CN116874593A - 新型冠状病毒广谱中和抗体及其应用 - Google Patents

新型冠状病毒广谱中和抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒广谱中和抗体及其应用。所述抗体为KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06中的任意一种或多种的组合，所述KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06均包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有三个重链CDR，所述轻链可变区具有三个轻链CDR。本发明提供的6个广谱中和抗体以及公开的各重链、轻链可变区序列，为构建高亲和力、高质量、特异性强的SARS‑CoV2治疗性中和抗体提供了基础，对新型冠状病毒的防控与治疗有较高的应用价值。

Description

新型冠状病毒广谱中和抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒广谱中和抗体及其应用。
技术背景
冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，其特征是病毒表面有棍棒状的刺突和异常大的RNA基因组。冠状病毒基因组主要编码四种结构蛋白刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白以及非结构蛋白，它们对维持包膜病毒粒子的结构完整性很重要。冠状病毒S蛋白在病毒表面形成三聚体，它能够与宿主细胞上的ACE2表面受体结合并介导冠状病毒进入宿主细胞。因此它是治疗性中和抗体的主要靶标，也是药物开发和疫苗设计的重点。
抗体结合表位的快速进化使病毒能够逃避宿主免疫反应，自首例感染报道以来，SARS-CoV-2迅速变异，出现了多种变体，许多单克隆抗体，包括被批准用于中和早期变异的商业治疗性抗体，已经大部分或完全失去了中和新变异株的能力(Wang Q,et al.:Alarming antibody evasion properties of rising SARS-CoV-2BQ and XBBsubvariants.Cell 2022,186:279-286.e8.Tuekprakhon A,et al.:Antibody escape ofSARS-CoV-2Omicron BA.4and BA.5from vaccine and BA.1serum.Cell 2022,185:e2413)。Daming Zhou等分析了BA.1、BA.2以及BQ.1、XBB等毒株的免疫逃逸情况，它们都表现出广泛的免疫逃逸(Zhou Daming et al.Broadly neutralizing antibodies againstCOVID-19.[J].Current opinion in virology,2023,61:101332-101332.)。
因此，有必要开发新的针对SARS-CoV-2的广谱中和抗体，以实现对病毒各变异株的良好的中和效果。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的之一在于提供了一种新型冠状病毒广谱中和抗体。
本发明采用了以下技术方案：
新型冠状病毒广谱中和抗体，所述抗体为KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06中的任意一种或多种的组合，所述KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06均包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有三个重链CDR，所述轻链可变区具有三个轻链CDR，其中：
所述KXD01重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD01轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD02重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD02轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD03重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD03轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD04重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD04轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD05重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD05轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD06重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD06轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列。
上述同源性序列也包含与序列表所示序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换、插入或缺失)的氨基酸序列。
优选的，所述KXD01重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
KXD02重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
KXD03重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
KXD04重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；
KXD05重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
KXD06重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示。
具体的，KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06的重链可变区和轻链可变区的CDR氨基酸序列如下表所示：
表中H表示重链，L、K表示轻链。
优选的，所述KXD01的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，KXD01的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示；KXD02的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，KXD02的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；KXD03的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，KXD03的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；KXD04的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，KXD04的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；KXD05的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，KXD05的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；KXD06的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示，KXD06的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示。
本发明的目的之二在于提供一种新型冠状病毒广谱中和抗体，其具有如权利要求1所述的KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06中的任意一种抗体以及Fc结构域。
优选的，所述Fc结构域为人IgG Fc结构域。
优选的，所述Fc结构域为人IgG1 Fc结构域或IgG2 Fc结构域或IgG3 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
本发明还提供一种多核苷酸，其编码如上所述的KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06抗体，或编码如上所述的包含Fc结构域的抗体；其中编码KXD01重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示，编码KXD01轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示；编码KXD02重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示，编码KXD02轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:52所示；编码KXD03重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示，编码KXD03轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示；编码KXD04重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示，编码KXD04轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示；编码KXD05重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:57所示，编码KXD05轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:58所示；编码KXD06重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示，编码KXD06轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示。
本发明还提供一种包含如上所述的多核苷酸的表达载体，以及一种包含如前所述的表达载体的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞。
本发明提供如上所述的抗体在制备治疗和/或预防新型冠状病毒的疫苗以及制备中和SARS-CoV-2的疫苗中的应用。
本发明还提供一种包含如上所述的KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06抗体或包含Fc结构域的抗体的疫苗。
本发明的有益效果在于：
本发明筛选出6组对SARS-CoV2野生型毒株和各变异株均具有良好的中和活性的抗体KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06，并克隆出其轻链和重链可变区，测序后分别得到其核苷酸序列，为构建高亲和力、高质量、特异性强的SARS-CoV2治疗性中和抗体提供了基础，对新型冠状病毒的防控与治疗有较高的应用价值。
附图说明
图1为单B细胞的抗原特异性流式分选；
图2为抗体结合抗原WT Spike和WT RBD的ELISA读值。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
实施例1
抗体的发现和制备
1.1抗原的获得
将SARS-CoV-2Spike胞外区(1-1208)与bacteriophage T4 fibritin的trimertag以及C末端的8×His、Twin-StrepIItag、Flag tag构建到载体pCAGGS，形成表达质粒。将质粒与转染试剂PEI轻柔混合，室温孵育20min，转染293F悬浮细胞，得到重组细胞，进行蛋白质的表达。重组细胞在SMM 293-TII完全培养基培养96h，然后4℃、3000rpm离心30min，收集上清液。利用Strep-Tactin磁珠亲和层析法纯化得到目的蛋白WT Spike。具体纯化流程：将100ml上清液与Strep-Tactin磁珠混合，4℃孵育过夜，磁力架分离溶液和磁珠。向磁珠中加入30ml PBS溶液，旋转混合，洗涤磁珠5min，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液；再重复洗涤步骤三遍。向磁珠中加入10ml洗脱缓冲液(5mM D-Desthiobiotin in PBS)，室温下翻转混合，孵育15min。使用磁分离架收集磁珠，将含有目的蛋白质的洗脱液转移到干净的离心管中。使用100KDa截留量的超滤管进行浓缩，并将溶液置换为PBS buffer。
1.2单B细胞的抗原特异性流式分选
招募了两名SARS-CoV-2自然感染的康复者作为志愿者，各抽取5ml外周血，离心得到血细胞，使用淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心介质，思拓凡，货号：17144002)得到外周血单个核细胞PBMC。对PBMC进行细胞流式染色，使用流式细胞分选仪进行抗原特异性分选。流式分选和圈门策略如图1所示，针对抗原WT Spike的His和Flag标签双阳性的记忆B细胞和浆母细胞进行分选，将单B细胞分选至含细胞裂解液的96孔板中。
1.3抗体可变区基因扩增
利用单B细胞基因扩增技术，将裂解的mRNA反转录得到cDNA，使用单B细胞抗体基因扩增引物，PCR得到重链和轻链可变区的基因产物，并进行测序。利用IgBlast tool对序列进行分析。
1.4重组质粒的构建
将重链可变区DNA分子无缝克隆至表达载体hIgG，得到重链表达质粒。
将轻链可变区DNA分子无缝克隆至表达载体hIgκ或hIgλ，得到轻链表达质粒。
重链和轻链的编码区均包括三个部分组成，信号肽、可变区和恒定区。
1.5抗体的筛选
最终克隆成功并配对得到72株抗体。将配对的重链表达质粒和轻链表达质粒，共转染HEK-293T细胞，培养48h，表达抗体，获得培养的抗体上清液。利用抗体上清液对抗体亲和力和中和活性进行初筛。
1.5.1ELISA结合实验筛选阳性克隆
1)抗原包被：PBS稀释WT Spike抗原和WT RBD抗原使其终浓度为1ng/μl。ELISA板每孔包被100μl，4℃过夜。
2)封闭：弃溶液，每孔用200μl PBST清洗3次。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。
3)洗涤：弃上清，每孔加入200μl PBST清洗3次，拍干。
4)加细胞培养抗体上清液：每孔加入100μl抗体上清液，或者100μl稀释3倍的抗体上清液，阴性对照为PBS。37℃孵育1h。
5)加二抗：弃上清，每孔加入200μl PBST清洗3次，拍干。每孔加入带HRP标记的羊抗人IgG(H+L)的二抗100μl。37℃孵育1h。
6)显色：弃上清，每孔加入200μl PBST清洗4次，拍干。加入显色液TMB 100μl，颜色变化后，每孔加入50μl 10％硫酸终止液终止反应。
7)读数：酶标仪450nm处读取吸光度。每株细胞培养的抗体上清液设置1组复孔，实验独立重复1次。选取吸光度高于本底读值两倍的为阳性抗体。
实验结果如图2所示，可以看出，72株细胞培养抗体上清液经过ELISA结合实验的初筛，获得了针对WT Spike的阳性抗体50株，针对WT RBD的阳性抗体25株。
1.5.2抗体中和活性初筛
将上述50株WT Spike ELISA阳性的细胞培养的抗体上清液进一步进行针对SARS-CoV-2WT假病毒的中和活性筛选。
1)准备假病毒
将SARS-CoV-2WT假病毒从-80℃取出室温融化，将假病毒相对滴度调整到10万(荧光素酶报告基因的读值)左右。
2)取96孔细胞培养板，将96孔板周围孔加上200μl PBS，其余每孔加入100μl培养基，第一列和第五列分别加入50μl不同细胞培养的抗体上清液，混匀后取50μl至下一列孔混匀，进行3倍的倍比稀释，共稀释4个梯度；最后每孔加入50μl SARS-CoV-2假病毒液。37℃细胞培养箱中静置孵育1小时，最后两列分别为细胞对照和病毒对照。用等体积PBS缓冲液代替抗体上清液，作为病毒对照。用等体积含10％胎牛血清的DMEM培养基代替SARS-CoV-2病毒液，作为细胞对照。
3)取上述细胞培养板，在中间60个孔每孔加入50μl ACE2-HEK293T细胞悬液，每孔2×104个ACE2-HEK293T细胞，37℃细胞培养箱中继续培养48小时。
4)取上述细胞培养板，弃上清，每孔加入100μl PBS和20μl荧光素酶报告基因检测试剂，室温避光静置孵育2min。
5)取上述细胞培养板，检测荧光素酶活性。
每株抗体上清液设置1组复孔。中和实验独立重复1次。
中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧光强度-细胞对照的荧光强度)]×100％。
实验结果如表1所示。
定义细胞培养的抗体上清液4.5倍稀释时的中和活性≥99％定义为强中和活性，有6株达到强中和活性，分别命名为KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06，各抗体可变区序列参见序列表。
表1 50株WT Spike ELISA阳性的细胞培养的抗体上清液对SARS-CoV-2WT假病毒的中和活性筛选
1.6抗体的制备
1.6.1将上述筛选得到的6株抗体的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染293F细胞，得到重组细胞。在SMM 293-TII完全培养基培养96h，然后4℃、3000rpm离心30min，收集上清液。
1.6.2Protein A磁珠法亲和层析
亲和层析的填料：Protein A磁珠；洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，pH 3.0；中和缓冲液：1M Tris，pH 8.5。
将50ml上清液与Protein A磁珠混合，4℃孵育16h；磁力架分离溶液和磁珠。向磁珠中加入20ml PBS溶液，旋转混合，洗涤磁珠5min，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液；再重复洗涤步骤三遍。向磁珠中加入9ml洗脱缓冲液，迅速重悬，混合均匀，室温下翻转混合，孵育5min。使用磁分离架收集磁珠，将含有洗脱抗体的上清液转移到干净的离心管中。向9ml洗脱液中加入1ml中和缓冲液以中和pH，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。
1.6.3溶液置换
将步骤2得到的抗体溶液，用超滤管浓缩，并将溶液置换为PBS缓冲液，得到蛋白质浓度为1mg/ml的抗体溶液。
实施例2
抗体的亲和力测定
1抗原RBD的蛋白质表达与纯化
将SARS-CoV-2WT、BA.2.75、BA.4/5、BQ.1、XBB.1.5Spike的RBD(319-541)结构域的基因构建到载体pcDNA3.1上，C末端带有StrepIItag。使用PEI转染试剂将质粒转染293F悬浮细胞，得到重组细胞，进行蛋白质的表达。重组细胞在SMM 293-TII完全培养基培养96h，然后4℃、3000rpm离心30min，收集上清液。利用Strep-Tactin磁珠亲和层析法纯化得到目的蛋白RBD。具体纯化流程：将200ml上清液与Strep-Tactin磁珠混合，4℃孵育过夜，磁力架分离溶液和磁珠。向磁珠中加入30ml PBS溶液，旋转混合，洗涤磁珠5min，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液；再重复洗涤步骤三遍。向磁珠中加入30ml洗脱缓冲液(5mM D-Desthiobiotin in PBS)，室温下翻转混合，孵育15min。使用磁分离架收集磁珠，将含有目的蛋白质的洗脱液转移到干净的离心管中。使用10KDa截留量的超滤管进行浓缩，并将溶液置换为PBS buffer。
2抗体与抗原的ELISA测定
1)抗原包被：PBS稀释各毒株的RBD抗原使其终浓度为1ng/μl。ELISA板每孔包被100μl，4℃过夜。
2)封闭：弃溶液，每孔用200μl PBST清洗3次。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。
3)洗涤：弃上清，每孔加入200μl PBST清洗3次，拍干。
4)加一抗：抗体起始浓度为10ng/μl，3倍稀释，共12个梯度；每孔加入100μl的抗体稀释液；阴性对照为PBS。37℃孵育1h。
5)加二抗：弃上清，每孔加入200μl PBST清洗3次，拍干。每孔加入带HRP标记的羊抗人IgG(H+L)的二抗100μl。37℃孵育1h。
6)显色：弃上清，每孔加入200μl PBST清洗4次，拍干。加入显色液TMB 100μl，颜色变化后，每孔加入50μl 10％硫酸终止液终止反应。
7)读数：酶标仪450nm处读取吸光度。每株抗体设置1组复孔，实验独立重复1次。
利用Prism 8软件计算结合活性为50％时的抗体浓度，即抗体对抗原亲和力的EC50值。实验结果如表2所示：
表2抗体与抗原的亲和力
由实验结果可知，6株抗体对不同变异毒株的RBD抗原均具有非常强的亲和力。
实施例3
中和试验
1 SARS-CoV-2及其变异株假病毒的制备
步骤如下：
S1、将人工合成的SARS-CoV-2Spike及其变异株Spike和SARS-CoV-1Spike的基因克隆至pcDNA3.1表达载体。
S2、将重组质粒pcDNA3.1/SARS-CoV-1/2Spike和质粒pLenti-CMV-puro-Luciferase以及质粒psPAX2共转染HEK 293T细胞，得到重组细胞。
包装质粒psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜。质粒pLenti-CMV-puro-Luciferase为慢病毒载体质粒，在宿主细胞中表达报告荧光素酶基因。将慢病毒载体中的包膜糖蛋白用新冠病毒S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒。假病毒通过表面S蛋白感染靶细胞并表达报告荧光素酶基因。
S3、将步骤S2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养60h。
S4、收集培养上清，离心取上清，即为SARS-CoV-1假病毒和SARS-CoV-2假病毒的病毒液。
S5、利用荧光素酶报告基因检测试剂检测SARS-CoV-1和SARS-CoV-2假病毒液中的病毒滴度。
2抗体的中和活性检测
中和抗体可以阻断假病毒S蛋白和ACE2的结合，从而阻止假病毒对宿主细胞ACE2-HEK293T的感染。通过检测报告基因荧光素酶的表达量，能推断出病毒被阻断的程度，从而进行中和抗体的筛选或验证。
供试抗体溶液分别为实施例1制备的6株抗体溶液KXD01～KXD06。
步骤如下：
S1、准备抗体和假病毒
将纯化的单克隆抗体和SARS-CoV-2假病毒从-80℃取出室温融化，将假病毒相对滴度调整到10万(荧光素酶报告基因的读值)左右，将抗体过滤除菌同时将浓度调整到0.5mg/ml。
S2、取96孔细胞培养板，将96孔板周围孔加上200μl PBS，其余每孔加入100μl培养基，第一列每孔补45.6μl培养基，抗体每孔加4.4μl，混匀后取50μl至下一列孔混匀，进行3倍的倍比稀释，共8个稀释度；最后每孔加入50μl SARS-CoV-2假病毒液。抗体起始浓度为10ng/μl，37℃细胞培养箱中静置孵育1小时，最后两列分别为细胞对照和病毒对照。用等体积PBS缓冲液(pH7.4、10mM)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用等体积含10％胎牛血清的DMEM培养基代替SARS-CoV-2病毒液，作为细胞对照。
S3、取完成步骤S2所述细胞培养板，在中间60个孔里全部加入50μl ACE2-HEK293T细胞悬液，每孔2×104个ACE2-HEK293T细胞，37℃细胞培养箱中继续培养48小时。
S4、取完成步骤3所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入100μl PBS和20μl荧光素酶报告基因检测试剂，室温避光静置孵育2min。
S5、取完成步骤4所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。
每株抗体设置1组复孔。中和实验独立重复1次。
中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧光强度-细胞对照的荧光强度)]×100％。
利用Prism 8软件计算中和活性为50％时的抗体浓度，即抗体的IC50值。
中和活性的结果见表3。
表3抗体对SARS-CoV2假病毒的中和
由中和试验结果可知，6株抗体均对SARS-CoV2野生型毒株Delta、BA.1至BA.4/5的奥密克戎变异株具有良好的中和作用；6株抗体表现出对早期病毒变异株具有强中和活性，同时对BF.7、BQ.1以及XBB系列的毒株具有强中和活性。实验结果同时表明，获批新冠紧急使用授权的抗体CoV-2196、CoV-2130、P2C-1F11对SARS-CoV-2WT和Delta变异株具有强中和活性，但对BA.1至BA.4/5的奥密克戎变异株中和活性大幅下降，BF.7、BQ.1以及XBB系列的毒株已发生抗体免疫逃逸，而本发明筛选得到的抗体中和活性依然很强。
总的来说，实验结果表明6株抗体对SARS-CoV2不同变异毒株具有广谱中和活性，具有进一步研究以及发展成为治疗药物的价值。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (12)

1.新型冠状病毒广谱中和抗体，其特征在于，所述抗体为KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06中的任意一种或多种的组合，所述KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06均包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有三个重链CDR，所述轻链可变区具有三个轻链CDR，其中：
所述KXD01重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD01轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD02重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD02轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD03重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD03轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD04重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD04轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD05重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD05轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；
所述KXD06重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列；KXD06轻链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列同源性大于等于80％的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的新型冠状病毒广谱中和抗体，其特征在于，所述KXD01重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
KXD02重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
KXD03重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
KXD04重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；
KXD05重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
KXD06重链可变区和轻链可变区的6个CDR氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示。
3.如权利要求2所述的新型冠状病毒广谱中和抗体，其特征在于，所述KXD01的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，KXD01的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示；KXD02的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，KXD02的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；KXD03的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，KXD03的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；KXD04的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，KXD04的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；KXD05的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，KXD05的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；KXD06的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示，KXD06的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示。
4.一种新型冠状病毒广谱中和抗体，其具有如权利要求1所述的KXD01、KXD02、KXD03、KXD04、KXD05、KXD06中的任意一种抗体以及Fc结构域。
5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述Fc结构域为人IgG Fc结构域。
6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述Fc结构域为人IgG1 Fc结构域或IgG2 Fc结构域或IgG3 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
7.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-3任一项所述的抗体，或编码如权利要求4-6任一项所述的抗体。
8.一种表达载体，其包含如权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，其包含如权利要求8所述的表达载体。
10.权利要求1-6任一项所述的抗体在制备治疗和/或预防新型冠状病毒的疫苗中的应用。
11.权利要求1-6任一项所述的抗体在制备中和SARS-CoV-2的疫苗中的应用。
12.一种疫苗，其包含如权利要求1-6任一项所述的抗体。
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