CN116970673A - 一种抗疲劳牡丹肽及其制备方法 - Google Patents

一种抗疲劳牡丹肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于多肽制备技术领域,具体涉及一种抗疲劳牡丹肽及其制备方法。本发明提供的抗疲劳牡丹肽的制备方法包括如下步骤:S1、将牡丹籽粕研磨粉碎,微波处理;S2、向牡丹籽粕混合液中加入复合助剂,进行均质处理;S3、向牡丹籽粕混合液中加入中性蛋白酶进行一次酶解;再加入碱性蛋白酶进行二次酶解,加入保护剂,搅拌均匀、喷雾干燥,即得。本发明提供的牡丹肽的制备方法,能够有效促进提取过程中牡丹肽的溶出,提高牡丹肽的水解度,并且制得的牡丹肽具有优异的抗氧化性能,能够有效缓解体力疲劳,应用于食品、保健品领域具有较广阔的前景。

Description

一种抗疲劳牡丹肽及其制备方法
技术领域
本发明属于多肽技术领域,具体涉及一种抗疲劳牡丹肽及其制备方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)属于药科(Paeoniaceae)药属(Paeonia),为多年生落叶小灌木。牡丹籽含油量丰富,籽油中不饱和脂肪酸总量为80%~92%,其中亚麻酸含量为32%~67%,亚油酸含量为19%~35%。α-亚麻酸作为人体的必需脂肪酸,具有降胆固醇、降血脂等多种保健功能,2011年3月国家卫生部批准凤丹和紫斑牡丹籽油为新资源食品,我国油用牡丹种植面积急剧扩大,牡丹产量逐年提高,油脂提取后产生大量的牡丹籽饼粕。目前这些饼粕主要作为饲料原料或食用菌培养基基料,综合开发利用水平较低。
而牡丹籽饼粕中的蛋白含量约为18%~35%,具有很高的营养价值,从牡丹籽粕中提取的蛋白肽具有丰富的氨基酸,不仅易于被人体吸收利用,还能调节机体的生理功能,尤其是具有抗氧化的功能,可以清除运动或劳动后体内的自由基,有效减缓人体疲劳。
然而现有技术中牡丹肽的提取工艺复杂,且牡丹肽的组成复杂水溶性差,提取得到的牡丹肽还存在水解度低,蛋白杂质多,抗氧化活性差等问题,极大地限制了其在食品领域的应用,降低了其综合利用度。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种抗疲劳牡丹肽及其制备方法。本发明提供的牡丹肽的制备方法,能够有效促进提取过程中牡丹肽的溶出,提高多肽的水解度,并且制得的牡丹肽具有优异的抗氧化性能,能够有效缓解体力疲劳,牡丹肽的分子量分布在1500Da以下,分子量小且分布集中,更有利于人体的直接吸收利用,应用于食品、保健品领域具有较广阔的前景。
本发明的技术方案是:
一种抗疲劳牡丹肽的制备方法,包括如下步骤:
S1、将牡丹籽粕进行研磨粉碎,加入去离子水进行微波处理;
S2、向步骤S1微波处理后的牡丹籽粕混合液中加入复合助剂,然后进行均质处理;
S3、向步骤S2均质处理后的牡丹籽粕混合液中加入中性蛋白酶进行一次酶解;然后调节pH,再加入碱性蛋白酶进行二次酶解,然后灭酶,加入保护剂,搅拌均匀、喷雾干燥,即得。
进一步地,所述的牡丹籽粕是以牡丹籽为原料,经过压榨提取油脂后剩余的固体部分。
进一步地,所述步骤S2中的复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇和葡甘露聚糖按重量比1~3:7~11:2~4组成。
更进一步地,所述步骤S2中的复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇和葡甘露聚糖按重量比2:10:3组成,所述聚乙烯醇为聚乙烯醇1799型。
进一步地,所述步骤S1中去离子水的添加量是牡丹籽粕质量的2~3倍。
进一步地,所述步骤S2中的复合助剂的添加量为步骤S1中牡丹籽粕重量的1.0~1.8%。
进一步地,所述步骤S1中牡丹籽粕研磨粉碎过60~100目筛;所述步骤S1中的微波处理的功率为400~700W,微波处理的时间5~10min。
进一步地,所述步骤S2中均质处理的均质压力为20~30MPa,均质时间为5~10min。
进一步地,所述步骤S3中的中性蛋白酶和碱性蛋白酶的添加量均为所述步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的2%~3%。
进一步地,所述步骤S3中一次酶解时的酶解时间为3~4h,酶解温度为40~50℃;所述步骤S3中二次酶解时调节牡丹籽粕混合液的pH至7~9,酶解时间为2~3h,酶解温度为40~55℃。
进一步地,所述步骤S3的灭酶过程为90℃维持20min。
进一步地,所述步骤S3中的保护剂由柠檬酸和芦荟苷按重量比3~6:2组成;所述步骤S3中保护剂的添加量为灭酶后的酶解液质量的0.4~0.8%。
本发明还提供了一种通过上述制备方法制得的牡丹肽在制备具有抗疲劳作用食品、保健品中的应用。
本发明提供的抗疲劳牡丹肽的制备工艺过程中,先向其中加入去离子水进行微波处理,所述的微波功率为400~700W,处理时间为5~10min,在微波处理的过程中,能够利用交频磁场、电场的作用,使牡丹籽粕内的极性分子取向随电场方向的改变而变化,从而导致分子旋转、振动或摆动,加剧反应物分子运动及相互间的碰撞频率,使牡丹籽粕能在短时间内达到活化状态,从而有效促进牡丹肽的溶出,提高牡丹肽的含量。
接着向微波处理后的牡丹籽粕混合液中加入由大豆卵磷脂、聚乙烯醇和葡甘露聚糖按特定比例组成的复合助剂,进行均质处理。首先,通过复合助剂的协同作用,能够使牡丹籽粕在溶液体系中分布的更加均匀,为下一步的酶解反应创造更好的反应条件;同时还可以促进牡丹肽的溶出效率,提高牡丹肽的水解度。接着分别采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行两次酶解,并且对酶解时间、酶解温度、pH等条件进行优化,酶解效果优异,制得的牡丹肽水解度高,分子量分布集中在1500Da之内,抗氧化活性更强,更能有利于人体对多肽的吸收。
最后向得到的灭酶后的酶解液中加入由柠檬酸和芦荟苷制得的保护剂,有效延长制得的牡丹肽的保质期,并且能够有效提高牡丹肽的抗氧化活性,具有显著的抗疲劳作用。
与现有技术相比,本发明提供的抗疲劳牡丹肽具有以下优势:
(1)本发明提供的抗疲劳牡丹肽的制备方法,通过优化制备工艺,采用了微波、均质等预处理过程,能够有效促进提取过程中牡丹肽的溶出,从而提高提取效率。
(2)本发明提供的抗疲劳牡丹肽的制备方法,通过在微波处理后的牡丹籽粕中添加的复合助剂,能够使牡丹籽粕在溶液体系中分布的更加均匀,从而在酶解过程中使牡丹籽粕和中性蛋白酶和碱性蛋白酶能够充分混合;同时还可以有效促进牡丹肽的溶出效率,提高牡丹肽的水解度。
(3)采用本发明提供的制备方法制得的牡丹肽,能够显著提高制得的牡丹肽的抗氧化性能,对DPPH自由基清除能力较好,能够有效缓解体力疲劳。且制得的牡丹肽分子量分布在1500Da以下,分子量小且分布集中,更有利于人体的直接吸收利用,应用于食品、保健品领域具有较广阔的前景。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的保护范围之内。
以下实施例和对比例中,未作特别说明的试剂为常规试剂,均可在常规试剂生产销售公司购买:所用方法,如无特殊说明,均为现有技术,部分原料生产厂家等信息如下中性蛋白酶(CAS号:9068-59-1),购自上海源叶生物科技有限公司,货号为S25046;
芦荟苷(CAS号:1415-73-2),购自上海源叶生物科技有限公司,货号为B20775;
大豆卵磷脂(CAS号:8002-43-5),购自上海源叶生物科技有限公司,货号为S30869;
D-甘露糖(CAS号:3458-28-4),购自上海源叶生物科技有限公司,货号为S11071;
碱性蛋白酶(CAS号:9074-07-1),购自山东耀途生物工程有限公司;
葡甘露聚糖(CAS号:11078-31-2),购自上海惠诚生物科技有限公司,货号为P-GLCML。
实施例1一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,包括如下步骤:
S1、将牡丹籽粕进行研磨粉碎过60目筛,加入牡丹籽粕质量的2倍的去离子水进行微波处理,微波处理的功率为400W,微波处理的时间为10min;
S2、向步骤S1微波处理后的牡丹籽粕混合液中加入步骤S1中牡丹籽粕重量的1.0%复合助剂进行均质处理,均质压力为20MPa,均质时间为10min;所述的复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇1799和葡甘露聚糖按重量比1:11:4组成。
S3、向步骤S2均质处理后的牡丹籽粕混合液中加入中性蛋白酶进行一次酶解,酶解时间为3h,酶解温度为50℃;然后调节牡丹籽粕混合液的pH至7,再加入碱性蛋白酶进行二次酶解,酶解时间为2h,酶解温度为55℃,所述中性蛋白酶的添加量为S2所得的牡丹籽粕混合液重量的2%,所述碱性蛋白酶的添加量为所述步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的3%;酶解结束后在,90℃下维持20min灭酶,然后加入保护剂(所述保护剂由柠檬酸和芦荟苷按重量比3:2组成;所述保护剂的添加量为灭酶后的酶解液质量的0.4%),搅拌均匀、喷雾干燥,即得。
实施例2一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,包括如下步骤:
S1、将牡丹籽粕进行研磨粉碎过80目筛,加入牡丹籽粕质量的2.5倍的去离子水进行微波处理,微波处理的功率为600W,微波处理的时间8min;
S2、向步骤S1微波处理后的牡丹籽粕混合液中加入步骤S1中牡丹籽粕重量的1.5%复合助剂,进行均质处理,均质压力为25MPa,均质时间为8min;所述的复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇1799和葡甘露聚糖按重量比2:10:3组成;
S3、向步骤S2均质处理后的牡丹籽粕混合液中加入中性蛋白酶进行一次酶解,酶解时间为3.5h,酶解温度为45℃;然后调节牡丹籽粕混合液的pH至8,再加入碱性蛋白酶进行二次酶解,酶解时间为2.5h,酶解温度为50℃,所述中性蛋白酶的添加量为步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的2.5%,所述碱性蛋白酶的添加量为所述步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的2.5%;酶解结束后在,90℃下维持20min灭酶,然后加入保护剂(所述保护剂由柠檬酸和芦荟苷按重量比5:2组成,所述保护剂的添加量为灭酶后的酶解液质量的0.6%),搅拌均匀、喷雾干燥,即得。
实施例3一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,包括如下步骤:
S1、将牡丹籽粕进行研磨粉碎过100目筛,加入牡丹籽粕质量的3倍的去离子水,进行微波处理,微波处理的功率为700W,微波处理的时间5min;
S2、向步骤S1微波处理后的牡丹籽粕混合液中加入步骤S1中的牡丹籽粕重量的1.8%复合助剂,进行均质处理,均质压力为30MPa,均质时间为5min;所述复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇1799和葡甘露聚糖按重量比3:7:2组成;
S3、向步骤S2均质处理后的牡丹籽粕混合液中加入中性蛋白酶进行一次酶解,酶解时间为4h,酶解温度为40℃;然后调节牡丹籽粕混合液的pH至9,再加入碱性蛋白酶进行二次酶解,酶解时间为3h,酶解温度为40℃,所述中性蛋白酶的添加量为步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的3%,所述碱性蛋白酶的添加量为所述步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的2.8%;酶解结束后在,90℃下维持20min灭酶,然后加入保护剂(所述保护剂由柠檬酸和芦荟苷按重量比6:2组成,所述保护剂的添加量为灭酶后的酶解液质量的0.8%),搅拌均匀、喷雾干燥,即得。
对比例1一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
与实施例2相比,对比例1的区别在于,所述步骤S1中未进行微波处理,其他参数和操作与实施例2相同。
对比例2一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
与实施例2相比,对比例2的区别在于,将所述步骤S2的复合助剂中的葡甘露聚糖替换为D-甘露糖,即所述复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇1799和D-甘露糖按重量比2:10:3组成,其他参数和操作与实施例2相同。
对比例3一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
与实施例2相比,对比例3的区别在于,将所述步骤S2的复合助剂中的葡甘露聚糖替换为聚乙烯醇1799,即所述复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇1799按重量比2:13组成,其他参数和操作与实施例2相同。
对比例4一种抗疲劳牡丹肽的制备方法
与实施例2相比,对比例4的区别在于,将所述步骤S3的保护剂中的芦荟苷替换为D-异抗坏血酸钠,即所述的保护剂由柠檬酸和D-异抗坏血酸钠按重量比5:2组成,其他参数和操作与实施例2相同。
试验例一、牡丹肽分子量分布检测
1.试验材料:实施例1~3,对比例1~4制备的抗疲劳牡丹肽。
2.试验方法:采用常规的高效凝胶过滤色谱法分析方法对得到的牡丹肽进行分析,得到的牡丹肽的分子量分布占比如表1所示。
表1
由表1可知,采用本发明实施例1~3所述的方法制得的牡丹肽的平均分子量主要分布在1500Da之内,其中实施例2中小于1500Da区间的分子量占比达到97.8%,分子量大于1500Da的占比仅为2.2%,为本发明的最佳实施例。
而对比例1的步骤S1中未进行微波处理,得到的牡丹肽的分子量大于1500Da的占比为15.6%,对比例2~3中改变了步骤S2中的复合助剂的添加组分时,得到的牡丹肽的分子量大于1500Da的占比有了明显的增加,分别为22.8%和23.6%,这充分说明了本发明采用的牡丹肽的制备方法能有效将牡丹肽的分子量集中在1500Da的区间之内,从而更加有利于人体的吸收。
试验例二、牡丹肽的水解度及蛋白质含量测定
1.试验材料:实施例1~3,对比例1~4制备的牡丹肽。
2.试验方法:分别测定本发明实施例1~3,对比例1~4制备的牡丹肽的水解度和蛋白质含量。水解度的测定方法采用茚三酮比色法测定;
蛋白质的含量的测定方法采用GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行检测。
3.牡丹肽的水解度及蛋白质含量测定如表2所示。
表2
由表2可知,采用本发明实施例1~3所述的方法制得的牡丹肽的水解度均在30%以上,蛋白含量在91%以上,而对比例1的步骤S1中未进行微波处理,对比例2~3中改变了步骤S2中的复合助剂的添加组分时,得到的牡丹肽的水解度和蛋白含量有了较明显的下降,说明采用本发明的牡丹肽的制备方法能有效提高牡丹肽的水解度和蛋白含量。
试验例三、抗氧化性能检测
1.试验材料:本发明实施例1~3和对比例1~4制得的牡丹肽。
2.试验方法:利用对DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力表征实施例1~3和对比例1~5制得的牡丹肽的抗氧化性能。
检测方法如下:首先将本发明实施例1~3和对比例1~4制得的牡丹肽配置成5mg/mL的样品溶液,然后分别取2mL样品,与2mL 0.2mmol/L的DPPH溶液充分混合,室温避光静置30分钟后测定其在517nm处的吸光度A1,然后测定2mL样品与2mL无水乙醇混合溶液在517nm处的吸光度A2,以及2mL无水乙醇与2mL DPPH溶液在517nm处的吸光度A3,计算出DPPH自由基清除率,公式如下:
DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。
DPPH自由基清除率越高表明的抗氧化性能越好。
3.DPPH自由基清除率试验结果如表3所示。
表3
组别 DPPH自由基清除率(%)
实施例1 85.6
实施例2 88.3
实施例3 86.7
对比例1 80.5
对比例2 78.6
对比例3 79.2
对比例4 80.3
由表3可知,采用本发明实施例1~3的所述的方法制得的牡丹肽的DPPH自由基清除率均在85%以上,其中实施例2的DPPH自由基清除率更是高达88.3%,表明采用本发明实施例的方法制得的牡丹肽中的抗氧化物质活性更强,对DPPH自由基的清除作用更优异。
试验例四、抗疲劳效果评价
1.试验材料:本发明实施例1~3和对比例1~4制得的牡丹肽。
2.试验方法:
(1)采用小鼠负重游泳实验进行抗疲劳效果评价测试:
负重游泳实验是研究抗疲劳效能的常用动物模型,检测指标为游泳力竭时间。游泳力竭时间可以有效反映出动物的运动耐力及对不良环境的耐受能力。力竭时间越长,抗疲劳效能越强。
(2)试验步骤:
选择体重为18~22g的雄鼠80只,分为8组,分别为空白对照组和本发明实施例1~3组,对比例1~4组,每组10只。其中实施例1~3组、对比例1~4组按照10g/kg/d的剂量灌胃实施例实施例1~3,对比例1~4制得的牡丹肽,空白对照组灌胃等体积生理盐水,各组每日灌胃1次,连续30d。
在末次给药30min后,将小鼠尾部上端绑上5%体重的铅皮,放入水深30cm,水温(25.0±1)℃的游泳箱内,放入小鼠后开始计时,记录小鼠沉于水面下8s后不能浮出水面的时间作为力竭游泳时间。
所得实验结果如表4所示。
表4
组别 动物数(只) 游泳时间(s)
空白对照组 10 503±92
实施例1组 10 683±81
实施例2组 10 703±79
实施例3组 10 690±121
对比例1组 10 583±119
对比例2组 10 592±72
对比例3组 10 577±80
对比例4组 10 610±92
由表4可知,采用本发明实施例1~3的所述的方法制得的牡丹肽的灌胃小鼠后,小鼠的负重游泳时间明显较对比例1~4组更长,表明本发明制得的牡丹肽能够有效缓解体力疲劳,具有显著的抗疲劳作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将牡丹籽粕进行研磨粉碎,加入去离子水进行微波处理;
S2、向步骤S1微波处理后的牡丹籽粕混合液中加入复合助剂,然后进行均质处理;
S3、向步骤S2均质处理后的牡丹籽粕混合液中加入中性蛋白酶进行一次酶解;然后调节pH,再加入碱性蛋白酶进行二次酶解,然后灭酶,加入保护剂,搅拌均匀、喷雾干燥,即得。
2.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇和葡甘露聚糖按重量比1~3:7~11:2~4组成。
3.如权利要求2所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的复合助剂由大豆卵磷脂、聚乙烯醇和葡甘露聚糖按重量比2:10:3组成,所述聚乙烯醇为聚乙烯醇1799型。
4.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中去离子水的添加量是牡丹籽粕质量的2~3倍;所述步骤S2中的复合助剂的添加量为S1中牡丹籽粕重量的1.0~1.8%。
5.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中牡丹籽粕研磨粉碎过60~100目筛;所述步骤S1中的微波处理的功率为400~700W,微波处理的时间5~10min。
6.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中均质处理的均质压力为20~30MPa,均质时间为5~10min。
7.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中的中性蛋白酶和碱性蛋白酶的添加量均为所述步骤S2所得的牡丹籽粕混合液重量的2%~3%。
8.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中一次酶解时的酶解时间为3~4h,酶解温度为40~50℃;所述步骤S3中二次酶解时调节牡丹籽粕混合液的pH至7~9,酶解时间为2~3h,酶解温度为40~55℃。
9.如权利要求1所述的抗疲劳牡丹肽的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中的保护剂由柠檬酸和芦荟苷按重量比3~6:2组成;所述步骤S3中保护剂的添加量为灭酶后的酶解液质量的0.4~0.8%。
10.一种如权利要求1~9任一项所述的制备方法制得的牡丹肽在制备具有抗疲劳作用食品、保健品中的应用。
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