CN116813630A - 盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法 - Google Patents

盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116813630A
CN116813630A CN202310780262.3A CN202310780262A CN116813630A CN 116813630 A CN116813630 A CN 116813630A CN 202310780262 A CN202310780262 A CN 202310780262A CN 116813630 A CN116813630 A CN 116813630A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mobile phase
lycorine
solution
thioester
impurities
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310780262.3A
Other languages
English (en)
Inventor
李国相
颜世强
张威风
车颜婷
张成宇
林彬
何淑旺
胡醒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dayin High Tech Children Medicine Research Institute Co ltd
Shandong Dyne Marine Biopharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Dayin High Tech Children Medicine Research Institute Co ltd
Shandong Dyne Marine Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dayin High Tech Children Medicine Research Institute Co ltd, Shandong Dyne Marine Biopharmaceutical Co Ltd filed Critical Beijing Dayin High Tech Children Medicine Research Institute Co ltd
Priority to CN202310780262.3A priority Critical patent/CN116813630A/zh
Publication of CN116813630A publication Critical patent/CN116813630A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/52—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/16—Peri-condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本申请提供一种盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法。所述盐酸石蒜碱硫酯的杂质杂质如式I～式VI所示，这些杂质化合物中的一个或多个作为杂质对照品用于控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量。本发明提供的检测盐酸石蒜碱硫酯的杂质的方法专属性、检测限和定量限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性和耐用性等方面均经详细认证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好，实用性强。

Description

盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法
技术领域
本发明涉及药学分析技术领域，具体涉及一种盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
经研究发现石蒜碱对多种病毒都有抑制作用，在体外能抑制肠道病毒EV71的复制，在小鼠的手足口模型中，可以降低肌肉中的病毒载量，缓解症状，减低小鼠的死亡率。盐酸石蒜碱硫酯为盐酸石蒜碱的前体药物，在体内分解为盐酸石蒜碱和对氟苯硫乙酸。盐酸石蒜碱硫酯的化学结构式如下：
在实际临床领域中，药品在临床使用过程中产生的不良反应，除了与药品主要活性成分的药理活性有关外，还与药品中存在的杂质有关联。目前，注射用盐酸石蒜碱硫酯为中国化学药品注册分类1.1类新药，现有技术中没有关于盐酸石蒜碱硫酯原料药及其制剂中杂质的检测方法的资料记载。
发明内容
因此，为保证盐酸石蒜碱硫酯原料药及其制剂的安全性和有效性，本发明提供了控制盐酸石蒜碱硫酯原料药及其制剂的质量的杂质，并建立了一种能有效检测盐酸石蒜碱硫酯中可能存在的这些杂质、并将这些杂质与盐酸石蒜碱硫酯进行有效分离和定量的方法。
具体地，本发明提供了下述的技术方案。
在研究过程中，发明人发现盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中主要存在工艺杂质和降解杂质，其结构分别如式I至式VI所示：
本发明确定了这些杂质，并提供了部分杂质的制备方法，同时提供了式I至式VI所示化合物作为杂质在控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量中应用，以及检测这些化合物的方法，和以这些化合物作为对照品控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量的方法。
首先，在本发明的第一方面，提供了下述式I～式VI所示化合物中的一个或多个在控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量中的应用：
在本发明的实施方式中，上述化合物中的一种或多种作为盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的杂质对照品，式I～式VI所示化合物在本发明中也分别被命名为杂质I、杂质Ⅱ、杂质III、杂质IV、杂质V、杂质IV。
在本发明的一些实施方式中，所述盐酸石蒜碱硫酯的制剂为注射用盐酸石蒜碱硫酯，优选为注射用冷冻干燥无菌粉末，其中，注射用盐酸石蒜碱硫酯为中国化学药品注册分类1.1类新药。
在本发明的一些实施方式中，所述注射用冷冻干燥盐酸石蒜碱硫酯无菌粉末由原料药盐酸石蒜碱硫酯和辅料组成。比如在本发明的一个实施方式中，所述辅料为无水柠檬酸，原料药与辅料的质量比为4:1，其规格为5mg/支。可通过本领域常规的制备方法制备得到。或者，在本发明的一个实施方式中，所述注射用冷冻干燥盐酸石蒜碱硫酯无菌粉末的制备方法包括：将原料药盐酸石蒜碱硫酯和辅料无水柠檬酸混合均匀后加入到注射用水中，搅拌至溶解，调节溶液至pH至2.7～3.3之间，将溶液分装、冻干、密封，得到盐酸石蒜碱硫酯注射用冻干粉末。在本发明的一些实施方式中，调节pH可采用1mol/L的无水柠檬酸溶液或氢氧化钙饱和溶液的上清液，优选采用1mol/L的无水柠檬酸溶液。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种用于检测盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中杂质的方法，所述方法采用高效液相色谱法，所述方法包括：以磷酸盐缓冲液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，以甲醇溶液作为对照品溶剂和空白溶剂；
其中，述盐酸石蒜碱硫酯的结构为：
所述杂质包括杂质I、II、III、IV、V和VI，其结构如下所示：
在本发明的实施方案中，以磷酸盐缓冲液作为流动相A，以乙腈作为流动相B的流动相体系能够很好的实现杂质之间以及杂质与API(药物活性成分，在本发明中为盐酸石蒜碱硫酯)之间分离，分离度可在1.5以上；更换流动相体系，比如将磷酸盐缓冲液更换为水，和/或将乙腈更换为甲醇或者甲醇和乙腈的混合液，都无法将各杂质之间或者杂质与API之间实现良好的分离。
在本发明的一些实施方式中，磷酸盐缓冲溶液的pH为2.9～3.1。
在本发明的实施方式中，磷酸盐缓冲溶液在pH 2.9～8.0之间，通过调整洗脱梯度，可以使各杂质和主峰之间良好分离；但是，在一些实施方式中，当磷酸盐缓冲溶液pH值≥5.0时，杂质III色谱峰严重拖尾，无法准确积分得到其含量；在一些实施方式中，当磷酸盐缓冲溶液pH值为4.0时，杂质VI与高温下产生的某未知杂质无法完全分离；在一些实施方式中，当磷酸盐缓冲溶液pH值为2.9～3.1时，各杂质色谱峰峰型良好，且分离度符合要求，因此，在本发明中，较为优选的磷酸盐缓冲溶液的pH值为2.9～3.1。
在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液，比如，可通过加水溶解磷酸二氢钾后使用磷酸调节pH值获得，在本发明的一些实施方式中，磷酸二氢钾缓冲液的配制包括：称取磷酸二氢钾1.36g，加水1000mL使溶解，磷酸调节pH值至2.9～3.1。
在本发明的一些实施方式中，甲醇溶液中甲醇比例为60％～100％。在本发明中如无特殊说明，当甲醇溶液中甲醇的比例低于100％时，所述甲醇溶液是指甲醇的水溶液。
在本发明的实施方式中，在实验过程中，发明人发现在保留时间(RT)24.2min处有一未知杂质，采用甲醇溶液作为空白溶剂和溶解杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品的溶剂时，该杂质的含量会随着甲醇浓度的变化而有所改变，当甲醇溶液中甲醇的比例升至60％和70％时，该杂质峰面积无显著变化，因此，在本发明中，较为优选的甲醇溶液中甲醇的比例为60％～100％。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：配制对照品贮备液，并使用对照品贮备液配制加标供试品溶液，然后取空白溶剂和加标供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定。
比如，在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：
精密称取六种杂质即杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品，分别用甲醇水溶液溶解并定容，分别得到杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品贮备液；
取供试品，加水复溶，得供试品水溶液，精密吸取供试品水溶液至容量瓶，分别向容量瓶中加入杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品贮备液，用甲醇水溶液稀释至容量瓶刻度，得加标供试品溶液；
分别取等量的甲醇水溶液和加标供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定。
在本发明的一些实施方式中，所述方法的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
检测波长：290nm
流速：1.1～1.3mL/min
进样量：10μL
柱温：38℃～42℃。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：使用流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱程序为(下述比例为体积比)：
第0～5min，保持流动相A和流动相B的比例为95:5；
第5～15min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为80:20；
第15～23min，保持流动相A和流动相B的比例为80:20；
第23～25min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为70:30；
第25～35min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为55:45；
第35～36min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为20:80；
第36～45min，保持流动相A和流动相B的比例为20:80；
第45～46min，提高流动相A的比例，同时降低流动相B的比例至两者比例回到初始条件95:5；
第46～52min，保持流动相A和流动相B的比例为95:5。
比如，在本发明的一些实施方式中，杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品贮备液中杂质I、II、III、IV、V和VI的质量体积浓度均为0.05～0.2mg/mL，优选为0.1mg/mL。
比如，在本发明的一些实施方式中，供试品水溶液中盐酸石蒜碱硫酯的质量体积浓度为2mg/mL。
比如，在本发明的一些实施方式中，加标供试品溶液中盐酸石蒜碱硫酯的质量体积浓度为0.8mg/mL。
比如，在本发明的一些实施方式中，加标供试品溶液中杂质I、II、III、IV、V和VI的质量体积浓度均为4～10μg/mL，优选为4μg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述盐酸石蒜碱硫酯的制剂为注射用盐酸石蒜碱硫酯，优选为注射用冷冻干燥无菌粉末。
本发明上述实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
如无特殊说明，本发明中所述的数值范围包括此范围内所有的数值，并且包括此范围内任意两个数值组成的范围值。比如，pH为2.9～3.1，此数值范围包括2.9至3.1之间所有的数值，并且包括此范围内任意两个数值(例如：3.0、3.1)组成的范围值(3.0～3.1)；本发明所有实施方式中出现的同一指标的不同数值，可以任意组合，组成范围值。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量的方法，其包括以式I～式VI所示化合物作为杂质对照品，然后检测盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中的杂质；其中，所述检测盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中杂质的方法如上述第二方面中所述。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种化合物，其结构如式IV或式V所示：
在本发明的第五方面，本发明提供了制备式IV所示化合物的方法，其包括：使石蒜碱硫酯发生氧化得到式IV化合物。
在本发明的一个实施方式中，制备式IV所示化合物的方法包括：
a)将石蒜碱硫酯与无水乙酸混合，使之溶解；
b)在室温下向溶液中滴加双氧水，使石蒜碱硫酯发生氧化反应，生成式IV化合物。
进一步地，在上述实施方式中，可通过分离纯化的方法获得式IV化合物，比如，在本发明的一些实施方式中，可通过c)将反应液减压浓缩并用硅胶柱层析法进行纯化，得到式IV化合物。
以及，本发明提供了制备式V所示化合物的方法，其包括：使石蒜碱硫酯与对氟苯硫乙酸发生缩合反应生成式V化合物。
在本发明的一个实施方式中，制备式V所示化合物的方法包括：
a)将石蒜碱硫酯溶解于二氯甲烷中，室温下向溶液中加入对氟苯硫乙酸；
b)分次向反应液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，反应生成式V化合物。
进一步地，在上述实施方式中，可通过分离纯化的方法获得式V化合物，比如，在本发明的一些实施方式中，可通过c)将反应液冷却并分别用纯化水和10％氯化钠溶液洗涤，减压浓缩并用硅胶柱层析法进行纯化，得到式V化合物。
在本发明的上述实施方式中，石蒜碱硫酯可通过使盐酸石蒜碱硫酯发生水解反应获得，比如，在本发明的一些实施方式中，生成或获得石蒜碱硫酯的方法包括：
a)将盐酸石蒜碱硫酯与乙酸乙酯和纯化水混合，使之形成悬浮液；
b)在室温下向悬浮液中滴加氨水，使盐酸石蒜碱硫酯发生水解反应，生成石蒜碱硫酯。
进一步地，可分离获得石蒜碱硫酯，比如在本发明的一些实施方式中，可通过分液的方式，比如c)分离有机相和水相，将有机相干燥并减压浓缩，得到石蒜碱硫酯。
相较于现有技术，本发明的优势包括：
本发明提供了盐酸石蒜碱硫酯的杂质，分别为如式I～式IV所示的杂质I～IV、这些杂质作为对照品用于控制盐酸石蒜碱硫酯原料药及其制剂的质量，以及提供了检测、分离盐酸石蒜碱硫酯的杂质的方法。本发明采用高效液相色谱法，将杂质和盐酸石蒜碱硫酯进行有效分离，并对注射用盐酸石蒜碱硫酯样品中的杂质进行定量检测，该检测方法采用外标法，其专属性、检测限和定量限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性和耐用性等方面均经详细认证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。
本发明实用性强，在实际检验过程中，其检测限低至0.008μg/mL，定量限低至0.028μg/mL，灵敏度高，适用性强，检验过程简单、快捷。
本发明所述的高效液相色谱法，其测定条件中包含的范围内均为有效值，即：在各参数范围内取任意值后，也能准确的检测出样品中的各个杂质，且能对杂质和盐酸石蒜碱硫酯进行有效分离。在实际检测中，便于检测人员对参数的调整和避免人为误差对检测结果产生的影响，耐用性优异，适宜推广使用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：下述附图中横坐标均为时间(minutes)，纵坐标均为吸光度(AU)。
图1：实施例1中HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右标记的峰依次为杂质Ⅰ(Impurity 1，RT 6.573min)、杂质Ⅲ(Impurity 3，RT 17.491min)、杂质Ⅳ(Impurity4，RT 20.749min)、API(RT 30.555min)杂质Ⅱ(Impurity 2，RT 31.199min)、杂质Ⅵ(Impurity 6，RT 31.452min)、杂质Ⅴ(Impurity 5，RT 34.693min)。
图2：实施例2中流动相系统为甲醇-水时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右标记出的RT值依次分别为10.627min、24.816min、25.143min、25.333min、26.941min、27.649min、28.004min(API)、28.385min、29.033min、29.340min、29.551min、29.658min、31.236min。
图3：实施例2中流动相系统为乙腈-水时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右标记出的RT值依次分别为4.288min、4.479min、12.185min、12.821min、14.760min、17.409min、18.935min(API)、25.394min、27.612min、27.995min、31.028min、31.933min、33.387min、33.833min。
图4：实施例2中流动相系统为甲醇-乙腈-水时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右依次标记出的RT值分别为11.284min、20.782min、21.142min、26.348min、27.402min(API)、37.062min、41.898min、45.276min。
图5：实施例3中磷酸盐缓冲液pH为8.0时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右依次标记出的RT值分别为15.538min、16.302min、17.951min、29.936min、31.039min、32.899min、42.438min(API)、44.413min、52.808min。
图6：实施例3中磷酸盐缓冲液pH为4.0时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右依次标记出的RT值分别为6.311min、17.200min、21.554min、26.499min、30.165min、31.085min、32.083min(API)、50.719min。
图7：实施例4中甲醇：水(5:95)溶解样品时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右标记出的RT值分别为14.302min、18.846min、19.865min(API)、24.260min。
图8：实施例4中甲醇：水(20:80)溶解样品时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右标记出的RT值分别为14.249min、18.825min、19.860min(API)、24.257min。
图9：实施例4中甲醇：水(70:30)溶解样品时的HPLC杂质检测色谱图；其中，色谱图中从左至右标记出的RT值分别为14.164min、18.807min、19.843min(API)、24.256min。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
制备例
制备例1、杂质III的制备
制备方法：
将石蒜碱INA(3.75g,13.06mmol)及SeO2(2.50g,22.53mmol)悬浮于EtOH(30mL)中，加热回流反应4.0h后，趁热过滤。滤液减压浓缩得黄色固体。将所得黄色固体用4M NaOH溶液处理得到黄色絮凝体。采用10000r/min离心45min收集粗品。所得粗品采用乙醇重结晶得浅橙色针状物0.76g。
将上述所得浅橙色针状物0.40g溶于水，室温下用1M HCl(40mL)处理。离心(10000r/min×30min)立即产生淡黄色沉淀。收集沉淀物于137℃下干燥，得杂质III，该化合物可作为对照品用于下述实施例中。
制备例2、杂质IV的制备
制备方法：
1.0L圆底烧瓶中将盐酸石蒜碱硫酯(17.7g,35.9mmol)悬浮于300mL乙酸乙酯及300mL纯化水的混合溶剂中，室温搅拌下缓慢滴加氨水(8.3mL,179.6mmol)，滴加完毕继续搅拌0.5h后分液，有机相用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得石蒜碱硫酯，备用。
250mL圆底烧瓶中，将石蒜碱硫酯(9.1g,20.0mmol)溶于60mL无水乙酸中，室温搅拌下滴加30％双氧水(4.0mL，40.0mmol)。35℃下搅拌反应10.0h，减压浓缩后得到粘稠状液体，硅胶柱层析得杂质IV，该化合物可作为对照品用于下述实施例中。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.60–7.40(m,2H),7.15(td,J＝8.5,3.8Hz,2H),6.59(d,J＝7.7Hz,1H),6.55(s,1H),5.92(dd,J＝11.8,7.4Hz,2H),5.61(s,1H),5.48(s,1H),4.17–3.98(m,2H),3.68(ddd,J＝32.9,31.7,13.3Hz,2H),3.54–3.40(m,1H),3.38–3.30(m,1H),2.89–2.79(m,1H),2.72–2.48(m,3H),2.35(dq,J＝17.6,8.8Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.25,163.79,146.57,146.48,146.36,144.02,138.39,138.20,129.51,129.38,126.87,126.80,126.68,126.61,126.35,126.32,117.16,117.05,116.87,116.83,116.69,116.65,107.53,107.43,104.90,104.74,101.08,101.03,74.48,74.27,69.29,61.56,61.41,61.38,60.88,56.84,56.78,53.65,53.62,39.27,28.52.
制备例3、杂质V的制备
制备方法：
1.0L圆底烧瓶中将盐酸石蒜碱硫酯(17.7g,35.9mmol)悬浮于300mL乙酸乙酯及300mL纯化水的混合溶剂中，室温搅拌下缓慢滴加氨水(8.3mL,179.6mmol)，滴加完毕继续搅拌0.5h后分液，有机相用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得石蒜碱硫酯，备用。
500mL圆底烧瓶中，将石蒜碱硫酯(13.0g,28.5mmol)溶于180mL二氯甲烷中，室温搅拌下加入对氟苯硫乙酸(6.3g，34.3mmol)。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(9.9g，51.3mmol)及4-二甲氨基吡啶(0.7g，5.7mol)均分三次加入，每次间隔0.5h。加毕，35℃下保温搅拌2.0h后，将体系自然降温至25℃以下，反应液依次用200mL纯化水、10％氯化钠溶液200mL各洗涤一次，减压浓缩后得到粘稠状液体，硅胶柱层析得杂质V，该化合物可作为对照品用于下述实施例中。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.45(dd,J＝8.5,5.2Hz,2H),7.18(dd,J＝8.5,5.2Hz,2H),7.00(t,J＝8.6Hz,2H),6.89(t,J＝8.6Hz,2H),6.59(s,1H),6.55(s,1H),5.91(d,J＝2.3Hz,2H),5.58(s,1H),5.36(s,1H),5.14(s,1H),4.12(d,J＝14.1Hz,1H),3.63–3.51(m,2H),3.44(dd,J＝15.2,5.5Hz,3H),3.35(dd,J＝9.9,4.7Hz,1H),2.75(d,J＝10.4Hz,1H),2.58(dd,J＝25.6,8.5Hz,3H),2.40–2.29(m,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ168.67,168.40,163.53,163.22,161.56,161.25,146.84,146.45,133.96,133.89,132.99,132.93,129.40,129.31,129.29,125.92,116.43,116.25,116.22,116.05,113.03,107.36,104.99,101.06,71.62,70.01,61.02,56.82,53.54,40.48,37.82,37.26,28.68.
制备例4、杂质VI的制备
该化合物可按照中国专利CN115974890A“石蒜碱衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用”中的实施例1-4制备得到，中国专利申请CN115974890A的全部内容在此引用并纳入本说明书的一部分。
合成路线：
制备方法：
2.0L圆底烧瓶中将盐酸石蒜碱RSMA(48.0g,148mmol)悬浮于0.96L纯化水中，搅拌升温至60℃使其完全溶解。60℃下缓慢滴加氨水(30.0mL,444mmol)，约20min滴加完毕，滴加完毕关闭加热自然降温至室温。继续搅拌2.0h后过滤，滤饼用0.3L纯化水打浆2次。60℃下真空干燥8.0h得白色粉末状石蒜碱。
2.0L圆底烧瓶中将石蒜碱INA(19.1g,66mmol)悬浮于0.2L DMF中，室温搅拌下依次加入咪唑(6.8g,99mmol)及叔丁基二甲基氯硅烷(10.5g,99mmol)。升温至40℃使反应体系完全溶解，保温搅拌4.0h后，将体系自然降温至25℃以下，向反应体系中依次加入0.5L乙酸乙酯及0.75L纯化水，室温搅拌10min后分液，有机相用0.5L 10％氯化钠溶液洗涤，分液后有机相用无水硫酸钠20.0g干燥，过滤，45℃减压浓缩至无溶剂蒸出，得到粘稠状液体，柱层析得到INB，备用。
500mL圆底烧瓶中，将INB(8.1g,19.8mmol)溶于240mL二氯甲烷中，室温搅拌下加入乙酰丙酸(3.5g，30.3mmol)。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(3.5g，17.8mmol)及4-二甲氨基吡啶(0.1g，0.9mol)均分三次加入，每次间隔0.5h。加毕，35℃下保温搅拌6.0h后，将体系自然降温至25℃以下，反应液依次用200mL纯化水、10％氯化钠溶液200mL各洗涤一次，减压浓缩后得到粘稠状液体INE，备用。
250mL圆底烧瓶中，将上步所得INE溶于120mL无水乙醇中，室温搅拌下滴加浓盐酸(6.6mL，39.6mmol)。滴加完毕升温至60℃，保温搅拌2.0h后自然降温。将反应体系倒入300mL乙酸乙酯及300mL纯化水的混合溶液中，滴加8.0mL氨水，搅拌10min后分液，有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩，硅胶柱层析得INF，备用。
250mL圆底烧瓶中，将INF(4.2g,10.9mmol)溶于120mL二氯甲烷中，室温搅拌下加入对氟苯硫乙酸(3.0g，16.4mmol)。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(3.8g，19.6mmol)及4-二甲氨基吡啶(0.1g，0.9mol)均分三次加入，每次间隔0.5h。加毕，35℃下保温搅拌4.0h后，将体系自然降温至25℃以下，反应液依次用200mL纯化水、10％氯化钠溶液200mL各洗涤一次，减压浓缩后得到粘稠状液体，硅胶柱层析得ING，备用。
250mL圆底烧瓶中，将ING(2.6g,4.7mmol)溶于75mL二氯甲烷：甲醇＝4:1的混合溶剂中，室温搅拌下滴加醋酸肼甲醇溶液14.5mL。0.5h后反应完毕，向反应体系中加入75mL饱和碳酸氢钠溶液分液，10％氯化钠溶液100mL洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到粘稠状液体，硅胶柱层析得杂质VI，该化合物可作为对照品用于下述实施例中。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53–7.37(m,2H),7.10–6.92(m,2H),6.65(s,1H),6.59(s,1H),5.93(d,J＝12.0Hz,2H),5.36(s,1H),5.29(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(s,1H),4.13(d,J＝14.1Hz,1H),3.58(s,2H),3.50(d,J＝14.0Hz,1H),3.34(ddd,J＝9.1,6.0,3.5Hz,1H),2.77(d,J＝10.5Hz,1H),2.61(d,J＝9.0Hz,3H),2.36(dt,J＝19.8,9.9Hz,2H)；13C NMR(126MHz,CDCl3)δ169.23,163.38,161.41,146.66,146.61,146.41,133.37,133.30,130.01,129.48,129.46,126.93,116.39,116.22,113.09,107.70,104.58,101.07,74.68,68.88,60.66,56.97,53.71,41.64,37.67,28.76。
实施例1
S1、流动相的配制：
流动相A：称取磷酸二氢钾1.36g，加水1000mL使溶解，磷酸调节pH值至3.0。
流动相B：乙腈
S2、对照品贮备液：精密称取杂质Ⅰ(购自西安天宝生物科技有限公司，CAS：2188-68-3)、Ⅱ(购自安徽省庆云医药股份有限公司，CAS：332-51-4)、Ⅲ(制备例1，CAS:2121-16-6)、Ⅳ(制备例2)、Ⅴ(制备例3)、Ⅵ(制备例4)对照品各10mg，分别置100mL量瓶中，加70％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；
S3、加标供试品溶液的制备：取本品(注射用冷冻干燥盐酸石蒜碱硫酯无菌粉末，5mg/支，山东达因海洋生物制药股份有限公司)10支，各加2.5mL水复溶，转至同一25mL容量瓶，混匀，精密吸取2mL至5mL量瓶，分别加入杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ对照品贮备液各200μL，加70％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀；
S4、分别取70％甲醇水溶液、加标供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示。
色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kromasil，C18，5μm，4.6×250mm)
检测波长：290nm
流速：1.2mL/min
进样量：10μL
柱温：40℃
采用上述色谱条件，使用流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，其中，线性梯度洗脱见表1：
表1线性梯度洗脱程序
由图1的结果显示：加标供试品溶液中杂质出峰顺序依次为杂质Ⅰ(对应图1中标示的Impurity 1)、杂质Ⅲ(Impurity 3)、杂质Ⅳ(Impurity 4)、杂质Ⅱ(Impurity 2)、杂质Ⅵ(Impurity 6)、杂质Ⅴ(Impurity 5)，相对保留时间分别为0.20、0.56、0.67、1.03、1.04和1.30，最小分离度分为1.67，加标供试品溶液中杂质均能完全达到基线分离。
实施例2
与实施例1相比，改变流动相系统，分别将流动相系统更换为1)甲醇-水、2)乙腈-水和3)甲醇-乙腈-水(3:5:2，v/v/v)，色谱条件见表2，典型图谱见图2、图3和图4。
表2流动相条件
如图2～4中所示，在上述三种各流动相系统下，均无法使各杂质之间或杂质与主峰之间保持良好的分离度，以及即便在此流动相系统的基础上调整梯度条件，依然无法使各杂质之间或杂质与主峰之间保持良好的分离度。
实施例3
与实施例1相比，改变流动相A(水相)的pH值，分别将pH值调节至4.0、5.0、6.0和8.0，色谱条件见表3，典型色谱图见图5、图6。
表3不同pH值的磷酸盐缓冲液
名称 色谱条件
样品 配制供试品浓度为0.8mg/mL
流动相系统 乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾
水相pH值 4.0、5.0、6.0、8.0
色谱柱 Kromasil，C18，5μm，4.6×250mm
在上述pH条件下，通过调整梯度，可以使各杂质和主峰之间良好分离；但是，当水相pH值≥5.0时，杂质III色谱峰严重拖尾，无法准确积分得到其含量，当水相pH值为4.0时，杂质VI与高温下产生的未知杂质无法完全分离。
此外，该实施例中相同条件下还同时考察了甲醇-0.01moL/L磷酸二氢钾流动相系统的情况，但均未能使各杂质良好分离。
实施例4
与实施例1相比，采用不同浓度的甲醇水溶液作为对照品溶剂和空白溶剂，浓度条件见表4，结果见图7、图8和图9。
表4不同浓度的甲醇溶液结果
实验过程中，在RT 24.2min处发现一未知杂质，该杂质的含量会随着甲醇溶液浓度的变化而有所改变，当甲醇-水中甲醇的比例升至60％和70％时，该杂质峰面积无显著变化。
实施例5方法考察
对实施例1中所述方法分别进行了检测限和定量限、线性与范围、精密度、准确度、溶液的稳定性和耐用性的考察考察方法及结果分别如下：
1、检测限和定量限：将已知浓度的杂质贮备液(对照品储备液)稀释至低浓度进样，测出信噪比(S/N)，计算出能被可靠的检出的最低浓度或百分比，即根据信噪比来确定潜在的已知杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。结果如表5所示。
表5各杂质定量限和检测限实验结果
根据表5结果可知，本发明实施例1中所述方法其检测限可低至0.008μg/mL，定量限低至0.028μg/mL。
2、线性与范围：对已知杂质，在LOQ浓度至不低于200％指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的峰面积对被分析物浓度作图，用最小二乘法进行线性回归，结果见表6。
表6各杂质线性实验结果
线性方程 r
杂质Ⅰ y＝2874.1x+50.28 0.9999
杂质Ⅱ y＝1655x–67.709 0.9999
杂质Ⅲ y＝33886x-1773.4 0.9999
杂质Ⅳ y＝4191.5x-137.51 0.9999
杂质Ⅴ y＝4334.3x-315.43 0.9998
杂质Ⅵ y＝5141.5x-332.23 0.9999
根据表6结果可知，所有相关系数r值均大于0.999，这说明本发明实施例1的方法具有很好的线性关系，并且在所研究的线性范围内，可以通过线性方程来进行信号与浓度的转换，从而得到准确的含量或杂质测定结果。
3、精密度：配制6个供试品溶液，向6份溶液中加入限度浓度的已知杂质，考察峰面积的RSD情况，RSD(即相对标准偏差)是一种用来评价测定结果的精密度的指标，能够反映多次重复测定同一被分析物时各测定值之间的接近程度。计算公式如下：
其中，s是标准偏差，/>是平均值。结果见表7。
表7精密度实验结果
根据表7结果显示：6份供试品溶液中，峰面积的RSD均不超过10％，均符合要求，方法精密度良好。
4、准确度：通过在供试品中加入规定限度的50％、100％、150％三个不同浓度各已知杂质，再测定加样样品中已知杂质的测定结果和理论值之间的比值(回收率)，回收率是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用百分比表示。回收率越接近100％，说明准确度越高。回收率的计算公式如下：
回收率＝[(测得量-样品中量)/加入量]×100％，结果见表8。
表8各杂质回收率测定结果
杂质Ⅰ 杂质Ⅱ 杂质Ⅲ 杂质Ⅳ 杂质Ⅴ 杂质Ⅵ
平均回收率(％) 103.57 98.67 100.09 96.75 98.14 98.27
RSD(％) 2.6 5.4 0.9 3.6 1.9 1.5
结果：各个杂质回收率均在96.75％～103.57％之间，RSD均小于6％，方法具有良好的准确度。
5、溶液稳定性：取精密度项下配制的供试品溶液，分别在0～23h不同时间点进样，测定杂质峰面积，结果见表9。
表9供试品溶液稳定性试验结果
结果：溶液配制后在室温条件下23h内稳定，供试品溶液中各杂质峰面积RSD％均小于2.0％。
6、耐用性：通过改变流速、柱温、pH值、更换不同序列号色谱柱来评估测定条件有微小变动时，测定结果受影响的耐受程度，其中初始条件即实施例1中的条件，改变的条件及试验结果见表10。
表10耐用性试验结果
根据表10结果可知，测定条件参数有微小变动时，包括在下述范围内变动时：1)不同柱温(38℃～42℃)；2)不同pH值(2.9～3.1)；3)不同流速(1.1mL/min～1.3mL/min)；4)不同序列号色谱柱，均不影响结果的测定，各杂质的分离度均大于1.5，且各已知杂质含量测定结果与初始条件测定差值均小于0.3％。
以上方法学验证结果表明：本发明实施例1测定注射用盐酸石蒜碱硫酯中的杂质含量，专属性强，准确度、精密度高，耐用性好，适用于注射用盐酸石蒜碱硫酯中杂质的准确控制。
以上所述仅为本申请的优选实施例，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.式I～式VI所示化合物中的一个或多个在控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量中的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式I～式VI所示化合物中的一个或多个在控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量的应用中作为杂质对照品使用。
3.一种用于检测盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中杂质的方法，其特征在于：所述方法采用高效液相色谱法，所述方法包括：以磷酸盐缓冲液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，以甲醇水溶液作为对照品溶剂和空白溶剂；
其中，述盐酸石蒜碱硫酯的结构为：
所述杂质包括杂质I、II、III、IV、V和VI，其结构如下所示：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述盐酸石蒜碱硫酯制剂为注射用盐酸石蒜碱硫酯；
优选地，磷酸盐缓冲溶液的pH为2.9～3.1；
优选地，甲醇水溶液中甲醇比例为60％～100％。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
精密称取六种杂质即杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品，分别用甲醇水溶液溶解并定容，分别得到杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品贮备液；
取供试品，加水复溶，得供试品水溶液，精密吸取供试品水溶液至容量瓶，分别向容量瓶中加入杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品贮备液，用甲醇水溶液稀释并定容至容量瓶刻度，得加标供试品溶液；
分别取等量的甲醇水溶液和加标供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定；
优选地，所述方法的色谱条件包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
检测波长：290nm
流速：1.1～1.3mL/min
进样量：10μL
柱温：38℃～42℃；
优选地，所述方法包括：使用流动相A和流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱程序为：
第0～5min，保持流动相A和流动相B的比例为95:5；
第5～15min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为80:20；
第15～23min，保持流动相A和流动相B的比例为80:20；
第23～25min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为70:30；
第25～35min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为55:45；
第35～36min，降低流动相A的比例，同时提高流动相B的比例至两者比例为20:80；
第36～45min，保持流动相A和流动相B的比例为20:80；
第45～46min，提高流动相A的比例，同时降低流动相B的比例至两者比例回到初始条件95:5；
第46～52min，保持流动相A和流动相B的比例为95:5。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，杂质I、II、III、IV、V和VI的对照品贮备液中杂质I、II、III、IV、V和VI的质量体积均为0.05～0.2mg/mL；
优选地，供试品水溶液中盐酸石蒜碱硫酯与水的质量体积之比为2mg/mL。
优选地，加标供试品溶液中盐酸石蒜碱硫酯的质量体积浓度为0.8mg/mL。
优选地，加标供试品溶液中杂质I、II、III、IV、V和VI的质量体积浓度均为4～10μg/mL。
7.一种控制盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂的质量的方法，其包括以式I～式VI所示化合物作为杂质对照品，然后检测盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中的杂质；其中，所述检测盐酸石蒜碱硫酯原料药或其制剂中杂质的方法如权利要求3至6中任一项所述。
8.一种化合物，其结构如式IV或式V所示：
9.制备式IV或式V所示化合物的方法，其包括：使石蒜碱硫酯发生氧化得到式IV化合物；
优选地，所述方法包括：将石蒜碱硫酯溶解，向溶液中滴加双氧水，使石蒜碱硫酯发生氧化反应，生成式IV化合物；
优选地，所述方法还包括分离纯化获得式IV化合物；
优选地，所述分离纯化的方法包括：将含有式IV化合物的反应液减压浓缩并用硅胶柱层析法进行纯化，得到式IV化合物。
10.制备式式V所示化合物的方法，其包括：使石蒜碱硫酯与对氟苯硫乙酸发生缩合反应生成式V化合物；
优选地，所述方法包括：将石蒜碱硫酯溶解，向溶液中加入对氟苯硫乙酸；并分次向反应液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，反应生成式V化合物；
优选地，所述方法还包括分离纯化获得式V化合物；
优选地，所述分离纯化的方法包括：将含有式V化合物的反应液冷却并分别用纯化水和氯化钠溶液洗涤，减压浓缩并用硅胶柱层析法进行纯化，得到式V化合物。
CN202310780262.3A 2023-06-28 2023-06-28 盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法 Pending CN116813630A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310780262.3A CN116813630A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310780262.3A CN116813630A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116813630A true CN116813630A (zh) 2023-09-29

Family

ID=88116345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310780262.3A Pending CN116813630A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116813630A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110494141A (zh) 含有被取代的多环性吡啶酮衍生物及其前药的药物组合物
CN102276624B (zh) 一种奥氮平有关物质及其制备方法和高效液相色谱分析方法
CN101671314B (zh) 一种非布索坦的晶型体及制备方法
CN102276592B (zh) 一种奥氮平有关物质及其制备方法、分析方法
CN103864819B (zh) 一种头孢他啶化合物及其药物组合物
CN105319294B (zh) 一种分离测定卡格列净及其有关物质的方法
CN108017631B (zh) 一种唑吡坦人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用
CN106706768B (zh) 一种分离测定恩格列净及其有关物质的方法
CN113461665A (zh) 二芳基衍生物及其制备方法和用途
CN102846600B (zh) 一种奥拉西坦药物活性组合物及其制备方法
CN111024831B (zh) 一种高效液相色谱法分离盐酸莫西沙星及其杂质的方法
CN116813630A (zh) 盐酸石蒜碱硫酯的杂质及其检测方法
ES2211113T3 (es) Compuesto de referencia de utilidad en el analisis de lotes de levosimendan.
CN114432249B (zh) 一种青蒿素/青蒿素衍生物固体分散体及其制备方法和应用
CN103467412B (zh) 用于痛风的药物化合物
CN108120772B (zh) 一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质检测方法
CN106543035B (zh) 一种苯腙类化合物、其制备方法、检测方法和用途
CN101821262A (zh) 藤黄胺,一种具有神经保护活性的选择性TrkA激动剂
CN109293682A (zh) 一种托法替布杂质及其制备方法
CN113646312B (zh) 固体形式的brd4抑制剂化合物及其制备方法与应用
CN104072491A (zh) 一种阿齐沙坦衍生化合物及其制备方法和应用
CN111285909A (zh) 光学活性双环醇葡萄糖苷及其制备方法和防治肝病的应用
CN109796441B (zh) 一种盐酸替比嘧啶的杂质a的制备方法
CN112250657B (zh) 一种双环醇二聚体、其制备方法及其用途
CN113698404B (zh) 一种低溶剂残留的六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-甲酰胺化合物及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination