CN116908335A - 一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，包括以下步骤：步骤1)将卤代植物醇与衍生化试剂按照摩尔比1：1.2～1.5进行衍生化，得到具有共轭基团的衍生化产物；步骤2)将步骤1)所得衍生化产物配制成测试液，用高效液相色谱仪进行检测。本发明具有的优点是通过衍生化试剂对卤代植物醇进行衍生化，使其具有共轭基团在紫外区有吸收，进而用常规的高效液相色谱仪即可检测。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法。
背景技术
本发明涉及的卤代植物醇是维生素K1合成过程中的关键中间体，查阅相关文献，该化合物的检测方法未被报道，而对于相似化合物检测采用的有气相色谱法，液质检测等方法，但该化合物沸点高，无法使用气相色谱检测；常规的液相色谱一般为紫外检测器，而该结构中无大的共轭体系，无紫外区吸收，无法用常规的液相色谱进行检测，而示差折光检测器对系统稳定性要求较高，受外界温度和环境的影响较大，不宜操作控制，液质分析仪价格较为昂贵，不适合做规模化生产时的检测方式，对卤代植物醇检测的开发一直是分析开发人员的难题。为了满足CFDA对药品监管要求，从源头对原料药进行质量控制，急需开发一种能准确进行卤代植物醇定量的检测方法，实现维生素K1药品开发和生产过程中质量的控制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，通过衍生化试剂对卤代植物醇进行衍生化，使其具有共轭基团在紫外区有吸收，进而用常规的高效液相色谱仪即可检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：一方面，提供一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，包括以下步骤：
步骤1)将卤代植物醇与衍生化试剂按照摩尔比1：1.2～1.5进行衍生化，得到具有共轭基团的衍生化产物；
步骤2)将步骤1)所得衍生化产物配制成测试液，用高效液相色谱仪进行检测。
通过上述技术方案，本领域技术人员公知，卤代植物醇沸点高，无大共轭结构，在紫外区(200-400nm)无明显特征吸收，仅有末端吸收，无法直接使用液相HPLC-UV检测。本发明通过卤代植物醇与衍生化试剂按照摩尔比1：1.2～1.5进行衍生化，使得卤代植物醇的衍生物具有大共轭基团，基于共轭基团在紫外区有吸收，进而用常规的高效液相色谱仪即可检测，该方法突破了该化合物常规方法不能检测的技术难题，衍生化步骤易操作，专属性强，准确度高，易于掌握，精密度高，含量测定结果准确，重复性好，可用于维生素K1关键中间体卤代植物醇的含量测定。
进一步地，在步骤1)中，所述衍生化试剂包括吡啶、4-甲基吡啶、喹啉中的任意一种。
通过上述技术方案，吡啶具有接近正六角形的结构，与苯相似，具有相同的电子结构。由于环中氮原子的吸电子作用，使2，4，6位上电子云密度低于3，5位，在酸性介质中，亲电取代反应发生在3，5位，亲核反应如胺化、烷基化、芳基化、酰化发生在2，4，6位。本发明采用吡啶、4-甲基吡啶、喹啉作为衍生化试剂，是基于其与卤代植物醇的衍生化产物具有发色基团，即卤代植物醇含有的-卤素助色基团与衍生化试剂含有的生色团相连，能使该生色团的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加，进而克服在紫外区无吸收区的技术难题。
衍生试剂的发色基团是试剂本身：如吡啶具有接近正六角形的结构，与苯相似，具有相同的电子结构；优选地，吡啶和4-甲基吡啶，衍生后的产品较为稳定，生色团与助色基团能够更好的搭配结合，从而更好的克服本发明的技术难题，同时在进行液相检测时，吸收更强。
进一步地，在步骤1)中，所述衍生化的温度为30～60℃，衍生反应的时间为1.0h～2.0h。
通过上述技术方案，卤代植物醇与衍生化试剂在上述范围内进行衍生化反应时，能够有效保障衍生化完全，增加检测的灵敏度。
进一步地，在步骤2)中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱的固定相：选用键合十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：230～265nm；
流速为0.8～1.2mL/min；
柱温：30～40℃；
流动相：以体积份数计，以三乙胺的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，用酸调节pH值至8.0～9.5为流动相A，以乙腈：甲醇＝(50～70):(30～50)(V/V)为流动相B，通过下面梯度程序洗脱：
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 25 | 75 |
| 25 | 10 | 90 |
| 30 | 25 | 75 |
。
通过上述技术方案，采用衍生化产物进行上述高效液相色谱仪的检测，有效改善了卤代植物醇的热稳定性以及分子质量，提高了检测的灵敏度。
更进一步地，在流动相中，所述三乙胺的浓度为2.0％-3.0％，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为8-12mmol/l，所用的酸为乙酸或磷酸的一种。
进一步地，所述高效液相色谱仪所用检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器中的一种。
进一步地，所述卤代植物醇有以下结构，
其中，X为Br或Cl中的一种。
本发明的有益效果在于：本发明通过使用合适的衍生化试剂对其进行衍生化，使其具有共轭基团在紫外区有吸收，进而用常规的高效液相色谱仪即可检测，该方法突破了该化合物常规方法不能检测的技术难题，衍生化步骤易操作，专属性强，准确度高，易于掌握，精密度高，含量测定结果准确，重复性好，可用于维生素K1关键中间体卤代植物醇的含量测定。
附图说明
图1是实施例1中溴代植物醇系统适用性的色谱图；
图2是实施例1中吡啶未衍生的溴代植物醇的液相图谱；
图3是实施例1中吡啶衍生后的溴代植物醇的液相图谱；
图4是对比例1中未衍生化的液相色谱检测图；
图5是实施例2中4-甲基吡啶未衍生的氯代植物醇的液相图谱；
图6是实施例2中4-甲基吡啶衍生后的氯代植物醇的液相图谱；
图7是实施例3中喹啉未衍生的溴代植物醇的液相图谱；
图8是实施例3中喹啉衍生后的溴代植物醇的液相图谱。
具体实施方式
下面将结合发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。
实施例1
衍生化：取溴代植物醇(含量80％)1.64g，置50mL锥形瓶中，加入12mL乙腈和0.35g吡啶，后在数显水浴恒温振荡器中40℃水浴衍生1.5h，冷却至室温，过滤，取滤液。
色谱条件：色谱柱的固定相选用键合十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250nm；流速为：1.2ml/min；柱温：30℃；流动相：以体积份数计，以2.0％三乙胺的10mmol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液，用乙酸调节pH值至9.5为流动相A，以乙腈：甲醇＝50:50(V/V)为流动相B，通过下面梯度程序洗脱：
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| 25 | 10 | 90 |
| 30 | 25 | 75 |
如图2和图3所示，由衍生后的图谱可以看出与图4(紫外无吸收，无法用液相进行定量分析)相比衍生后的溴代植物醇利用了其吡啶基团在紫外区有明显吸收的特征，给出了比较准确的检测结果。
实施例2
衍生化：取氯代植物醇(含量80％)1.44g，置50mL锥形瓶中，加入12mL乙腈和0.44g4-甲基吡啶，后在数显水浴恒温振荡器中60℃水浴衍生1h，冷却至室温，过滤，取滤液。
色谱条件：色谱柱的固定相选用键合十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：265nm；流速为：1.0ml/min；柱温：35℃；流动相：以体积份数计，以3.0％三乙胺的8mmol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液，用磷酸调节pH值至8.0为流动相A，以乙腈：甲醇＝70:30(V/V)为流动相B，通过下面梯度程序洗脱：
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 25 | 75 |
| 25 | 10 | 90 |
| 30 | 25 | 75 |
如图5、图6可知，由衍生后的图谱能够看出与图4(紫外无吸收，无法用液相进行定量分析)相比衍生后的氯代植物醇利用了其吡啶基团在紫外区有明显吸收的特征，给出了比较准确的检测结果。
实施例3
衍生化：取氯代植物醇(含量80％)1.64g，置50mL锥形瓶中，加入12mL乙腈和0.81g喹啉，后在数显水浴恒温振荡器中40℃水浴衍生1.5h，冷却至室温，过滤，取滤液。
色谱条件：色谱柱的固定相选用键合十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：259nm；流速为：2.0ml/min；柱温：40℃；流动相：以体积份数计，以2.5％三乙胺的12mmol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液，用磷酸调节pH值至9.0为流动相A，以乙腈：甲醇＝65:35(V/V)为流动相B，通过下面梯度程序洗脱：
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 25 | 75 |
| 25 | 10 | 90 |
| 30 | 25 | 75 |
如图7和图8可知，由衍生后的图谱可以看出与图4(紫外无吸收，无法用液相进行定量分析)相比衍生后的溴代植物醇利用了其喹啉基团在紫外区有明显吸收的特征，给出了比较准确的检测结果。
对比例1
溶液配置：取溴代植物醇适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为测试液。
色谱条件：色谱柱的固定相选用键合十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：250nm；流速为：1.2ml/min；柱温：30℃；流动相：以体积份数计，以2.0％三乙胺的10mmol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液，用乙酸调节pH值至9.5为流动相A，以乙腈：甲醇＝50:50(V/V)为流动相B，通过下面梯度程序洗脱：
| 时间(min) | A％ | B％ |
| 0 | 25 | 75 |
| 25 | 10 | 90 |
| 35 | 25 | 75 |
未经衍生处理的溴代植物醇在无紫外吸收，无法用液相进行定量分析效果实施例一：系统适用性实验
供试品溶液：取滤液0.1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度混匀，即得。
对照品溶液：取对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为对照品溶液。
空白溶液：取12mL乙腈和对应的酰基化试剂，置50ml锥形瓶中混匀，精密量取0.1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，混匀，即得空白溶液；
取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各25μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。取上述空白溶液进样至少1针，平行配制的两份对照品溶液一份连续进样5针，另一份连续进样2针，记录色谱图，考察系统适用性。
取上述空白溶液、空白干扰溶液、灵敏度溶液、供试品溶液记录色谱图，每份溶液各进样1次。观察空白溶液和空白干扰溶液是否有干扰。
表1专属性及灵敏度试验结果
效果实施例二：线性与范围试验
线性贮备液：即“专属性与系统适用性”项下对照品贮备溶液。(20mg/mL)
线性溶液的配制：精密量取线性贮备液适量，置相应的量瓶中，加乙腈稀释至刻度，制得40％、60％、80％、100％、120％五个点的溶液，摇匀，即得。量取上述各浓度水平的线性溶液，注入HPLC中，每个水平重复进样2次，记录色谱图。结果见表2
表2线性回归
效果实施例三：准确度试验
取滤液，加入对应的回收率贮备液适量，加乙腈稀释至刻度，混匀，即得各水平回收率溶液。结果见表3。
综上所述，9份回收率样品溶液的回收率均在98％以上，RSD％为0.7，说明该方法的准确度较好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)将卤代植物醇与衍生化试剂按照摩尔比1：1.2～1.5进行衍生化，得到具有共轭基团的衍生化产物；
步骤2)将步骤1)所得衍生化产物配制成测试液，用高效液相色谱仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述衍生化试剂包括吡啶、4-甲基吡啶、喹啉中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述衍生化的温度为30～60℃，衍生反应的时间为1.0h～2.0h。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱的固定相：选用键合十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
检测波长：230～265nm；
流速为0.8～1.2mL/min；
柱温：30～40℃；
流动相：以体积份数计，以三乙胺的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，用酸调节pH值至8.0～9.5为流动相A，以乙腈：甲醇＝(50～70):(30～50)(V/V)为流动相B，通过下面梯度程序洗脱：
。
5.根据权利要求4所述的高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，在流动相中，所述三乙胺的浓度为2.0％-3.0％，十六烷基三甲基溴化铵的浓度为8-12mmol/l，所用的酸为乙酸或磷酸的一种。
6.根据权利要求4所述的高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪所用检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器中的一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法，其特征在于，所述卤代植物醇有以下结构，
其中，X为Br或Cl中的一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311084497.5A CN116908335A (zh) | 2023-08-25 | 2023-08-25 | 一种高效液相色谱法检测卤代植物醇含量的方法 |
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