CN116983310A - 一种治疗肝癌的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗肝癌的药物组合物及其应用。本发明发现马来酸匹杉琼可以逆转肝癌索拉非尼耐药，提高了索拉非尼在肝癌治疗中的应用范围。同时，马来酸匹杉琼联合索拉非尼在肝癌治疗上可产生协同增效作用，明显优于二者单药使用，并且该作用在细胞学及动物学实验中得到验证，提供了一种肝细胞癌的创新性治疗方案，具有重大的临床转化意义。

Description

一种治疗肝癌的药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗肝癌的药物组合物及其应用。
背景技术
肝细胞癌(以下简称肝癌)占原发性肝癌90％以上。目前，早期肝癌的治疗方式主要以手术切除为主，然而肝癌起病隐匿，绝大部分首诊病人被诊断时已处于肿瘤中晚期阶段。中晚期肝癌(CNLC IIb、IIIa、IIIb期)手术后总体生存不令人满意，系统性抗肿瘤治疗的应用是目前中晚期肝癌治疗的主要方式。
索拉非尼，又名多吉美，是第一个获批用于无法手术或远处转移肝癌治疗的靶向药物。索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，以多个基因为靶点，能够抑制RAF-1、B-RAF的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，以及VGFR-2、VEGF-3、PDGF-β、KIT、FLT-3多种受体的酪氨酸激酶活性。因此，索拉非尼具有双重的抗肿瘤作用：既可通过阻断由RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖，亦可作用于VEGFR，抑制新生血管的形成和切断肿瘤细胞的营养供应。然而研究表明，尽管索拉非尼可延长肝癌患者生存期，但其延长作用十分有限，仅有30％肝癌病人对索拉非尼治疗有反应，并且该部分病人在治疗后的6个月内发生索拉非尼耐药。而且索拉非尼单药治疗总生存期不尽人意，索拉非尼治疗通常会产生副作用，如手足皮肤反应(HFSR)和腹泻。尽管近5年在肝癌靶向治疗药物的选择上有了很大的革新，但大部分的药物包括索拉非尼、仑伐替尼、瑞戈非尼等均存在低应答、高耐药的现象。因此，亟需探索新治疗方案改善肝癌病人对索拉非尼等靶向药物的抵抗以提高靶向治疗疗效。
近年来，有大量研究表明，肿瘤中存在一小群具有自我更新和分化潜能的肿瘤干细胞，是促进肿瘤耐药的重要因素。肿瘤干细胞最早在血液肿瘤中提出，随后在结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌等实体肿瘤中先后被发现。肝癌干细胞具有高度耐药性、自我更新能力、分化潜能，是肝癌临床治疗失败的主要原因。然而目前针对肝癌干细胞提出的临床转化和应用仍然寥寥无几。
匹杉琼，是一种米托蒽醌的衍生物，属于氮杂蒽二酮类抗肿瘤药物，目前临床上使用的是其马来酸盐，即马来酸匹杉琼(pixantrone)。它是欧盟通过的第一种对多复发性或难治性侵袭性非霍奇金B细胞淋巴瘤成年患者的单一疗法，主要通过嵌入肿瘤细胞的DNA中，抑制其拓扑异构酶，从而达到抗肿瘤效应。目前，，Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验已充分验证其安全性,具有比米托蒽醌更低的心脏毒性。但关于马来酸匹杉琼在肝癌中的研究尚未见报道。
本发明提供一种含索拉非尼和马来酸匹杉琼的药物组合，或可降低索拉非尼剂量从而减少其副作用，并提高索拉非尼抗肝癌疗效，同时克服肝癌索拉非尼耐药的难题；靶向肝癌干细胞提高肝癌治疗的疗效，为肝癌临床治疗提供新思路和新方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含索拉非尼和马来酸匹杉琼的药物组合，克服肝癌索拉非尼耐药的难题，并且能够提高索拉非尼抗肝癌疗效。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供马来酸匹杉琼或其药用盐在制备索拉非尼耐药逆转剂和/或预防和/或治疗肿瘤和/或抑制肿瘤生长的药物中的应用。
优选地，所述马来酸匹杉琼或其药用盐的浓度为0～100μM，但不为0。
优选地，所述索拉非尼或其药用盐的浓度为0～50μM，但不为0。
本发明的第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括马来酸匹杉琼或其药用盐和索拉非尼或其药用盐。
在本发明的一些实施方式中，所述马来酸匹杉琼包括化学式I所述的化合物或其药学上可接受的盐；所述索拉非尼包括化学式II所述的化合物或其药学上可接受的盐：
在本发明的一些实施方式中，所述马来酸匹杉琼或其药用盐和索拉非尼或其药用盐的质量比为1：6～10。
在本发明的一些实施方式中，药物组合物或制剂用于体外抑制肿瘤时，所述马来酸匹杉琼或其药用盐的浓度为0～100μM，但不为0。
在本发明的一些实施方式中，所述索拉非尼或其药用盐的浓度为0～50μM，但不为0。
在本发明的一些实施方式中，所述药物或制剂在使用时，所述马来酸匹杉琼或其药用盐的给药剂量为1～20mg/kg。
在本发明的一些优选实施方式中，所述药物或制剂在使用时，所述马来酸匹杉琼或其药用盐的给药剂量为5mg/kg。
在本发明的一些实施方式中，所述药物或制剂在使用时，所述索拉非尼或其药用盐的给药剂量为20～100mg/kg。
在本发明的一些优选实施方式中，所述药物或制剂在使用时，所述索拉非尼或其药用盐的给药剂量为40mg/kg。
本发明的第三方面，提供一种制剂，所述制剂包括本发明第二方面所述的药物组合物。
在本发明的一些实施方式中，所述制剂还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料优选包括填充剂、稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂或透皮吸收促进剂中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述制剂的剂型包括口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂、粘膜给药制剂、肺部吸入给药制剂或肠道给药制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述制剂的剂型为滴剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、膜剂、凝胶剂、散剂、乳剂、滴丸剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、贴剂、贴膏剂、溶液剂、软膏剂或乳膏剂。
本发明还提供本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述的制剂在制备预防和/或治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肝癌、胆管细胞癌、肝脏转移性肿瘤、肾癌或甲状腺癌。
本发明的有益效果是：
本发明发现索拉非尼和马来酸匹杉琼的药物组合可产生协同增效作用，明显优于二者单药使用，有效地提高了抗肝癌治疗疗效，逆转了索拉非尼耐药的难题，拓宽了索拉非尼等靶向药物在肝癌治疗中的应用范围。
近年来，不断有研究表明肝癌细胞中存在一小群肝癌干细胞，其在多种治疗耐药、肿瘤的复发和转移中发挥了关键作用。然而目前针对肝癌干细胞及其干性以期提高肝癌治疗疗效的临床转化和应用较少。本发明中马来酸匹杉琼通过Notch1/Numb信号轴调控肝癌干细胞，从而抑制索拉非尼耐药，为临床肝癌的治疗提供新思路。
附图说明
图1为马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理对肝癌细胞生长的作用，显示马来酸匹杉琼和索拉非尼对肝癌细胞生长具有显著抑制作用，并呈浓度依赖方式。图1A为马来酸匹杉琼单药使用对肝癌细胞活力的影响；图1B为索拉非尼单药使用对肝癌细胞活力的影响；图1C为不同浓度的马来酸匹杉琼联合索拉非尼组合对肝癌细胞活力的影响)。
图2为马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理小鼠肝癌模型的分组示意图。在体内验证马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合对肝癌的抑制作用时，根据体重将小鼠随机分为4组，第一组为空白对照组，每只小鼠予0.1ml橄榄油灌胃和0.2ml生理盐水尾静脉注射；第二组为马来酸匹杉琼单药治疗组，每只小鼠予0.1ml橄榄油灌胃和5mg/kg马来酸匹杉琼(溶解于0.2ml生理盐水)尾静脉注射；第三组为索拉非尼单药治疗组，每只小鼠予40mg/kg索拉非尼(溶解于0.1ml橄榄油)灌胃和0.2ml生理盐水尾静脉注射；第四组为联合治疗组，每只小鼠予40mg/kg索拉非尼(溶解于0.1ml橄榄油)灌胃和5mg/kg马来酸匹杉琼(溶解于0.2ml生理盐水)尾静脉注射。
图3为马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理对HCCLM3细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤生长的影响。图3A为利用HCCLM3细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型示意图；图3B为治疗终点时，每组小鼠皮下移植肿瘤的图片；图3C为治疗终点时，肿瘤的大小统计图；图3D为治疗终点时，肿瘤的重量统计图。
图4为马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理对Hepa1-6细胞构建C57小鼠皮下移植瘤模型中肿瘤生长的影响。图4A为利用Hepa1-6细胞构建C57小鼠皮下移植瘤模型；图4B为治疗终点时，每组小鼠皮下移植肿瘤的图片；图4C为治疗终点时，肿瘤的大小统计图；图4D为治疗终点时，肿瘤的重量统计图。
图5为马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理对Hepa1-6构建原位移植瘤模型中肿瘤生长的影响。图5A为利用Hepa1-6构建原位移植瘤模型；图5B为在原位移植瘤模型术后3、17、31天后，每组小鼠原位移植瘤生物发光图片；图5C为图5B的统计图。
图6为马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理对DEN/CCl4诱导自发成瘤模型中肿瘤生长的影响。图6A为构建DEN/CCl4诱导自发成瘤模型；图6B-图6C为不同处理对肝内肿瘤形成数量、生长大小和肝脏重量的影响。
图7为马来酸匹杉琼对肝癌干细胞成球的影响，结果提示马来酸匹杉琼显著抑制Huh7和HCCLM3干细胞球的形成。
图8为马来酸匹杉琼对Notch1/Numb信号轴的作用，结果提示马来酸匹杉琼显著抑制Notch1和Numb的互作，从而抑制Notch1信号活化；图8A为免疫荧光共染提示马来酸匹杉琼对Notch1和Numb共定位的作用；图8B为马来酸匹杉琼显著升高HCCLM3细胞中Numb蛋白，降低Notch1蛋白的表达。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1马来酸匹杉琼、索拉非尼或二者联合处理对肝癌细胞生长的影响
1、细胞培养：将肝癌细胞Huh7细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；
2、分组及药物处理：
马来酸匹杉琼组：分别予0、0.1、1、2、5、10、20、50、100μM；
索拉非尼组：分别予0、0.1、1、2、5、10、20、50、100μM；
联合给药组：在单药组不同浓度的索拉非尼的基础上联合使用不同浓度的马来酸匹杉琼(单药组浓度)；
3、细胞活力的测定及IC50值的计算
3.1细胞铺板：取对数生长期的细胞，细胞融合度大约为85％，使用胰酶消化细胞，常规离心后其上清。使用含10％ FBS的DMEM重悬细胞，调整细胞浓度至3.5×104个/ml。96孔板最外围孔加入100μl PBS，其余孔加入100μl细胞悬液，放置细胞培养箱培养6h至细胞贴壁；
3.2药物处理：使用新鲜培养基配置不同浓度的药物，并更换培养基，使得药物终浓度如上述分组所示，每个浓度设3个复孔。另外，同时设置不加药培养的细胞为对照组，以及不含细胞的培养液为空白组。在细胞培养箱继续培养72h后，每孔加入10ul CCK-8溶液继续培养90min，在全波长酶联免疫检测仪450nm波长下测定各孔光吸收值，并计算各组细胞的存活率，计算公式如下：细胞存活率(％)＝[(药物组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100％。使用Graphpad7.0计算药物对各肿瘤细胞的IC50值。
4、药物协同判别方法
本实施例中使用synergyfinder软件计算马来酸匹杉琼与索拉非尼两药联合使用用药指数(红色代表相互协同效果而绿色代表相互抑制效果)。
实验结果如图1所示；其中图1A显示马来酸匹杉琼显著抑制肝癌细胞Huh7的活力，并且呈明显的浓度及时间依赖性；图1B显示索拉非尼显著抑制肝癌细胞Huh7的活力，并且呈明显的浓度及时间依赖性；图1C显示不同浓度的马来酸匹杉琼与索拉非尼组合物对肝癌细胞的活力的影响示，联合用药协同抑制肝癌细胞Huh7的活力，且呈明显的浓度依赖性。HSA协同指数为7.975>0，说明2个药物存在协同作用(红色代表相互协同效果而绿色代表相互抑制效果)。
实施例2马来酸匹杉琼、索拉非尼或两者联合处理小鼠肝癌模型的分组示意图
为验证马来酸匹杉琼、索拉非尼或二者联合处理在小鼠肝癌模型中对肝癌生长的抑制作用，构建了4种不同的肝癌模型，包括：
1、HCCLM3-LV-RBCK1细胞裸鼠皮下移植瘤模型；
2、Hepa1-6-LV-RBCK1细胞C57小鼠皮下移植瘤模型；
3、Hepa1-6-LV-RBCK1细胞(转染luciferase病毒)C57小鼠原位移植瘤模型；
4、二乙基亚硝胺(DEN)联合四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝癌自发成瘤模型；
建模成功后，对小鼠进行随机分为四组，每组6只小鼠，而后进行药物治疗，治疗方案如图2，具体如下：
1、第一组为空白对照组：每只小鼠予0.1ml橄榄油灌胃和0.2ml生理盐水尾静脉注射；
2、第二组为马来酸匹杉琼单药治疗组，每只小鼠予0.1ml橄榄油灌胃和5mg/kg马来酸匹杉琼(溶解于0.2ml生理盐水)尾静脉注射；
3、第三组为索拉非尼单药治疗组，每只小鼠予40mg/kg索拉非尼(溶解于0.1ml橄榄油)灌胃和0.2ml生理盐水尾静脉注射；
4、第四组为联合治疗组，每只小鼠予40mg/kg索拉非尼(溶解于0.1ml橄榄油)灌胃和5mg/kg马来酸匹杉琼(溶解于0.2ml生理盐水)尾静脉注射。
具体情况如下：
1)HCCLM3-LV-RBCK1细胞裸鼠皮下移植瘤模型构建步骤、药物处理及疗效评估
1、模型构建步骤
1.1细胞培养：肝癌细胞HCCLM3-LV-RBCK1培养于含10％ FBS的DMEM培养基于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；待细胞扩增至足够数量时，使用胰酶消化细胞，常规离心后弃上清，使用6毫升磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，充分混匀细胞悬液。使用1毫升注射器吸取细胞悬液，将带有细胞悬液的注射器置于冰上，以保持细胞活性；
1.2麻醉小鼠，使用酒精消毒皮肤，将注射器Z形进针穿进小鼠皮下并注入0.2ml肿瘤悬液(含1×106个细胞)，缓慢拔出注射器，构建HCCLM3-LV-RBCK1细胞裸鼠皮下移植瘤模型；
1.3复苏小鼠后，放回笼子继续饲养，在手术后第7天对小鼠进行随机分组，而后进行药物治疗，每周2次：
根据体重对小鼠进行随机分组，并给予相应的药物方案治疗：
1.3.1第一组(对照组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
1.3.2第二组(马来酸匹杉琼单药组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
1.3.3第三组(索拉非尼组单药组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)；
1.3.4第四组(马来酸匹杉琼联合索拉非尼治疗组组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)。
1.4药物治疗后每周检测一次肿瘤体积；在药物治疗四周后，处死小鼠，剥离皮下肿瘤测量肿瘤体积和重量，拍照记录；
1.5根据测量结果，做统计比较，分析药物治疗对肿瘤生长的抑制作用。
根据统计分析结果发现，马来酸匹杉琼和索拉非尼单药治疗均能够显著抑制肿瘤生长，并且二者对肿瘤生长的抑制作用无显著性差异，但相比于两种药物的单药治疗，马来酸匹杉琼与索拉非尼联合治疗对肿瘤生长抑制作用最为显著，提示马来酸匹杉琼能够提高肝癌对索拉非尼的敏感性，增强其抗肿瘤作用(图3)。
2)Hepa1-6-LV-RBCK1细胞C57小鼠皮下移植瘤模型构建步骤、药物处理及疗效评估
2、模型构建步骤
2.1细胞培养：将Hepa1-6-LV-RBCK1细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；待细胞扩增至足够数量时，使用胰酶消化细胞，常规离心后弃上清，使用6毫升磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，充分混匀细胞悬液。使用1毫升注射器吸取细胞悬液，将带有细胞悬液的注射器置于冰上，以保持细胞活性；
2.2麻醉小鼠，使用脱毛膏脱去C57BL/6J小鼠右臀部毛发，使用酒精消毒皮肤，将注射器Z形进针穿进小鼠皮下并注入0.2ml肿瘤悬液(含5×105个细胞)，缓慢拔出注射器，构建Hepa1-6-LV-RBCK1细胞C57小鼠皮下移植瘤模型；
2.3复苏小鼠后，放回笼子继续饲养，在手术后第3天对小鼠进行随机分组，而后进行药物治疗，每周2次；其中
根据体重对小鼠进行随机分组，并给予相应的药物方案治疗：
2.3.1第一组(对照组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
2.3.2第二组(马来酸匹杉琼单药组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
2.3.3第三组(索拉非尼组单药组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)；
2.3.4第四组(马来酸匹杉琼联合索拉非尼治疗组组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)。
2.4药物治疗后每周检测一次肿瘤体积；在药物治疗四周后，处死小鼠，剥离皮下肿瘤测量肿瘤体积和重量，拍照记录；
2.5根据测量结果，做统计比较，分析药物治疗对肿瘤生长的抑制作用。
根据统计分析结果发现，马来酸匹杉琼和索拉非尼单药治疗均能够显著抑制肿瘤生长，并且二者对肿瘤生长的抑制作用无显著性差异，但相比于两种药物的单药治疗，马来酸匹杉琼与索拉非尼联合治疗对肿瘤生长抑制作用最为显著，提示马来酸匹杉琼能够提高肝癌对索拉非尼的敏感性，增强其抗肿瘤作用(图4)。
3)Hepa1-6-LV-RBCK1细胞C57小鼠肝癌原位移植模型构建步骤、药物处理及疗效评估
3、模型构建步骤
3.1细胞培养：将索拉非尼不敏感的肝癌细胞Hepa1-6-LV-RBCK1培养于含10％FBS的DMEM培养基于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；
3.2待细胞扩增至足够数量时，使用胰酶消化细胞，常规离心后弃上清，使用0.5毫升磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，加入0.5毫升基质胶，充分混匀细胞悬液。使用1毫升胰岛素注射器吸取细胞悬液，将带有细胞悬液的注射器置于冰上，防止基质胶凝固；
3.3麻醉小鼠，固定于手术台上，使用酒精消毒皮肤，使用手术刀逐层剪开皮肤及肌肉，暴露肝脏左外叶，将胰岛素注射器中的肿瘤悬液注射25μl(1×106个细胞)至小鼠肝包膜下，使用可吸收缝线逐层缝合肌肉及皮肤；
3.4复苏小鼠后，放回笼子继续饲养，在手术后第3天对小鼠进行活体成像评估肿瘤生长情况。根据每组小鼠生物发光发强度，将小鼠随机分为4组使得每组间生物发光强度无显著性差异；
分组后，每组小鼠予以对应的治疗方案，每周2次治疗；小鼠分组及药物处理的具体情况如下：
3.4.1第一组(对照组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
3.4.2第二组(马来酸匹杉琼单药组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
3.4.3第三组(索拉非尼组单药组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)；
3.4.4第四组(马来酸匹杉琼联合索拉非尼治疗组组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)。
3.5在手术第17天和第31天对各组小鼠进行小动物活体成像评估治疗过程中各治疗方案对肿瘤生长的抑制作用。
根据统计分析结果发现，马来酸匹杉琼和索拉非尼单药治疗均能够显著抑制肿瘤生长，并且呈时间依赖性，但相比于两种药物的单药治疗，马来酸匹杉琼与索拉非尼联合治疗对肿瘤生长抑制作用最为显著，提示马来酸匹杉琼能够提高肝癌对索拉非尼的敏感性，增强其抗肿瘤作用(图5)。
4)DEN联合四CCl4诱导小鼠肝癌自发成瘤模型构建步骤、药物处理及疗效评估
4、模型构建步骤
4.1小鼠繁殖：购买充足数量的孕母鼠饲养于SPF级动物房，每日观察小鼠的状态及生育情况，记录每只小鼠的出生时间；
4.2DEN造模：新出生的小鼠满14天周龄后，筛选雄性小鼠，称量体重，按体重腹腔注射25mg/kg DEN，放回笼中继续饲养，待小鼠离乳后分笼饲养。每日观察小鼠状态，及时取出死亡的小鼠；
4.3CCl4造模：待小鼠生长至8周龄时，每周称量1次体重，按体重腹腔注射0.5ml/kg CCl4，每周2次，持续14周；
4.4小鼠分组：待小鼠生长至18周龄时，根据小鼠体重进行随机分为4组，根据分组，每组小鼠予以对应的治疗方案，每周2次；其中小鼠分组及药物处理具体情况如下：
4.4.1第一组(对照组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
4.4.2第二组(马来酸匹杉琼单药组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升橄榄油(含5％DMSO)；
4.4.3第三组(索拉非尼组单药组)：尾静脉注射200微升生理盐水+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)；
4.4.4第四组(马来酸匹杉琼联合索拉非尼治疗组组)：尾静脉注射200微升0.5mg/ml匹衫琼溶液(生理盐水配置)+灌胃100微升8mg/ml索拉非尼溶液(橄榄油配置含5％DMSO)。
4.5药物抗肿瘤疗效评估
根据统计分析结果发现，马来酸匹杉琼和索拉非尼单药治疗均能够显著抑制肿瘤生长，显著减少肝脏表面肿瘤(直径大于3mm)个数，降低肿瘤最大直径。相比于两种药物的单药治疗，马来酸匹杉琼与索拉非尼联合治疗对肿瘤生长抑制作用最为显著，提示马来酸匹杉琼协同索拉非尼发挥抗肿瘤作用。并且三种治疗方案相比于对照治疗均能降低肝脏肿瘤，但是三种非对照治疗小鼠之间肝脏重量无显著性差异(图6)。
实施例3马来酸匹杉琼对肝癌干细胞干性的影响
1、细胞培养：将肝癌细胞Huh7和HCCLM3-LV-RBCK1细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；
2、细胞铺板：取对数生长期的细胞，细胞融合度大约为85％，使用胰酶消化细胞，常规离心后弃其上清。调整细胞浓度按照2000个细胞/孔接种于低吸附6孔板中，每个孔添加2ml浮球培养基(DMEM/F12培养基+B-27(1:50)+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF)，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
3、药物处理：使用DMSO或10μM马来酸匹杉琼处理细胞，每个浓度设3个复孔，培养12天至成球。
4.结果记录：显微镜下观察干细胞成球状态，记录数目并拍照。
既往研究表明肿瘤干细胞在多种药物治疗耐药中发挥了不可或缺的作用，包括索拉非尼耐药。本实施例结果如图7，结果显示马来酸匹杉琼显著抑制肝癌细胞Huh7，HCCLM3-LV-RBCK1肿瘤球的形成，提示马来酸匹杉琼通过影响肝癌干细胞干性从而调控索拉非尼耐药。
实施例4马来酸匹杉琼对Notch1/Numb信号轴的作用
1、马来酸匹杉琼增强Numb与Notch1之间的相互作用
1.1细胞培养：将肝癌细胞HCCLM3-LV-RBCK1细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；
1.2细胞铺板：取2×106个细胞铺板于10cm培养皿，将细胞放置于细胞培养箱培养12小时或者过夜，使细胞贴壁后开始药物处理；
1.3药物处理：往对照组加入8ml含0.1％ NaCl 10％ FBSDMEM；实验组加入8ml含10μM马来酸匹杉琼10％ FBSDMEM，放置细胞培养箱处理细胞48小时；
1.4蛋白相互作用检测：
1.4.1缓冲液准备(按表1配方准备实验需要缓冲液)；
表1
1.4.2用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
1.4.3加入0.5ml预冷的IP Lysis Buffer(含1％蛋白酶抑制剂)；
1.4.4用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5ml EP管中，4℃，缓慢晃动15min(EP管插冰上，置水平摇床上)；
1.4.5 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的1.5ml EP管中；
1.4.6抗原抗体复合物准备：往新的1.5ml EP管中加入5μl Numb抗体(CellSignaling Technology,#2756)，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；
1.4.7磁珠预处理：取1.5ml离心管，加入500μL Binding Buffer洗涤；
1.4.8将磁珠漩涡振荡1min，使其充分混悬，向上述管中分别加入20μl磁珠；
1.4.9将离心管置于磁力架，待磁珠吸附于管壁，吸弃上清；
1.4.10抽出磁条，加入500μL Binding Buffer重复洗涤一次，重复前一步骤；
1.4.11抽出磁条，将抗原抗体复合物加入装有磁珠的EP管中，封口膜封口；
1.4.12置于4℃冰箱的翻转仪上反应过夜；
1.4.13抗原分离将磁珠-抗原复合物进行磁性分离；
1.4.14抽出磁条，向EP管中加入1ml Washing Buffer，轻轻吹打10次；
1.4.15将EP管放置于翻转仪上翻转清洗10min；
1.4.16插回磁条并进行磁性分离，吸弃上清，重复洗涤3次；
1.4.17抽出磁条，加入500μL Washing Buffer，将复合物悬液转移至新的1.5mLEP管中；
1.4.18插回磁条并执行磁性分离，吸弃上清；
1.4.19抗原洗脱：加入65μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀，95℃加热8min；
1.4.20插回磁条并执行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测；
1.5SDS-PAGE蛋白电泳(使用雅酶Omni-EasyTM一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒)
1.5.1取等体积下层胶溶液和下层胶缓冲液，各2.0/2.7/4.0mL，混匀；
1.5.2取等体积上层胶溶液和彩色上层胶缓冲液，各0.5/0.75/1.0mL，混匀；
注意：由于染料的特殊理化性质，使用前请摇匀；
1.5.3向步骤1.5.1的混合溶液中加入40/60/80μL的改良型促凝剂，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5cm即可。
1.5.4向步骤1.5.2的混合溶液中加入10/15/20μL的改良型促凝剂，轻轻混匀，无需等待下层胶凝固，即可将混匀后的溶液轻缓注入制胶玻璃板中，插入梳齿；
注意：灌注上层胶溶液一定要轻缓，避免将上层胶溶液冲入下层胶。
1.5.5待胶凝固后(约15min)，拔去梳齿即可用于电泳；
1.5.6使用80V 30min将蛋白样品电泳至下层胶是转为120V 70min电泳，完成后进行转膜；
1.5.7甲醇激活PVDF膜，泡沫/滤纸/凝胶/PVDF薄/滤纸/泡沫，350mA120min；
1.5.8PVDF膜放置TBST中漂洗1-2分钟，37℃脱脂奶粉封闭30min(室温1h30min)；
1.5.9TBST洗涤蛋白膜3次，每次7min，裁剪PVDF膜，孵育一抗；4℃孵育过夜；
1.5.10TBST洗涤条带3次，每次7min，孵育相应二抗，室温1h 30min；
1.5.11TBST洗涤条带3次，每次7min，配置曝光液(1:1)，凝胶成像仪分析。
既往的研究表明，Notch1信号轴在维持肿瘤干性方面发挥重要功能，Numb是Notch1信号的负性调控分子，可以促进Notch1的溶酶体降解，进而抑制Notch1信号的活化。从结果可以看出，马来酸匹杉琼处理显著降低Notch1的表达，并且减少了Numb与Notch1之间相互结合的程度，提示马来酸匹杉琼可以增强Numb/Notch1信号轴，促进Notch1的溶酶体降解，进而发挥抑制肝癌干性的作用。
2、马来酸匹杉琼增加Numb与Notch1空间共定位
2.1细胞培养：将肝癌细胞HCCLM3-LV-RBCK1细胞培养于含10％ FBS的DMEM培养基于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养，传代3代，细胞状态良好后开始实验；
2.2细胞铺板：取1×104个细胞铺板于共聚焦培养皿，将细胞放置于细胞培养箱培养12小时或者过夜，使细胞贴壁后开始药物处理；
2.3药物处理：往对照组加入1ml含0.1％ NaCl 10％ FBSDMEM；实验组加入1ml含10μM马来酸匹杉琼10％ FBSDMEM，放置细胞培养箱处理细胞48小时；
2.4免疫荧光检测
2.4.1用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2.4.2使用预冷的甲醇固定细胞10min，吸弃甲醇；
2.4.3使用0.25％ Triton-X 100破膜5min，吸弃Triton-X 100；
2.4.4使用PBS配置的10％山羊血清37℃封闭30min，吸弃山羊血清；
2.4.5使用山羊血清配置Numb(Cell Signaling Technology,#2756，1：200)和Notch1抗体(Abcam,ab44986，1：200)混合液，每个共聚焦皿加入200μL抗体混合液，4℃孵育过夜；
2.4.6使用TBST清洗10min，3遍；
2.4.7加入二抗混合液，含Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa 488；Abcam，ab150077；1：100)和Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa />594；Abcam，ab150116；1：100)，37℃孵育30min；
2.4.8使用TBST清洗10min，3遍；
2.4.9每个共聚焦皿加入200μL含DAPI的抗淬灭剂。
既往的研究表明，Notch1信号轴在维持肿瘤干性方面发挥重要功能，Numb是Notch1信号的负性调控分子，可以促进Notch1的溶酶体降解，进而抑制Notch1信号的活化。本实施例结果如图8，从结果可以看出，马来酸匹杉琼处理可以增加Numb与Notch1的共定位水平，提示马来酸匹杉琼可以增强Numb/Notch1信号轴，促进二者间的相互作用。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.马来酸匹杉琼或其药用盐在制备索拉非尼耐药逆转剂和/或预防和/或治疗肿瘤和/或抑制肿瘤生长的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述马来酸匹杉琼的浓度为0～100μM，但不为0。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括马来酸匹杉琼或其药用盐和索拉非尼或其药用盐。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述马来酸匹杉琼或其药用盐和索拉非尼或其药用盐的质量比为1：6～10。
5.一种制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求3～4任一项所述的药物组合物。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述制剂还包括药学上可接受的辅料；优选地，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、稀释剂、吸收剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂或透皮吸收促进剂中的一种或多种；优选地，所述制剂的剂型包括口服制剂、注射制剂、经皮给药制剂、粘膜给药制剂、肺部吸入给药制剂或肠道给药制剂；优选地，所述制剂的剂型为滴剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、膜剂、凝胶剂、散剂、乳剂、滴丸剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、贴剂、贴膏剂、溶液剂、软膏剂或乳膏剂。
7.权利要求3～4任一项所述的药物组合物或权利要求5～6任一项所述的制剂在制备预防和/或治疗肿瘤和/或抑制肿瘤生长的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述马来酸匹杉琼或其药用盐的浓度为0～100μM；优选地，所述索拉非尼或其药用盐的浓度为0～50μM，但均不为0。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述马来酸匹杉琼或其药用盐的给药剂量为1～20mg/kg；优选地，所述索拉非尼或其药用盐的给药剂量为20～100mg/kg。
10.根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、胆管细胞癌、肝脏转移性肿瘤、肾癌或甲状腺癌。
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