CN116925971A - 一种防病促生的复合微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防病促生的复合微生物菌剂及其制备方法与应用。该复合微生物菌剂包括保藏编号为GDMCC 61592的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)XK29与保藏编号为GDMCC 60273的绿针假单胞菌致金色亚种(Pseudomonas chlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS‑41；所述复合微生物菌剂的活菌数大于等于1.0×107cfu/mL。本发明提供的复合微生物菌剂具有显著促进番茄苗生长和枯萎病抗性、扦插菊花苗生根、大蒜植株生长与蒜头产量提升、促进田间草莓生长的作用，有效促生增产、减肥减药。

Description

一种防病促生的复合微生物菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂领域，具体涉及一种防病促生的复合微生物菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
化肥、农药在现代蔬菜与水果种植生产中发挥着巨大作用，但是化肥、农药的过量使用不仅会造成生产成本增加，也导致水源污染、土壤板结以及农产品质量安全和生态环境安全等问题。化肥、农药减施增效技术的研发、推广应用已经成为提升农业绿色发展的有效途径。
当前，设施蔬菜和水果种植中化肥农药减量增效关键措施包括推广轮作模式、选择适宜品种、高温闷棚等土壤消毒、增施有机肥和平衡施用化肥等方法。而随着绿色农业的不断推广，利用微生物菌剂进行果树种植和生物防治成为研究和应用的热点。微生物菌剂种含有大量的有益活菌物质及多种天然发酵活性物质，施入土壤后，在根际繁殖形成优势种群，发挥其降解酚类等有害物质、产活性物质抑制土传病原菌及杀虫、活化土壤提高土壤肥力等作用，功能微生物本身还可以产生各类植物生长激素，刺激植物生长。因此，微生物菌剂具有促生、抗病、杀虫、解毒、抗逆、活化土壤、提高果蔬品质等功效，日益受到农业产业的关注。而单一微生物菌剂存在功能单一、适应能力差等问题。将不同功能菌株组合得到比单一微生物菌剂促生能力更强、更稳定的微生物复合菌剂，是微生物菌剂发展的趋势。
复合微生物菌剂是一种绿色环保、生态友好的肥料，具有增加土壤肥力、减少化肥和农药使用、净化和修复土壤、降低植物病害、提质增产、提高食品安全等特点，是实现农业可持续化发展的重要途径。因此，利用微生物技术生产高效优质的多功能复合微生物菌剂是发展生态农业、有机农业的需要，符合农业可持续发展战略的要求。
经检索，现有技术中尚未发现有关于特基拉芽孢杆菌和绿针假单胞菌致金色亚种复配制成复合菌剂，以及该复合菌剂在番茄枯萎病防控、扦插菊花苗生根、大蒜生长与产量提升，以及田间草莓生长中的应用的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种防病促生的复合微生物菌剂。
本发明的第二个目的是提供上述复合微生物菌剂的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述复合微生物菌剂在果蔬生长中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一，本发明提供一种防病促生的复合微生物菌剂，包括保藏编号为GDMCC 61592的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)XK29与保藏编号为GDMCC 60273的绿针假单胞菌致金色亚种(Pseudomonas chlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS-41；所述复合微生物菌剂的活菌数大于等于1.0×107cfu/mL。
优选的，所述复合微生物菌剂为液体制剂。
第二，本发明提供上述复合微生物菌剂的制备方法，具体步骤为：
(1)菌株活化：采用四区划线的方法，(Bacillus tequilensis)XK29和(Pseudomonas chlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS-41接种在LB固体平板上，于30℃恒温培养3d；
(2)复合微生物菌剂种子液的制备：从LB固体平板用接种环分别挑取1-2环新鲜XK29和SPS-41菌体分别接入到NA液体培养基中，震荡培养，获得XK29和SPS-41菌体的种子液；
(3)复合微生物菌剂的制备：将培养到对数期的种子培养液接入到LB液体培养基中，XK29摇菌振荡培养24h，SPS-41摇菌振荡培养36h，然后将摇好的菌液离心1次，用无菌水冲洗1次，再次离心，得到菌体，菌体用无菌水重悬并稀释至浓度为1×107cfu/mL的菌悬液；然后两菌的菌液以1：1等体积混合，即制成复合微生物菌剂。
优选的，步骤(2)中所述震荡培养的具体步骤是：于30℃，160rpm转速在摇床上18-24小时。
第三，本发明提供上述复合微生物菌剂在促进番茄生长和枯萎病防控中的应用。
第四，本发明提供上述复合微生物菌剂在扦插菊花苗生根中的应用。
第五，本发明提供上述复合微生物菌剂在田间草莓生长上的应用。
第六，本发明提供上述复合微生物菌剂在田间大蒜生长和化肥减施增效上的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的复合微生物菌剂具有多种活性功能，具有很好的抑菌性、降解植物根际自毒物质的能力，良好的促生长能力，能够有效促进植物的生根发育和生长。
(2)本发明的复合微生物菌剂应用范围广：不仅包括番茄、大蒜等蔬菜的生长发育上的应用，还可以防治病害，同时可以应用于草莓等水果植株的种植，以及难生根的花卉作物，例如菊花等种植上。既能促生长、防病害，也能有效增产量、减肥减药，在果蔬病害防治、生长促进，以及连作障碍的缓解方面都能发挥功效。
该发明技术有利于减少化学的施用，降低农业种植成本，是一种果蔬种植以及化肥减施增效的新技术方法，应用前景好。同时，菌株生物安全性好、易于发酵，生产成本低、绿色无污染，易于推广应用。
附图说明
图1是菌株XK29和SPS-41对番茄枯萎病菌的抑菌活性检测照片；
图2是菌株XK29和SPS-41对根际自毒物对羟基苯甲酸的降解能力检测；
图3是复合微生物菌剂对盆栽番茄的促生长和枯萎病的防治效果；
图4是复合微生物菌剂对盆栽番茄的促生长和枯萎病的防治效果表型数据比较(A.须根数；B.根长；C植株高度.；D.鲜根重)；
图5是复合微生物菌剂对盆栽菊花苗的促生效果和表型数据比较(须根数、根长和鲜重)；
图6是复合微生物菌剂对田间草莓的促生效果和表型数据比较(株高、分枝数和最大叶片直径)；
图7是复合微生物菌剂对田间大蒜植株生长的促生效果；
图8是复合微生物菌剂对田间大蒜蒜头重量的提升效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例使用的(Bacillus tequilensis)XK29菌株首次公开于中国发明专利申请CN 113151094A，(Pseudomonas chlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS-41菌株首次公开于中国发明专利申请CN 108148782A。
实施例1：复合微生物菌剂的制备
(1)菌株活化：采用四区划线的方法，(Bacillus tequilensis)XK29和(Pseudomonas chlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS-41接种在LB固体平板上，于30℃恒温培养3d。
(2).复合微生物菌剂种子液的制备：从LB固体平板用接种环分别挑取1-2环新鲜XK29和SPS-41菌体分别接入到NA液体培养基中，于30℃，160rpm转速在摇床上震荡培养18-24小时，获得XK29和SPS-41菌体的种子液。
(3).复合微生物菌剂的制备：将培养到对数期的种子培养液以5％-10％的接种量接入到LB液体培养基中，置于摇床中28oC，180rpm摇菌振荡培养，XK29摇菌培养24h，SPS-41摇菌培养36h，然后将摇好的菌液于离心机5000rpm，离心10min，离心1次，用无菌水冲洗1次，再次离心，得到菌体，菌体用无菌水重悬并稀释至浓度为1×107cfu/mL的菌悬液。然后两菌的菌液以1比1等体积混合，即制成复合微生物菌剂菌剂，用于后续的植株促生实验。
实施例2：复合微生物菌剂在促进番茄生长和枯萎病防控中的应用
(1)SPS-41、XK29对尖孢镰刀菌抑菌作用评价
以“口”字形接种在培养基上，倒置在28oC恒温培养2d，待菌落长好后取出平板，病原真菌尖孢镰刀菌打5mm菌饼，菌饼倒置接种在“口”字形中间，对照组只接种病原真菌菌饼，平板不封口，放在28oC恒温培养箱中7d，待对照组长满全板，即可收实验结果，测量菌落直径，并计算抑菌率。
由图1可以看出，菌株XK29、SPS-41对番茄枯萎病真菌尖孢镰刀菌具有很强的抑菌性，菌丝生长抑制率分别达到60％和94％。
(2)SPS-41、XK29降解植物自毒物质对羟基苯甲酸的能力
将番茄等植物的自毒物质对羟基苯甲酸加入到无机盐培养基中，浓度分别为1g/L、5g/L，将pH调至7.0，制备SPS-41、XK29发酵液，28℃，180rpm，摇菌2d，用无菌水稀释菌液至OD600为1.0，向49mL无机盐培养基中加1mL菌液，于摇床28℃，180rpm摇菌，每隔24h吸取菌液，1000r离心5min，取上清液测定自毒物质对羟基苯甲酸在246nm处的吸光值，用无机盐培养基调零，连续测定7d。根据对羟基苯甲酸标准曲线计算无机盐培养基中对羟基苯甲酸的残留量。
由图2可以看出，对羟基苯甲酸浓度在1g/L、5g/L时SPS-41、XK29均对其具有较强降解能力，在对羟基苯甲酸浓度较低时菌株对其可以进行快速清除，在第4天时对羟基苯甲酸的降解率几乎都达到了95％以上，菌株SPS-41对对羟基苯甲酸降解能力更强。实验结果说明，菌株通过降解对羟基苯甲酸等植物自毒物质以减轻其对植物的毒害作用，来保护植物健康生长，可以缓解植物连作障碍。
(3)复合菌剂的促生抗病作用评价
病原菌为尖孢镰刀菌(番茄专化型)(Fusarium oxysporum)，取接种尖孢镰刀菌的PDA平板，打直径5mm的菌饼倒置接种于PDA平板上，倒置于恒温培养箱中28℃培养7d，待菌丝长满整个培养基后取出，用无菌水将尖孢镰刀菌孢子冲洗下来，配制浓度为1×106cfu/mL的孢子悬液。
将矮化番茄幼苗移栽在方形小花盆中，小花盆中盛放灭菌土壤(营养土：蛭石＝8：1)，无菌水充分浸湿，缓苗3d后开始第一次灌根菌剂，每次浇灌30mL，每隔3天灌根一次，一共浇灌3次，需要侵染尖孢镰刀菌的处理组在灌根组合菌剂2d后浇灌尖孢镰刀菌孢子悬液30mL，之后少量多次浇灌，浇灌2-3次即可，对照组灌根无菌水，番茄幼苗生长30天后收结果。测量番茄鲜重、株高、根长及须根数目。每组各重复9棵苗。
图3可以看出，无论有无真菌病害，复合菌剂都可以显著促进番茄的生长。未接病原菌时，番茄苗须根数、根长、植株高度和根鲜重分别增加了86.9％、81.3％、36.2％和97.6％。而当土壤中侵染枯萎病真菌后，幼苗长势明显变差，但是复合菌剂处理后的植株生长较好，须根数、根长、植株高度和根鲜重分别增加了146.7％、70.2％、86.4％和220％(图4)，说明该复合菌剂不仅能促进植物生长，还可以显著防治番茄染枯萎病。
实施例3：复合微生物菌剂在扦插菊花苗生根中的应用
菊花苗采摘后移栽至含有营养土：蛭石＝8：1的小花盆中，缓苗3d后开始用上述方法制备的复合微生物菌剂处理，每株灌根9mL，共灌根3次，每组重复20棵苗，处理结束后第10天取样比较表型。
由图5可以看出，菌株XK29、SPS-41单独处理都能显著增加扦插菊花苗的须根数目和根长，促进菊花苗的生根发育。但是复合菌剂比单一菌处理的促生效果更佳，复合菌剂处理后的须根数目增加接近两倍，根长增加了45.5％。说明该复合微生物菌剂显著促进了扦插菊花苗的生根发育，在花卉种植中具有较好的应用价值。
实施例4：复合微生物菌剂在田间草莓生长上的应用
以春季大棚土壤中栽培的草莓苗(约6-10片叶)为材料，每棵苗根部灌50mL上述方法制备的复合微生物菌剂，两次处理，每次处理间隔3周，处理完后90天开始取样比较植株长势，对照为自来水处理，各重复30棵苗。
图6可以看出，与对照组比较，复合菌剂处理90天后的幼苗整体看叶片数更大，须根更多，叶片颜色更鲜绿、长势更好，体现在草莓植株地上部高度、须茎的分枝数、最大叶片直径都显著增加。其中，植株地上部高度显著增加了18.6％，须茎的分枝数增加了14.6％，最大叶片直径增加了18.4％。说明该复合微生物菌剂能够在草莓种植中促进草莓生长，可以作为生物肥料使用。
实施例5：复合微生物菌剂在田间大蒜生长和化肥减施增效上的应用
以春季田间自然种植的大蒜植株(高度大约15-20厘米)为材料，每棵苗根部灌50mL上述方法制备的复合微生物菌剂或自来水或与有机肥料不同比例混合的菌剂，两次灌根处理，两次处理间隔7天。设置不同的处理组：对照(CK)、肥料组(某市场销售的植物氨基酸水溶肥)、菌剂：肥料＝3：7、菌剂：肥料＝1：1、菌剂：肥料＝7：3。每个处理重复30棵苗。待30和60天后分别取样比较植株长势，比较蒜头重量。
由图7可以看出，复合微生物菌剂以及菌剂与肥料不同比例的各个组合处理30天后，肥料、菌剂、以及菌剂-肥料不同比例组合都能显著促进大蒜植株的生长，株高显著增加。60天后统计蒜头的重量发现，肥料和菌剂灌根后的蒜头重量显著增加，蒜头直径增加，其中菌剂：肥料＝3：7的组合效果最佳，重量增加了近一倍(图8)。说明该复合微生物菌剂能够在田间大蒜种植中促进大蒜生长，促进大蒜产量提升，可以作为生物肥料使用，并能减少30-50％化学肥料的施用，达到减施增效的作用效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种防病促生的复合微生物菌剂，其特征在于，包括保藏编号为GDMCC 61592的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)XK29与保藏编号为GDMCC 60273的绿针假单胞菌致金色亚种(Pseudomonas chlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS-41；所述复合微生物菌剂的活菌数大于等于1.0×107cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的一种防病促生的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂为液体制剂。
3.一种权利要求1或2所述的防病促生的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株活化：采用四区划线的方法，(Bacillus tequilensis)XK29和(Pseudomonaschlororaphis sub sp.Aureofaciens)SPS-41接种在LB固体平板上，于30℃恒温培养3d；
(2)复合微生物菌剂种子液的制备：从LB固体平板用接种环分别挑取1-2环新鲜XK29和SPS-41菌体分别接入到NA液体培养基中，震荡培养，获得XK29和SPS-41菌体的种子液；
(3)复合微生物菌剂的制备：将培养到对数期的种子培养液接入到LB液体培养基中，XK29摇菌振荡培养24h，SPS-41摇菌振荡培养36h，然后将摇好的菌液离心1次，用无菌水冲洗1次，再次离心，得到菌体，菌体用无菌水重悬并稀释至浓度为1×107cfu/mL的菌悬液；然后两菌的菌液以1：1等体积混合，即制成复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的防病促生的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述震荡培养的具体步骤是：于30℃，160rpm转速在摇床上18-24小时。
5.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在促进番茄生长和枯萎病防控中的应用。
6.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在扦插菊花苗生根中的应用。
7.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在田间草莓生长上的应用。
8.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在田间大蒜生长和化肥减施增效上的应用。
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