪，且显著高于H1H1型母猪，其中H2H2型经产母猪产仔窝重分别比H1H1型和H1H2型母猪高0.96kg/胎和0.47kg/胎，而仔猪初生重分别比H1H1型和H1H2型母猪高0.25kg/头和0.18kg/头。
进一步的，针对如SEQ ID No.1所示的猪miR-184基因核心启动子中第226bp处A>G突变检测所述单倍型分子标记的等位基因特异性引物组合。其中，特异性共用正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，A等位基因型(H1单倍型)和G等位基因型(H2单倍型)特异性反向引物核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示。
一种猪基因组中所述单倍型的快速检测方法，利用所述等位基因特异性引物组合SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6对猪基因组DNA进行等位基因特异性PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，可以鉴定不同单倍型组合。
一种优势产仔窝重和仔猪初生重性状母猪的快速选留方法，利用所述等位基因特异性引物组合SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6对猪基因组DNA进行等位基因特异性PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测分型，选留H2H2单倍型组合优势母猪个体。
本发明提供了所述与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重显著相关的单倍型分子标记及其特异性检测引物在选留或辅助选育优势母本群体中的应用，或在制备选育和辅助选育优势母本群体检测芯片和试剂盒中的应用。
标记辅助选择已成为畜禽性状遗传改良的主要手段，本发明所述单倍型分子标记与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关，同时针对该分子标记建立了快速、简便的分型技术，可实现优势母本群体的快速选留和辅助选育，这对生产过程降本增效以及提供更多猪肉产品具有重要经济价值与实践意义。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过提供猪miR-184基因核心启动子序列、一种与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关的单倍型分子标记及其检测技术和应用，可用于该单倍型分子标记的快速分型、选留或辅助选育优势母本群体；同时，为加快母猪高效生产性状的遗传改良和优良母本新品系地培育提供技术支持，对进一步提升我国生猪种业核心竞争力具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的猪miR-184基因核心启动子突变位点测序分型峰示意图；
图2为本发明的猪miR-184基因核心启动子突变位点连锁不平衡与单倍型鉴定示意图；
图3为本发明的猪miR-184基因核心启动子单倍型频率与单倍型组合频率分析示意图；其中，A为单倍型频率分析结果；B为单倍型组合频率分析结果；
图4为本发明的单倍型组合与经产母猪总产仔数、产仔窝重和仔猪初生重性状关联分析示意图；其中，A为单倍型组合与经产母猪总产仔数性状关联分析结果；B为单倍型组合与经产母猪产仔窝重性状关联分析结果；C为单倍型组合与仔猪初生重性状关联分析结果。
图5为本发明的利用等位基因特异性PCR方法建立单倍型组合快速分型鉴定技术示意图；
图6为本发明的不同单倍型对猪卵巢颗粒细胞中miR-184基因核心启动子活性的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
如图1至图6所示：本发明提供了猪miR-184基因核心启动子序列，同时提供了一种与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关的单倍型及其检测技术与应用；在本发明中，所述应用优选的通过快速分型鉴定有利单倍型组合母猪，进而构建具有高产仔窝重和仔猪初生重性状的母本群体而实现。
序列表
序列表
南京农业大学
一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用
15
SIPOSequenceListing 1.0
1
300
DNA
大白猪(Large White Pig)
1
gcagagccag ggaggaggag aacaagccga gggccccctg cctcagacct gcaggagctg 60
ctgggtaaag actttgctaa ctttggttta tttactaatt taaaattttc aattaactta 120
aaaaatcagt tttttaaaaa aaacatgcaa aaaatccact gtttgcgata gttatccagg 180
gctgcatgtc tctatgaccg tgtgcagagg cagaaaagcc tggccaaagg tcaacaggag 240
tgactccagg agagcccgga gcaaagcaga agggctcgga gaggctttgg gggcggggga 300
2
22
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
ccaaccacca agagggaagg at 22
3
20
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
ggcatccgag caggaccact 20
4
21
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
gccccacagc acagtagaca c 21
5
22
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
ggagtcactc ctgttgaccg tt 22
6
22
DNA
人工序列(Artificial Sequence)
1
ggagtcactc ctgttgacca tc 22
实施例
1、实验材料
利用耳缘静脉采血法在江苏省淮安市某种猪场随机采集410头健康经产大白母猪新鲜血液样本，同时收集总产仔数、产仔窝重和仔猪初生重等生产记录，共3675条。
2、猪基因组DNA提取
采用基于酚-氯仿抽提法的血液DNA提取试剂盒(天根公司)从上述血液样本中提取猪基因组DNA，利用双蒸水稀释至终浓度为100ng/μL作为模板进行PCR反应，或置于-20℃保存。
3、引物设计与PCR反应
根据前期获得的猪miR-184基因核心启动子序列(SEQ ID No.1)，利用PrimerPremier 5.0软件设计1对特异性扩增引物，正向引物序列为5'-CCA ACC ACC AAG AGG GAAGGA T-3'(SEQ ID No.2)，反向引物序列为5'-GGC ATC CGA GCA GGA GCA CT-3'(SEQ IDNo.3)。引物交由上海生工生物科技有限公司合成。随后，以猪基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，PCR扩增程序为98℃3min预变性；98℃30sec变性，60℃30sec退火，72℃30sec延伸(33循环)；72℃5min延伸。PCR扩增产物在2.0％的琼脂糖凝胶中以120V电压下电泳20min，经成像分析后确定引物特异性。
4、多态性分型鉴定
PCR扩增产物经过纯化后送往南京擎科生物有限公司进行Sanger测序，测序结果经过DNAStar软件比对后，使用Chromas软件分析测序峰图并进行基因型分型鉴定。结果发现在如SEQ ID No.1上37、69、226和294bp碱基处存在多态性，单碱基突变类型分别为C>T、A>C、A>G和C>T。测序峰图上A单峰判定为AA基因型，T单峰判定为TT基因型，C单峰判定为CC基因型，G单峰判定为GG基因型,双峰则判定为相应杂合基因型(附图1)。
5、连锁不平衡与单倍型分析
针对上述4个突变位点对大白母猪群体(n＝410)进行分型，随后采用Haploview软件和SHEsis在线工具进行连锁不平衡分析，结果发现LD值为1，表明上述4个突变位点在该群体中完全连锁，因此形成2种单倍型，分别为H1(CAAC)和H2(TCGT)(附图2)。测序结果发现，该母猪群体中存在3种单倍型组合，分别为H1H1(CCAAAACC)、H1H2(CTACAGCT)和H2H2(TTCCGGTT)。另外，单倍型频率分析发现H1频率为0.805、H2频率为0.195。单倍型组合频率分析发现H1H1组合型频率为0.666(273头)、H1H2组合型频率为0.278(114头)、H2H2组合型频率为0.056(23头)(附图3)。
6、关联分析
通过在SASv9.2软件中构建一般线性模型(GLM)对上述单倍型与母猪群体总产仔数、产仔窝重和仔猪初生重性状分别进行关联分析。一般线性模型如下所示：
y＝μ+A+AGE+G+P+YS+e
其中，y为性状观测值，μ为群体均值，A为加性效应，AGE为日龄效应，G为基因型效应，P为胎次效应，YS为季节效应，e为随机误差。
结果发现，母猪群体三种单倍型组合个体间总产仔数性状无显著差异，而产仔窝重和仔猪初生重性状存在显著差异。其中，H2H2组合型母猪产仔窝重和仔猪初生重比H1H1组合型母猪分别高0.96kg/胎和0.25kg/头，比H1H2组合型母猪高0.47kg/胎和0.18kg/头(附图4)。
7、单倍型组合快速分型技术
根据单倍型变异特点，针对如SEQ ID No.1上226bp碱基处A>G突变建立基于等位基因特异性PCR方法(AS-PCR)的单倍型组合快速分型技术，利用Primer Premier5.0软件设计3条等位基因特异性引物，其中共用正向引物序列为5'-GCCCCACAGCACAGTAGACAC-3'(SEQID No.4)，A等位基因(H1单倍型)特异性反向引物序列为5'-GGAGTCACTCCTGTTGACCGTT-3'(SEQ ID No.5)，G等位基因(H2单倍型)特异性反向引物序列为5'-GGAGTCACTCCTGTTGACCATC-3'(SEQ ID No.6)。引物交由上海生工生物科技有限公司合成。以猪基因组DNA为模板，利用上述等位基因特异性引物进行PCR反应，10ul反应体系为猪基因组DNA模板0.5μL，正反向引物各0.5μL，2×PremixrTaqDNA聚合酶(诺唯赞公司)5μL，双蒸水3.5μL。PCR反应程序为98℃3min预变性；98℃30sec变性，60℃30sec退火，72℃20sec延伸(32循环)；72℃5min延伸。PCR扩增产物在2.0％的琼脂糖凝胶中以120V电压下电泳20min。经成像分析，仅由A等位基因特异性引物扩增出目的条带则判定为H1H1型个体，仅由G等位基因特异性引物扩增出目的条带则判定为H2H2型个体，两条引物均能扩增出目的条带则判定为H1H2型个体(附图5)。
8、单倍型功能分析
合成含有不同单倍型的猪miR-184基因核心启动子区序列并克隆至pGL3-Basic载体中，分别形成pGL3-H1和pGL3-H2荧光素酶报告载体，采用lipofectamine3000转染试剂(Invitrogen)将上述重组质粒瞬时转染进入体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，具体过程按照说明书进行。猪卵巢颗粒细胞体外培养方法参考文献(①LiQ.Q.,HuoY.A.,WangS.Q.,YangL.,LiQ.F.,Du X.,TGF-β1regulatesthelncRNAtranscriptomeofovariangranulosacells inatranscriptionactivity-dependentmanner.CellProlif2023,56(1):e13336.)进行。随后，利用荧光素酶活性检测试剂盒(诺唯赞公司)分析发现pGL3-H2载体的荧光素酶活性极显著高于pGL3-H1载体(附图6)，表明该单倍型影响猪miR-184基因的转录活性，且H2单倍型为有利单倍型。
众所周知，母猪产仔窝重与仔猪初生重性状均属于遗传力较低的经济性状，常规育种手段对于该类性状的遗传改良进展缓慢，本发明经过研究发现猪miR-184基因核心启动子区上单倍型分子标记与经产母猪产仔窝重和仔猪初生性状重显著相关，针对该单倍型建立的简便高效检测分型技术可快速选留或辅助选育优势母猪群体，对提高母猪群体繁殖力和在实际生产过程中节本增效具有重要经济价值，为相关技术和产品研发提供了一定理论依据。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记，其特征在于：包括单倍型分子标记和猪miR-184基因核心启动子，所述单倍型分子标记位于猪miR-184基因核心启动子区中，所述猪miR-184基因核心启动子序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种扩增猪miR-184基因核心启动子序列的特异性引物对，其特征在于：所述扩增猪miR-184基因核心启动子序列的特异性引物对包括猪miR-184基因核心启动子序列；
该引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记，其特征在于：该单倍型分子标记包含位于如SEQ ID No.1所示的猪miR-184基因核心启动子中第37bp处的C>T等位基因突变、69bp处的A>C等位基因突变、226bp处的A>G等位基因突变和294bp处的C>T等位基因突变；
该单倍型分子标记在母猪群体中存在H1(CAAC)和H2(TCGT)两种单倍型，构成H1 H1、H1H2和H2H2等3种单倍型组合，H2H2型经产母猪产仔窝重和仔猪初生重均高于H1H2型母猪，且显著高于H1H1型母猪。
4.根据权利要求3所述的一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记的等位基因特异性引物，其特征在于：该等位基因特异性引物包括共用正向引物、H1单倍型特异性反向引物和H2单倍型特异性反向引物，所述共用正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述H1单倍型特异性反向引物如SEQ ID No.5所示，所述H2单倍型特异性反向引物如SEQ ID No.6所示。
5.根据权利要求1-4所述的一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：首先利用核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的等位基因特异性引物对猪基因组DNA进行PCR扩增，接着PCR产物经过凝胶电泳和成像分析，最后快速鉴定单倍型组合。
6.一种快速筛选具有优势产仔窝重和仔猪初生重性状母猪的方法，其特征在于：包括以下步骤：首先利用核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的等位基因特异性引物对猪基因组DNA进行PCR扩增，接着PCR产物经过快速分型鉴定，最后选留H2H2型优势母猪。
7.根据权利要求1或3所述猪miR-184基因核心启动子中与经产母猪产仔窝重和仔猪初生重性状显著相关的单倍型分子标记在选留和辅助选育优势母本群体中的应用，或在制备选留和辅助选育优势母本相关检测试剂盒和技术方法中的应用。
8.根据权利要求2或4所述用于检测猪miR-184基因核心启动子及与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关单倍型分子标记的特异性引物在选留和辅助选育优势母本群体中的应用，或在制备选留和辅助选育优势母本相关检测试剂盒和技术方法中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310965793.XA CN116987792A (zh) | 2023-08-02 | 2023-08-02 | 一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310965793.XA CN116987792A (zh) | 2023-08-02 | 2023-08-02 | 一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116987792A true CN116987792A (zh) | 2023-11-03 |
Family
ID=88533429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310965793.XA Pending CN116987792A (zh) | 2023-08-02 | 2023-08-02 | 一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116987792A (zh) |
-
2023
- 2023-08-02 CN CN202310965793.XA patent/CN116987792A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rohrer et al. | A microsatellite linkage map of the porcine genome. | |
| CN108531608B (zh) | Bmp6基因作为黑山羊产羔数性状的分子标记 | |
| CN107267627B (zh) | 与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用 | |
| CN109811063B (zh) | 一种与猪生长速度相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN108546764B (zh) | 一种与蛋鸭产蛋性能相关的分子标记及其在育种中的应用 | |
| CN111647663B (zh) | 一种鸡步行数性状的分子遗传标记及应用 | |
| CN110923333B (zh) | 山羊zbp1基因第一内含子内与产羔数关联的单倍型标记及其应用 | |
| CN113549700B (zh) | 一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记及其在猪育种中的应用 | |
| CN101148668B (zh) | 猪产肉性状相关基因btg1的克隆及其在猪分子标记辅助选择中的应用 | |
| CN106367502A (zh) | Spp1基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用 | |
| EP2478118B1 (en) | Methods of genotyping livestock to determine haplotypes associated with meat quality traits and primer for amplification of a polymorphic region in nt5m | |
| CN110938629B (zh) | 特异性识别猪Wip1基因的成套sgRNA及其应用和产品 | |
| Gorlov et al. | Growth hormone (GH) gene polymorphism and its association with meat productivity in two rough wool sheep breeds grown in Russia's dry zone. | |
| CN104651523A (zh) | Inha基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法 | |
| CN116590433A (zh) | 大白母猪繁殖性能的分子标记、引物、试剂盒、鉴定方法及应用 | |
| CN106119407A (zh) | Lap3基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用 | |
| CN116987792A (zh) | 一种与母猪产仔窝重和仔猪初生重性状相关的单倍型分子标记及其检测引物和应用 | |
| CN111893119B (zh) | 利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法 | |
| CN115011704A (zh) | 影响产仔间隔性状的snp分子标记及其应用 | |
| CN111910009B (zh) | 一种影响鸡法氏囊指数的分子标记及其应用 | |
| CN114921568A (zh) | 一种秦川牛体尺及肉质性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN112522426A (zh) | 一种鉴定法系长白猪产仔性能高低的方法和引物 | |
| CN114875028B (zh) | 一种与母猪总产仔数性状关联的突变位点及其应用 | |
| CN108707675B (zh) | 一种猪生长性状的分子标记方法 | |
| CN113373240B (zh) | 一种鉴定与鸭肌肉发育相关基因位点的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |