CN116970033A - 一种酶促自组装分子探针和制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及放射性药物及核医学领域，具体涉及一种酶促自组装分子探针和制备方法及其用途，所述酶促自组装分子探针可以靶向肿瘤并被肿瘤细胞中高表达的碱性磷酸酶特异性酶切，并在肿瘤部位高效自组装形成纳米纤维从而有效富集放射性核素68Ga，增加肿瘤组织中的局部放射性浓度，从而增强肿瘤的PET显像，同时，在其他脏器中快速代谢清除后，其自组装形成的纳米纤维在肿瘤部位代谢较慢，产生长滞留的效应。由此可以得到，所述酶促自组装分子探针不仅PET信号的信噪比高，而且PET显像的时间窗口长，从而进一步增强了显像效果。此外，所述酶促自组装分子探针具有良好的生物相容性，且制备简单、快捷、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及放射性药物及核医学领域，具体涉及一种酶促自组装分子探针和制备方法及其用途。
背景技术
癌症，是一种难以医治的恶性细胞增殖性疾病，是世界各国面临的重要公共卫生问题。早期诊断对治疗癌症、降低死亡率和提高预期寿命至关重要。近年来，各种诊断技术迅猛发展，例如组织病理学、内窥镜检查、血检和影像学检查等。影像学检查作为临床常用诊断工具，可无创、实时、重复地获取肿瘤形态与空间异质性信息，避免侵入性检查可能带来的身体损伤或并发症，改善患者顺应性。其中，正电子发射断层扫描(PET)由于其高灵敏度、良好的空间分辨率以及实时定量监测而备受关注。通过检测放射性示踪剂注射到人体时发射的伽马射线，PET显像不仅可快速获得多层面断层影象、三维定量结果以及三维全身扫描，而且还可以从分子水平动态观察到药物在人体内的生理生化变化，更早期、更灵敏、更准确地诊断和指导肿瘤治疗。迄今为止，已经报道了多种用于肿瘤诊断的放射性示踪剂，包括代谢显像剂、受体类显像剂、乏氧显像剂和凋亡显像剂等。然而，大多数放射性示踪剂存在特异性低，易于从靶点快速清除，显像时间窗口短等不足，这限制了PET显像在肿瘤诊断中的应用。为了增强肿瘤的PET显像，开发具有更高特异性和更长肿瘤滞留时间的放射性示踪剂至关重要。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酶促自组装分子探针和制备方法及其用途。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种酶促自组装分子探针，其结构式如下所示：
一种酶促自组装分子探针前体，其结构式如下所示：
一种所述的酶促自组装分子探针前体的制备方法，包括如下步骤：
S1、将化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH偶联到固相载体2-氯三苯甲基氯树脂上，随后加入封端试剂进行封端，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物1；
S2、将化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH偶联到化合物1上，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物2；
S3、将化合物Fmoc-Thr-OH偶联到化合物2上，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物3；
S4、将化合物Fmoc-Thr-OH偶联到化合物3上，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物4；
S5、将棕榈酸偶联到化合物4上，然后脱除Dde基团，得到化合物5；
S6、将DOTA(OtBu)3偶联到化合物5上，然后加入切肽试剂进行切肽，得到化合物6；
S7、向化合物6中加入tBu基团脱保护试剂，脱除tBu保护基团，得到化合物PA-DOTA-ALP；其合成路线如下：
可选的，在S1步骤中，将化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入活化的固相载体2-氯三苯甲基氯树脂中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入封端试剂，通惰性气体反应0.5～1小时进行封端，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物1；
和/或，在S2步骤中，将化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物1中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物2；
和/或，在S3步骤中，将化合物Fmoc-Thr-OH、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物2中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物3；
和/或，在S4步骤中，将化合物Fmoc-Thr-OH、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物3中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物4；
和/或，在S5步骤中，将化合物棕榈酸、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物4中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Dde基团的溶液，通惰性气体反应5～10分钟进行脱除Dde基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物5；
和/或，在S6步骤中，将化合物DOTA(OtBu)3、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物5中，通惰性气体反应6～8小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，然后加入切肽试剂，通惰性气体反应1～3分钟，重复切肽步骤4～6次；
和/或，在S7步骤中，加入tBu基团脱保护试剂后，通惰性气体，在20～25℃水浴反应3～4小时进行tBu基团脱保护，重复tBu基团脱保护步骤3～4次。
可选的，在所述脱除Fmoc保护基团步骤中，采用含体积百分比20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团；
和/或，所述偶联试剂为HOBT和HBTU；
和/或，所述pH调节剂为DIEA；
和/或，在所述脱除Dde基团步骤中，采用含体积百分比2％水合肼的DMF溶液脱除Dde基团；
和/或，所述tBu基团脱保护试剂为含体积百分比50％三氟乙酸的DCM溶液；
和/或，所述切肽试剂为含体积百分比1％三氟乙酸的DCM溶液；
和/或，所述封端试剂为体积百分比40％甲醇的DMF溶液。
可选的，在S1步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH、pH调节剂和DMF溶剂的比例为(400～500)：(250～300)：(0.3～0.4)：(15～25)，比例关系为mg：mg：ml：ml；
和/或，在S1步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂和封端试剂的比例为(400～500)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S1步骤中，化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为(250～300)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S2步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(250～300)：(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S2步骤中，化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为(250～300)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S3或S4步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Thr-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(150～220):(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S3或S4步骤中，化合物Fmoc-Thr-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为(150～220)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S5步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、棕榈酸、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(110～160)：(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S5步骤中，棕榈酸和脱除Dde基团的溶液的比例为(110～160):(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S6步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、DOTA(OtBu)3、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(180～240)：(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S6步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂和切肽试剂的比例为(400～500)：(20～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S7步骤中，化合物6和tBu基团脱保护试剂的比例为(180～240)：(20～30)，比例关系为mg：ml。
一种所述的酶促自组装分子探针的制备方法，包括如下步骤：
将权利要求2所述的酶促自组装分子探针前体或权利要求3-6任一项所述的酶促自组装分子探针前体制备方法制备得到的酶促自组装分子探针前体进行68Ga标记，得到化合物[68Ga]PA-DOTA-ALP；其合成路线如下：
可选的，所述68Ga标记方法为，取68Ga洗脱液，加酸性溶液，调pH值至4～5，得到68Ga混合溶液，然后加入化合物PA-DOTA-ALP的水溶液中，在90～95℃下加热反应5～10分钟；
可选的，所述68Ga混合溶液中放射性强度为1.6～2.4mCi；
可选的，所述化合物PA-DOTA-ALP的水溶液浓度为1～2mg/mL；
可选的，所述68Ga溶液和所述化合物PA-DOTA-ALP的水溶液的体积比为(10～15)：(0.8～1.2)。
一种所述的酶促自组装分子探针在制备靶向肿瘤的PET示踪剂中的用途。
一种PET示踪剂，含有所述的酶促自组装分子探针；
可选的，还包含所述的酶促自组装分子探针前体。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的一种酶促自组装分子探针，简称为[68Ga]PA-DOTA-ALP，包含3个功能性单元：1)自组装单元，即棕榈酸-Thr-Thr部分，为水凝胶成胶因子，通过氢键作用，能够自组装形成超分子水凝胶；2)靶向识别单元，即Tyr(H2PO3)部分，结构中含有碱性磷酸酶的酶切底物磷酸基，由于肿瘤微环境中具有高表达的碱性磷酸酶，进而靶向识别单元可以主动靶向肿瘤区域，并被肿瘤细胞中高表达的碱性磷酸酶(ALP)特异性酶切；3)信号报告单元，即Lys(DOTA-68Ga)-OH部分，结构中含有一个十二元四氮杂大环配体(DOTA)，可以和68Ga发生络合反应产生PET信号；上述的酶促自组装分子探针可以充分发挥靶向识别、自组装和信号报告3个功能，可以靶向肿瘤并被肿瘤细胞中高表达的碱性磷酸酶特异性酶切并去除磷酸基团，转化为疏水性分子棕榈酸-Thr-Thr-Tyr-Lys(DOTA-68Ga)-OH(简称为[68Ga]PA-DOTA)。在疏水性和氢键相互作用下，[68Ga]PA-DOTA在肿瘤部位高效自组装形成纳米纤维[68Ga]PA-DOTA-NFs，这些在肿瘤原位形成的纳米纤维[68Ga]PA-DOTA-NFs能够有效富集放射性核素68Ga，增加肿瘤组织中的局部放射性浓度，从而增强肿瘤的PET显像。同时，当探针[68Ga]PA-DOTA-ALP在其他脏器中快速代谢清除后，其自组装形成的纳米纤维[68Ga]PA-DOTA-NFs在肿瘤部位代谢较慢，产生长滞留的效应。由此可以得到，所述酶促自组装分子探针不仅PET信号的信噪比高，而且PET显像的时间窗口长，从而进一步增强了显像效果；
进一步的，相比采用18F标记存在的标记过程繁琐、放射性核素使用量大、所需回旋加速器价格昂贵以及需要较大的场地和复杂的配套设施等缺陷，本发明的酶促自组装分子探针采用68Ga标记，68Ga仅需由盐酸溶液淋洗68Ge-68Ga发生器即可产生，成本低廉，通过络合反应进行标记，标记条件简单，无需纯化即可使用，便于药盒化用于临床应用。同时，68Ga的半衰期为68分钟，与很多放射性药物的药代动力学特性一致，因而具有较好的生物相容性。此外，68Ga较短的半衰期有助于降低患者承受的辐照剂量，最大限度降低对患者机体的伤害。
2.本发明提供的酶促自组装分子探针的制备方法，所述68Ga标记方法为，取68Ga洗脱液，加酸性溶液，调pH值至4～5，得到68Ga混合溶液然后加入化合物PA-DOTA-ALP的水溶液中，在90～95℃下加热反应5～10分钟；上述制备方法步骤简单，时间短。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中PA-DOTA-ALP的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1中PA-DOTA-ALP的质谱图；
图3是本发明实施例1中PA-DOTA-ALP的1H NMR图；
图4是本发明实施例1中PA-DOTA-ALP的13C NMR图；
图5是本发明实施例1中PA-DOTA-ALP的31P NMR图；
图6是本发明实施例2中[68Ga]PA-DOTA-ALP的放射性高效液相色谱图；
图7是本发明对比例1中PA-DOTA的高效液相色谱图；
图8是本发明对比例1中PA-DOTA的质谱图；
图9是本发明对比例1中PA-DOTA的1H NMR图；
图10是本发明对比例1中PA-DOTA的13C NMR图；
图11是本发明对比例2中[68Ga]PA-DOTA的放射性高效液相色谱图；
图12是本发明实验例1中[68Ga]PA-DOTA-ALP在PBS中孵育1、2和3小时后的稳定性；
图13是本发明实验例1中[68Ga]PA-DOTA-ALP在FBS中孵育1、2和3小时后的稳定性；
图14是本发明实验例1中[68Ga]PA-DOTA在PBS中孵育1、2和3小时后的稳定性；
图15是本发明实验例1中[68Ga]PA-DOTA在FBS中孵育1、2和3小时后的稳定性；
图16是本发明实验例2中PA-DOTA-ALP的水凝胶化和细胞实验结果图；图中，a图为共孵育组的水凝胶化观察图；b图为对照组的水凝胶化观察图；c图为共孵育组和对照组的PA-DOTA的HPLC检测结果；d图为共孵育组的水凝胶的TEM图像；e图为共孵育组的水凝胶在1.0％应力下的动态频率扫描；f图为PA-DOTA-ALP和PA-DOTA在200μM作用浓度下对HeLa细胞的细胞毒性实验结果，结果以平均值±SD表示；n＝3次独立实验；g图为[68Ga]PA-DOTA-ALP或[68Ga]PA-DOTA对HeLa细胞的细胞摄取实验结果；
图17是本发明实验例2中共孵育组的水凝胶的纳米纤维直径分布柱状图；
图18是本发明实验例2中共孵育组的水凝胶1.0Hz频率下的动态应力扫描图；
图19是本发明实验例2中PA-DOTA-ALP和PA-DOTA在50μM作用浓度下对HeLa细胞的细胞毒性实验结果；结果以平均值±SD表示；n＝3次独立实验；
图20是本发明实验例2中PA-DOTA-ALP和PA-DOTA在100μM作用浓度下对HeLa细胞的细胞毒性实验结果；结果以平均值±SD表示；n＝3次独立实验；
图21是本发明实验例3中荷瘤裸鼠体内micro-PET显像实验结果；图中a图为共注射组、单注射组和对照组在0.5、1、1.5、2、2.5和3小时的PET图像；b图为共注射组、单注射组和对照组的肿瘤摄取率；c图为单注射组和对照组的肿瘤摄取率比；d图为共注射组和单注射组的肿瘤摄取率比；
图22是本发明实验例3中生物分布实验结果；图中a图为对照组、单注射组和对照组注射1小时后在HeLa荷瘤裸鼠体内的生物分布；b图为对照组、单注射组和对照组注射后1小时和2小时的肿瘤对肌肉(T/M)的放射性摄取率比；c图为对照组、单注射组和对照组注射2小时后在HeLa荷瘤裸鼠体内的生物分布；d图为对照组、单注射组和对照组注射后1小时和2小时的肿瘤对肝脏(T/L)的放射性摄取率比；
图23是本发明实验例3中药代动力学研究结果；
图24是本发明实验例3中分子探针对活体动物组织的毒性的实验结果；
图25是本发明实验例3中分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP和分子探针前体共注射的工作原理图；图中a图为分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP和分子探针前体的形成纳米纤维的原理；b图为分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP和分子探针前体共注射小鼠体内的PET成像原理。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
HOBT中文名称为1-羟基苯并三唑；
HBTU中文名称为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；
DIEA中文名称为N,N-二异丙基乙胺；
DMF中文名称为N,N-二甲基甲酰胺；
DCM中文名称为二氯甲烷。
实施例1化合物PA-DOTA-ALP的制备
本实施例提供了酶促自组装分子探针前体PA-DOTA-ALP的制备方法，其合成路线如下：
化合物PA-DOTA-ALP(结构简式：棕榈酸-Thr-Thr-Tyr(H2PO3)-Lys(DOTA)-OH)采用标准的固相多肽合成(SPPS)策略，具体制备方法如下：
(1)、化合物1的制备
在50mL多肽固相合成管中加入450mg 2-氯三苯甲基氯树脂和20mL DMF，通氮气溶胀30分钟，使2-氯三苯甲基氯树脂充分活化。活化完成后，排空合成管内DMF。加入287.62mgFmoc-Lys(Dde)-OH、20mL DMF和300μL DIEA，通氮气反应1小时。排空反应液，15mL DMF洗涤3次。加入15mL含40％(体积百分比)甲醇的DMF溶液进行封端，通氮气反应30分钟，封闭2-氯三苯甲基氯树脂上未反应的活性位点。封端完成后，排空反应液，15mL DMF洗涤3次。加入15mL含20％(体积百分比)哌啶的DMF溶液，通氮气反应30分钟，脱除Fmoc保护基。排空反应液，15mL DMF洗涤3次，得到化合物1。
(2)、化合物2的制备
向步骤(1)中获得的化合物1中加入261.06mg Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、20mL DMF、300μL DIEA、72.97mg HOBT和204.80mg HBTU，通氮气反应1小时。排空反应液，15mL DMF洗涤3次。加入15mL含20％(体积百分比)哌啶的DMF溶液，通氮气反应30分钟，脱除Fmoc保护基。排空反应液，15mL DMF洗涤3次，得到化合物2。
(3)、化合物3的制备
向步骤(2)中获得的化合物2中加入184.34mg Fmoc-Thr-OH、20mL DMF、300μLDIEA、72.97mg HOBT和204.80mg HBTU，通氮气反应1小时。排空反应液，15mL DMF洗涤3次。加入15mL含20％(体积百分比)哌啶的DMF溶液，通氮气反应30分钟，脱除Fmoc保护基。排空反应液，15mL DMF洗涤3次，得到化合物3。
(4)、化合物4的制备
向步骤(3)中获得的化合物3中加入184.34mg Fmoc-Thr-OH、20mL DMF、300μLDIEA、72.97mg HOBT和204.80mg HBTU，通氮气反应1小时。排空反应液，15mL DMF洗涤3次。加入15mL含20％(体积百分比)哌啶的DMF溶液，通氮气反应30分钟，脱除Fmoc保护基。排空反应液，15mL DMF洗涤3次，得到化合物4。
(5)、化合物5的制备
向步骤(4)中获得的化合物4中加入138.47mg棕榈酸、20mL DMF、300μL DIEA、72.97mg HOBT和204.80mg HBTU，通氮气反应1小时。排空反应液，15mL DMF洗涤3次。加入15mL含2％(体积百分比)水合肼的DMF溶液，通氮气反应5分钟，脱除Dde保护基。排空反应液，15mL DMF洗涤3次，得到化合物5。
(6)、化合物6的制备
向步骤(5)中获得的化合物5中加入218.39mg DOTA(OtBu)3、20mL DMF、300μLDIEA、72.97mg HOBT和204.80mg HBTU。通氮气反应6小时。排空反应液，依次用15mL DMF、15mL异丙醇、15mL正己烷洗涤3次。加入20mL含1％(体积百分比)三氟乙酸的DCM溶液(切肽试剂)，通氮气反应1分钟，用300mL茄形瓶收集切肽液。重复切肽操作5次，得到化合物6。
(7)、化合物PA-DOTA-ALP的制备
向步骤(6)中获得的化合物6中加入含50％(体积百分比)三氟乙酸的DCM溶液20mL，氮气保护，25℃水浴反应3小时，脱除tBu保护基，重复所述脱除tBu保护基步骤3次。旋转蒸发反应液，得到油状液体。加入100mL冰乙醚，析出白色沉淀，离心去除上清液，得到白色固体。冷冻干燥6小时，得到化合物PA-DOTA-ALP。然后经HPLC纯化，HPLC的色谱条件为：色谱柱为Waters XBridge Peptide BEH C18柱；等度洗脱，水：乙腈＝45％：55％(体积百分比)，乙腈中含0.1％(体积百分比)的三氟乙酸，保留时间9.1分钟；得到352.74mg纯品PA-DOTA-ALP，高效液相色谱图为图1。所述PA-DOTA-ALP的MS:C55H94N9O19P[(M-H)-]:1215.64；ESI-MS:m/z 1214.98，见图2。其1H NMR图如图3所示，13C NMR图如图4所示，31P NMR图如图5所示。
实施例2[68Ga]PA-DOTA-ALP的制备
本实施例利用实施例1获得的PA-DOTA-ALP制备[68Ga]PA-DOTA-ALP，其合成的路线如下：
具体制备方法如下：
使用0.05M盐酸淋洗68Ge/68Ga发生器得到68Ga洗脱液。在800μL的68Ga洗脱液中加入200μL 0.25M乙酸钠溶液，将pH值调节至4～5，得到的混合液中放射性强度为1.6～2.4mCi。然后加入80μL溶于水的PA-DOTA-ALP(1mg/mL)。混合物在95℃下加热反应5分钟。使用放射性HPLC检测反应液，放射性HPLC检测的方法为：色谱柱为Waters XBridge C18柱；梯度洗脱，水：乙腈＝(60％～10％)：(40％～90％)(体积百分比)，乙腈中含0.1％(体积百分比)的三氟乙酸，保留时间11.8分钟，放射化学纯度高于97％，见图6。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
(1)化合物1的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂为400mg，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH、pH调节剂和DMF溶剂的比例为400：250:0.3:15，比例关系为mg：mg：ml：ml，通氮气反应1.2小时进行偶联；
封端时，2-氯三苯甲基氯树脂和封端试剂的比例为400：15，比例关系为mg：ml；通氮气反应0.8小时进行封端；
脱除Fmoc保护基团时，化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为250:15，比例关系为mg：ml；通氮气反应0.8小时进行脱除Fmoc保护基团。
(2)化合物2的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为400：250:0.3:15：60:170，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应1.2小时进行偶联；
脱除Fmoc保护基团时，化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为250:15，比例关系为mg：ml；通氮气反应0.8小时进行脱除Fmoc保护基团。
(3)化合物3和化合物4各自的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Thr-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为400：150:0.3:15：60:170，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应1.2小时进行偶联；
脱除Fmoc保护基团时，化合物Fmoc-Thr-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为150:15，比例关系为mg：ml；通氮气反应0.8小时进行脱除Fmoc保护基团。
(5)化合物5的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、棕榈酸、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为400：110:0.3:15：60:170，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应1.2小时进行偶联；
脱除Dde基团时，棕榈酸和脱除Dde基团的溶液的比例为110:15，比例关系为mg：ml；通氮气反应8分钟进行脱除Dde基团。
(6)化合物6的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、DOTA(OtBu)3、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为400：180:0.3:15：60:170，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应7小时进行偶联；
切肽时，2-氯三苯甲基氯树脂和切肽试剂的比例为400：20，比例关系为mg：ml；通氮气反应2分钟，重复切肽步骤4次；
(7)化合物PA-DOTA-ALP的制备中：
向步骤(6)中获得的化合物6中加入含50％(体积百分比)三氟乙酸的DCM溶液25mL；通氮气，在20℃水浴反应4小时进行tBu基团脱保护，重复tBu基团脱保护步骤4次；化合物PA-DOTA-ALP的HPLC纯化方法同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
(1)化合物1的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂为500mg，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH、pH调节剂和DMF溶剂的比例为500：300:0.4:25，比例关系为mg：mg：ml：ml，通氮气反应1.5小时进行偶联；
封端时，2-氯三苯甲基氯树脂和封端试剂的比例为500：25，比例关系为mg：ml；通氮气反应1小时进行封端；
脱除Fmoc保护基团时，化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为300:25，比例关系为mg：ml；通氮气反应1小时进行脱除Fmoc保护基团。
(2)化合物2的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为500：300:0.4:25：90:230，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应1.5小时进行偶联；
脱除Fmoc保护基团时，化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为300:25，比例关系为mg：ml；通氮气反应1小时进行脱除Fmoc保护基团。
(3)化合物3和化合物4各自的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Thr-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为500：220:0.4:25：90:230，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应1.5小时进行偶联；
脱除Fmoc保护基团时，化合物Fmoc-Thr-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为220:25，比例关系为mg：ml；通氮气反应1小时进行脱除Fmoc保护基团。
(5)化合物5的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、棕榈酸、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为500：160:0.4:25：90:230，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应1.5小时进行偶联；
脱除Dde基团时，棕榈酸和脱除Dde基团的溶液的比例为160:25，比例关系为mg：ml；通氮气反应10分钟进行脱除Dde基团。
(6)化合物6的制备中：
2-氯三苯甲基氯树脂、DOTA(OtBu)3、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为500：240:0.4:25：90:230，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；通氮气反应8小时进行偶联；
切肽时，2-氯三苯甲基氯树脂和切肽试剂的比例为500：25，比例关系为mg：ml；通氮气反应3分钟，重复切肽步骤6次；
(7)化合物PA-DOTA-ALP的制备中：
向步骤(6)中获得的化合物6中加入含50％(体积百分比)三氟乙酸的DCM溶液30mL；通氮气，在30℃水浴反应4小时进行tBu基团脱保护，重复tBu基团脱保护步骤4次；化合物PA-DOTA-ALP的HPLC纯化方法同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例2的区别在于：
使用0.05M盐酸淋洗68Ge/68Ga发生器得到68Ga洗脱液。在1050μL的68Ga洗脱液中加入450μL 0.25M乙酸钠溶液，将pH值调节至4～5，得到的混合液中放射性强度为1.6～2.4mCi。然后加入120μL实施例3的PA-DOTA-ALP(2mg/mL)的水溶液。混合物在90℃下加热反应10分钟。
实施例6
本实施例与实施例2的区别在于：
使用0.05M盐酸淋洗68Ge/68Ga发生器得到68Ga洗脱液。在950μL的68Ga洗脱液中加入350μL 0.25M乙酸钠溶液，将pH值调节至4～5，得到的混合液中放射性强度为1.6～2.4mCi。然后加入100μL实施例4的PA-DOTA-ALP(2mg/mL)的水溶液。混合物在93℃下加热反应8分钟。
对比例1化合物PA-DOTA的制备
本对比例提供了化合物PA-DOTA的制备方法，所述化合物PA-DOTA(结构简式为：棕榈酸-Thr-Thr-Tyr-Lys(DOTA)-OH)的结构式如下：
其合成路线与实施例1中的化合物PA-DOTA-ALP的合成路线和制备方法的区别仅在于，在步骤(2)中，将反应原料Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH等摩尔的替换为Fmoc-Tyr-OH。最终得到的化合物PA-DOTA经HPLC纯化(纯化方法同化合物PA-DOTA-ALP)得到397.48mg纯品PA-DOTA，高效液相色谱图见图7。MS:C55H93N9O16[(M-H)-]:1135.67；ESI-MS:m/z 1134.93，如图8所示。其1H NMR图如图9所示，13C NMR图如图10所示。
对比例2[68Ga]PA-DOTA
本对比例利用对比例1获得的PA-DOTA制备[68Ga]PA-DOTA，其合成的路线如下：
制备方法如下：
本对比例与实施例2的区别仅在于：加入20μL溶于水的PA-DOTA(1mg/mL)。使用放射性HPLC检测反应液，放射性HPLC检测的方法为同[68Ga]PA-DOTA-ALP，保留时间12.8分钟，放射化学纯度高于98％，见图11。
实验例1稳定性和脂水分配系数
(1)稳定性
本实验考察了[68Ga]PA-DOTA-ALP在生理条件下的化学稳定性，在磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)和胎牛血清(FBS)中进行稳定性试验。将[68Ga]PA-DOTA-ALP加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.4)和胎牛血清(FBS)，分别配制成放射性浓度为2～3mCi/mL的溶液，在37℃共孵育0、1、2、3小时，采用实施例2中的HPLC色谱条件测定放射化学纯度，结果如图12和图13所示，与PBS或FBS在37℃共孵育3小时后，[68Ga]PA-DOTA-ALP的放射化学纯度仍高于97％，没有新的杂质峰产生。
考虑到[68Ga]PA-DOTA-ALP在肿瘤部位会被酶切转化为[68Ga]PA-DOTA，进一步验证了[68Ga]PA-DOTA的稳定性，稳定性试验同上述[68Ga]PA-DOTA-ALP，结果如图14和图15所示，在3小时内，[68Ga]PA-DOTA在PBS和FBS溶液中均未产生任何杂质峰。
综上，上述稳定性实验结果表明本发明的分子探针及其酶切产物的化学结构非常稳定。它们可以在生理相似条件下保持自身结构不变，为酶促自组装提供了一个重要的前提条件。
(2)脂水分配系数
酶促自组装的关键在于酶切前后分子探针亲水性的明显变化。即，在酶切前，分子探针具有较高的亲水性，而在酶切后，分子探针上的磷酸基被去除，导致亲水性明显降低。为了研究酶切前后分子探针亲水性的变化，本实验在水和正丁醇的混合溶液中进行了实验。具体的实验方法为：在5mL离心管中加入100μL[68Ga]PA-DOTA-ALP(放射性剂量150～300μCi)、1mL正辛醇和900μL灭菌水。超声震荡2分钟，离心5分钟。取100μL正丁醇和100μL灭菌水，使用伽马计数仪进行检测。脂水分配系数Log P＝Log(正丁醇伽马计数)/(灭菌水伽马计数)。
结果为，[68Ga]PA-DOTA-ALP和[68Ga]PA-DOTA的脂水分配系数(Log P)分别为0.14±0.01和0.99±0.08。酶切后，分子探针的亲水性降低了约90％，与所预期的变化一致，这种变化有利于触发自组装。
实验例2PA-DOTA-ALP的水凝胶化和细胞实验
(1)水凝胶化
为了验证分子探针形成水凝胶的能力，使用前体PA-DOTA-ALP进行了ALP介导的体外酶切实验。简而言之，将20mg PA-DOTA-ALP固体粉末溶解在2mL PBS中，然后将pH值调至7.4，得到澄清透明的溶液(1.0wt％)。然后将该溶液平均分成两组(1mL)，共孵育组(加入200U ALP)，对照组(不加入200U ALP)，并在37℃下孵育3小时。
结果如图16中a图和b图所示，a图为PA-DOTA-ALP与ALP的共孵育组，图中可以看到形成了透明的水凝胶，而b图为不含ALP的对照组，可以看到处于溶液状态(尤其是图中位于底部的横置的试剂瓶可以看到)。
采用HPLC检测(检测方法同对比例1中)上述两组中的PA-DOTA，对比例1中的PA-DOTA作为参照品，结果图16中c图显示，共孵育组中在10分钟后产生PA-DOTA峰，经过计算总共有95.1％(体积百分比)的PA-DOTA-ALP被转化为PA-DOTA，而对照组则在10分钟后未产生PA-DOTA峰，说明PA-DOTA-ALP未被转化为PA-DOTA。
为了更深入地了解自组装过程，使用透射电子显微镜(TEM)在纳米尺度上观察了共孵育组的水凝胶的形态结构，结果如图16中d图所示，水凝胶由许多细长的纳米纤维组成，这些纳米纤维密集排列在网络中，检测水凝胶的直径，结果如图17所示，其平均直径为20.28±3.54nm。
测试了共孵育组的水凝胶的粘弹性能。为了确定动态频率扫描的适当条件，首先对水凝胶进行了动态应力扫描(1.0Hz频率)，结果如图18所示，在0.1％至10％的应力范围内，储能模量(G')和损耗模量(G”)值之间存在弱相关性，并且G'值大于G”值，这证实了水凝胶的形成。在应力幅度的线性响应范围内，选择在1.0％的应力下进行了动态频率扫描，结果如图16中e图所示，在0.1Hz至10Hz的频率范围内，水凝胶的G'值和G”值缓慢增加，其G'值超过G”值的3倍，表明水凝胶对外部剪切应力具有良好的耐受性。这些结果有力地表明了本发明的分子探针可以被碱性磷酸酶高效酶切，然后迅速自组装成具有良好粘弹性的水凝胶。
(2)细胞毒性实验
为了验证本发明的分子探针的生物相容性，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分析法测定化合物对HeLa细胞的细胞毒性。将HeLa细胞接种在96孔板中，每孔加入100μL的细胞悬浮液，细胞密度为5×104个/mL。37℃孵育过夜后，分别将不同浓度(0、50、100和200μM)的PA-DOTA-ALP和PA-DOTA溶液加入到96孔板中，每孔加入100μL。在37℃下分别培养6、12和24小时后，在96孔板中分别加入10μL的CCK-8(5mg/mL)，继续培养4小时。最后，使用酶联免疫检测仪(BioTek)检测450nm处的吸光度值以测定细胞的存活率＝(样品的吸光度值)/(空白基质的吸光度值)。
结果如图16中f图所示，HeLa细胞与PA-DOTA-ALP或PA-DOTA在200μM的浓度下共孵育6、12和24小时后，HeLa细胞的细胞活力仍然高于97％，同样如图19和图20所示，HeLa细胞与PA-DOTA-ALP或PA-DOTA在50、100μM的浓度下共孵育6、12和24小时后，HeLa细胞的细胞活力仍然高于98％和97％。以上表明PA-DOTA-ALP和PA-DOTA对HeLa细胞的毒性较低。细胞毒性结果证明了本发明的分子探针具有良好的生物相容性。
(3)细胞摄取实验
为了验证本发明的分子探针靶向ALP高表达的肿瘤细胞的潜力，进行了细胞摄取实验。选择人宫颈癌细胞系HeLa作为本实验中ALP高表达肿瘤细胞的模型。将HeLa细胞接种在24孔板中，每孔接种约30万-50万个细胞。37℃孵育过夜后，每个孔分别加入标记液(含[68Ga]PA-DOTA-ALP或[68Ga]PA-DOTA的新鲜培养基(放射性剂量为2～4μCi))替换，并孵育0.5、1、1.5、2、2.5和3小时。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍后，用消化液消化细胞，收集细胞悬浮液。用伽马计数器测量细胞悬浮液和每孔加入的标记液的放射性强度。计算细胞悬浮液与每孔加入的标记液的初始放射性计数比值，分别得到HeLa细胞对两种分子探针的摄取率。
结果如图16中g图所示，HeLa细胞对分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP和对照探针[68Ga]PA-DOTA的摄取率均随时间逐渐增加，并在2小时后趋于稳定。具体而言，[68Ga]PA-DOTA-ALP的细胞摄取率从0.5小时的3.64±0.28％增加到2小时的6.44±0.48％。[68Ga]PA-DOTA的细胞摄取率从0.5小时的0.86±0.40％增加到2小时的2.03±1.06％。可以看出，[68Ga]PA-DOTA-ALP的细胞摄取率明显大于[68Ga]PA-DOTA的细胞摄取率。这主要是由于分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP具有靶向ALP的磷酸基团，导致其能被HeLa细胞高摄取。而对照探针[68Ga]PA-DOTA没有磷酸基团，因此HeLa细胞的摄取率相对较低。上述细胞摄取实验很好地证明了本发明分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP具有靶向ALP高表达的肿瘤细胞的出色能力。
实验例3动物实验
1、动物肿瘤模型构建
所有实验动物均购自卡文斯，并饲养在SPF级动物房。使用雌性裸鼠(20-25g，5-6周龄)建立HeLa肿瘤模型。在接种前，将HeLa细胞在细胞培养瓶中培养至生长对数期。将细胞密度为5×107个/mL的细胞悬浮液接种于小鼠右侧皮下(每只200μL)。喂养小鼠4-6周后，HeLa肿瘤的直径达到约5-10毫米，表明HeLa肿瘤模型已经建立。根据江苏省原子医学研究所伦理委员会制定的原则，将这些模型用于体内动物实验(IACUC编号：JSINM-2022-056、JSINM-2022-058和JSINM-2023-003)。
2、体内micro-PET显像
PET显像是使用Inveon microPET扫描仪进行的。在整个扫描过程中，用2％的异氟烷麻醉负荷HeLa异种移植物的裸鼠，氧气流速为0.8升/分钟。经尾静脉对裸鼠(每组n＝3只)分别注射[68Ga]PA-DOTA(放射性剂量150～300μCi)对照组、[68Ga]PA-DOTA-ALP(放射性剂量150～300μCi)单注射组和[68Ga]PA-DOTA-ALP(放射性剂量150～300μCi)+PA-DOTA-ALP(40mmol/kg)共注射组。分别在注射后0.5、1、1.5、2、2.5和3小时收集PET静态图像(10分钟)。使用OSEM 3D/MAP算法进行重建，无衰减校正，然后用Inveon Research Workplace进行处理。为了评估肿瘤内的平均信号水平，使用ASIPro VM软件对肿瘤感兴趣区(ROI)进行勾画和计算。
PET图像结果如图21中a图所示，对照组在肿瘤部位的PET信号非常微弱，和周围的组织没有形成很好的区分。单注射组([68Ga]PA-DOTA-ALP)在肿瘤部位的PET信号缓慢增加，在2小时后才观察到明显的PET信号。共注射组仅注射1小时后就可清晰地观察到肿瘤部位的显著的PET信号，并且信号强度随时间不断增加。在整个显像过程中，共注射组展现出比单注射组更明显的PET信号，说明共注射前体后显著增强了分子探针对肿瘤的成像效果。
PET图像的感兴趣区域(ROI)分析结果如图21中b图所示(图中曲线沿纵坐标负向方向，依次对应共注射组、单注射组、对照组)，对照组的肿瘤摄取率最低，仅在1.72～2.10％ID/g的窄小范围内波动。单注射组的肿瘤摄取率从0.5小时的2.39±0.08％ID/g缓慢增加到3小时的3.24±0.24％ID/g。共注射组的肿瘤摄取率从0.5小时的2.72±0.15％ID/g显著增加到3小时的4.41±0.24％ID/g。
根据PET图像的感兴趣区域(ROI)分析，单注射组与对照组的肿瘤摄取率比的结果如图21中c图所示，单注射组的肿瘤摄取率平均是对照组的1.4倍。这与细胞摄取实验的结果相符，且更直观地说明了分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP对ALP高表达的HeLa肿瘤的良好的特异性。共注射组与单注射组的肿瘤摄取率比的结果如图21中d图所示，共注射组的肿瘤摄取率平均是单注射组的1.2倍，最大比值为3小时的1.36±0.06。共注射前体后提高了肿瘤部位自组装分子的浓度，促进了纳米纤维的生成，使得更多探针分子聚集并滞留于肿瘤部位，最终增强了肿瘤的PET信号，共注射组的工作原理也可以参照图25，从图25中a图可以看到，[68Ga]PA-DOTA-ALP和PA-DOTA-ALP经过碱性磷酸酶特异性酶切，分别获得[68Ga]PA-DOTA和PA-DOTA，[68Ga]PA-DOTA和PA-DOTA可自组装成纳米纤维，在b图中也可以看到，[68Ga]PA-DOTA-ALP(图中带红点的波浪线)和PA-DOTA-ALP(图中带黑点的波浪线)富集在肿瘤细胞内，被肿瘤细胞内的碱性磷酸酶特异性酶切，从而可得到[68Ga]PA-DOTA和PA-DOTA进行自组装，形成更多的纳米纤维滞留于肿瘤细胞，从而增强了肿瘤的PET信号。此外，还观察到肿瘤的PET信号在3小时内持续上升，这应该是纳米纤维的长滞留效应导致的。
3、生物分布和药代动力学研究
为了研究探针[68Ga]PA-DOTA-ALP在体内的分布与代谢情况，进行了生物分布和药代动力学研究。实验方法为：负荷HeLa异种移植物的裸鼠(每组n＝3只)经尾静脉分别注射上述对照组、单注射组、共注射组(各组剂量与“2、体内micro-PET显像”中相同)。分别在给药后1和2小时解剖裸鼠。对收集的样本进行清洗、称重，然后使用伽马计数器进行计数，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肿瘤、肌肉、骨骼、胃和肠。组织摄取率以每克组织注射的放射性剂量百分比表示(％ID/g)。对于药代动力学研究，使用伽马计数器分别在给药后1、5、10、30、60、120、240、360和480分钟测定血样中的放射性。
生物分布结果如图22中a图和c图所示，与对照组和单注射组相比，共注射PA-DOTA-ALP后，肿瘤对探针的摄取量明显增加。肿瘤摄取量在1小时内从1.96±0.15％ID/g增加到3.48±0.20％ID/g，2小时内从1.94±0.09％ID/g增加到3.67±0.13％ID/g。这与PET成像的结果完全一致，从另一个角度证明了采用共注射策略可以增强肿瘤的PET显像效果。如图22中b图所示，共注射组的肿瘤对肌肉的放射性摄取比远高于单注射组(1小时为2.63±0.47vs.1.73±0.16，2小时为2.94±0.42vs.2.18±0.17)。同样，共注射组的肿瘤对肝脏的放射性摄取比也明显高于单注射组(1小时为0.49±0.07vs.0.23±0.03，2小时为0.58±0.07vs.0.28±0.03)(图22中d图)。上述结果表明，共注射策略明显优于单注射策略，可以带来更好的体内PET显像效果。
药代动力学研究结果如图23所示，[68Ga]PA-DOTA-ALP具有较长的循环半衰期，在共注射组和单注射组中，分别为387.6分钟和276.1分钟。通过简单计算可以得出，共注射组的半衰期约为单注射组的1.4倍，这可能是由于探针经酶切后自组装成纳米纤维而产生的长滞留导致的，由此带来了PET显像时间窗口的延长。
4、分子探针对活体动物组织的毒性
本实验用苏木素-伊红(HE)染色评估了分子探针对活体动物的组织毒性。三组HeLa荷瘤裸鼠(每组n＝1只)分别注射生理盐水(体积200μL，对照组)、单注射组(剂量同上)和共注射组(剂量同上)。然后在注射3小时后将肿瘤和主要器官切成薄片并进行HE染色，并用高倍显微镜观察各组织的形态。
结果如图24所示，共注射组处理的所有组织的形态没有发生明显的病理变化，表明[68Ga]PA-DOTA-ALP和PA-DOTA-ALP均未对这些组织产生毒副作用，结果表明，探针[68Ga]PA-DOTA-ALP和前体PA-DOTA-ALP均具有良好的生物相容性。
综上，本发明成功设计了一种新型的68Ga标记的靶向肿瘤内碱性磷酸酶的酶促自组装分子探针[68Ga]PA-DOTA-ALP。该分子探针可以被肿瘤细胞内的碱性磷酸酶特异性酶切，并有效地富集和滞留在肿瘤部位，显著提高了PET显像效果，并延长了时间窗口。该探针成本低廉，合成简单，非常利于临床前生产和临床应用。细胞毒性试验和组织病理切片证实，该分子探针在细胞和组织层面具有良好的生物相容性。透射电镜和流变测试结果表明，经碱性磷酸酶(ALP)水解后，该分子探针可快速自组装成纳米纤维，并形成对外部应力具有良好耐受性的水凝胶。PET显像和组织分布研究表明，与前体共注射后可以进一步提高肿瘤部位对分子探针的摄取率，实现长时间有效地检测肿瘤，且具有较高的信噪比。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种酶促自组装分子探针，其特征在于，其结构式如下所示：
2.一种酶促自组装分子探针前体，其特征在于，其结构式如下所示：
3.一种如权利要求2所述的酶促自组装分子探针前体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH偶联到固相载体2-氯三苯甲基氯树脂上，随后加入封端试剂进行封端，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物1；
S2、将化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH偶联到化合物1上，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物2；
S3、将化合物Fmoc-Thr-OH偶联到化合物2上，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物3；
S4、将化合物Fmoc-Thr-OH偶联到化合物3上，然后脱除Fmoc保护基团，得到化合物4；
S5、将棕榈酸偶联到化合物4上，然后脱除Dde基团，得到化合物5；
S6、将DOTA(OtBu)3偶联到化合物5上，然后加入切肽试剂进行切肽，得到化合物6；
S7、向化合物6中加入tBu基团脱保护试剂，脱除tBu保护基团，得到化合物PA-DOTA-ALP；其合成路线如下：
4.根据权利要求3所述的酶促自组装分子探针前体的制备方法，其特征在于，在S1步骤中，将化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入活化的固相载体2-氯三苯甲基氯树脂中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入封端试剂，通惰性气体反应0.5～1小时进行封端，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物1；
和/或，在S2步骤中，将化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物1中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物2；
和/或，在S3步骤中，将化合物Fmoc-Thr-OH、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物2中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物3；
和/或，在S4步骤中，将化合物Fmoc-Thr-OH、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物3中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Fmoc保护基团的溶液，通惰性气体反应0.5～1小时进行脱除Fmoc保护基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物4；
和/或，在S5步骤中，将化合物棕榈酸、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物4中，通惰性气体反应1～1.5小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，随后加入脱除Dde基团的溶液，通惰性气体反应5～10分钟进行脱除Dde基团，然后排空反应液，洗涤，得到化合物5；
和/或，在S6步骤中，将化合物DOTA(OtBu)3、偶联剂和pH调节剂溶解于DMF溶剂中，然后加入化合物5中，通惰性气体反应6～8小时进行偶联，然后排空反应液，洗涤，然后加入切肽试剂，通惰性气体反应1～3分钟，重复切肽步骤4～6次；
和/或，在S7步骤中，加入tBu基团脱保护试剂后，通惰性气体，在20～30℃水浴反应3～4小时进行tBu基团脱保护，重复tBu基团脱保护步骤3～4次。
5.根据权利要求4所述的酶促自组装分子探针前体的制备方法，其特征在于，在所述脱除Fmoc保护基团步骤中，采用含体积百分比20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团；
和/或，所述偶联试剂为HOBT和HBTU；
和/或，所述pH调节剂为DIEA；
和/或，在所述脱除Dde基团步骤中，采用含体积百分比2％水合肼的DMF溶液脱除Dde基团；
和/或，所述tBu基团脱保护试剂为含体积百分比50％三氟乙酸的DCM溶液；
和/或，所述切肽试剂为含体积百分比1％三氟乙酸的DCM溶液；
和/或，所述封端试剂为体积百分比40％甲醇的DMF溶液。
6.根据权利要求5所述的酶促自组装分子探针前体的制备方法，其特征在于，在S1步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH、pH调节剂和DMF溶剂的比例为(400～500)：(250～300)：(0.3～0.4)：(15～25)，比例关系为mg：mg：ml：ml；
和/或，在S1步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂和封端试剂的比例为(400～500)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S1步骤中，化合物Fmoc-Lys(Dde)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为(250～300)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S2步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(250～300)：(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S2步骤中，化合物Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为(250～300)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S3或S4步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、化合物Fmoc-Thr-OH、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(150～220):(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S3或S4步骤中，化合物Fmoc-Thr-OH和脱除Fmoc保护基团的溶液的比例为(150～220)：(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S5步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、棕榈酸、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(110～160)：(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S5步骤中，棕榈酸和脱除Dde基团的溶液的比例为(110～160):(15～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S6步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂、DOTA(OtBu)3、DIEA、DMF溶剂、HOBT和HBTU的比例为(400～500)：(180～240)：(0.3～0.4)：(15～25)：(60～90)：(170～230)，比例关系为mg：mg：ml：ml：mg：mg；
和/或，在S6步骤中，2-氯三苯甲基氯树脂和切肽试剂的比例为(400～500)：(20～25)，比例关系为mg：ml；
和/或，在S7步骤中，化合物6和tBu基团脱保护试剂的比例为(180～240)：(20～30)，比例关系为mg：ml。
7.一种如权利要求1所述的酶促自组装分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求2所述的酶促自组装分子探针前体或权利要求3-6任一项所述的酶促自组装分子探针前体制备方法制备得到的酶促自组装分子探针前体进行68Ga标记，得到化合物[68Ga]PA-DOTA-ALP；其合成路线如下：
8.根据权利要求7所述的酶促自组装分子探针的制备方法，其特征在于，所述68Ga标记方法为，取68Ga洗脱液，加酸性溶液，调pH值至4～5，得到68Ga混合溶液，然后加入化合物PA-DOTA-ALP的水溶液中，在90～95℃下加热反应5～10分钟；
可选的，所述68Ga混合溶液中放射性强度为1.6～2.4mCi；
可选的，所述化合物PA-DOTA-ALP的水溶液浓度为1～2mg/mL；
可选的，所述68Ga溶液和所述化合物PA-DOTA-ALP的水溶液的体积比为(10～15)：(0.8～1.2)。
9.一种如权利要求1所述的酶促自组装分子探针在制备靶向肿瘤的PET示踪剂中的用途。
10.一种PET示踪剂，其特征在于，含有权利要求1所述的酶促自组装分子探针；
可选的，还包含权利要求2所述的酶促自组装分子探针前体。
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