CN108120772B - 一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质检测方法 - Google Patents

一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质检测方法 Download PDF

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    • G01N30/02—Column chromatography

Abstract

本发明提供了一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质的检测方法。该方法采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以有机相与水相的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，实现了依达拉奉及其有关物质与3个遗传毒性杂质在较短时间内的分离，具有较高的灵敏度和专属性，达到主成分及其他有关物质与遗传毒性杂质、遗传毒性杂质之间分离度均大于1.5。该方法工艺简单、成本低廉，检测方法科学、合理、客观，能够更好的控制依达拉奉的质量，具有实用价值。

Description

一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质检测方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，特别涉及一种改善急性脑梗塞所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍的依达拉奉及其氯化钠注射液的遗传毒性杂质检测方法。
背景技术
依达拉奉(Edaravone，3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)是目前最有效的脑梗死治疗药物之一，其分子式为C10H10N2O，174.20，结构式为：
Figure BDA0001166459720000011
依达拉奉注射液作为脑梗死治疗的首选一线用药。本品给药方式为静脉滴注。临床研究提示N-乙酰门冬氨酸(NAA)是特异性的存活神经细胞的标志，脑梗塞发病初期含量急剧减少。脑梗塞急性期患者给予依达拉奉，可抑制梗塞周围局部脑血流量的减少，可阻止脑水肿和脑梗塞的进展，并缓解所伴随的神经症状。机理研究提示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。
苯肼是依达拉奉合成工艺中的起始原料，且其为芳香胺类化合物，是可能具有遗传毒性的杂质，根据European Medicines Agency：Guideline on the Limits ofGenotoxic Impurities及遗传毒性杂质指导原则的相关要求可知，需对其进行严格控制。苯胺与联苯胺为苯肼的起始原料和工艺杂质，多批苯肼中可检出苯胺；二者均为具有致癌毒性的物质，若除去不完全而影响药物纯度和质量以及药效活性，增加药物的不良反应。
因此依达拉奉中遗传毒性杂质的检测及有效分离在依达拉奉的合成和依达拉奉氯化钠注射液过程中的质量控制及临床疗效方面具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质的检测方法。
本发明目的主要通过以下技术方案实现：一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法，色谱条件为：
检测器：紫外检测器，检测波长为210-230nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱；
柱温：20-40℃；
流动相流速：0.5-1.5ml/min；
进样量：10-100μl；
流动相：有机相与水相的混合溶剂作为流动相，梯度洗脱，洗脱条件为：
Figure BDA0001166459720000021
所述遗传毒性杂质为：
杂质1：苯肼；
杂质2：苯胺；
杂质3：联苯胺。
进一步地，所述有机相为甲醇或乙腈，所述水相为磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述水相为pH为3.0～5.0的磷酸二氢铵溶液，优选pH为4.0的磷酸二氢铵溶液。
进一步地，所述检测波长为226nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，进样量为50μl。
进一步地，所述梯度洗脱条件为：
Figure BDA0001166459720000022
。
或者所述梯度洗脱条件为：
Figure BDA0001166459720000023
。
或者所述梯度洗脱条件为：
Figure BDA0001166459720000024
。
或者所述梯度洗脱条件为：
Figure BDA0001166459720000025
Figure BDA0001166459720000031
。
另外，本发明对依达拉奉及其氯化钠注射液遗传毒性杂质检测过程中的溶液配制方法进行了研究：
1)取苯肼、苯胺和联苯胺对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，之后加入稀释剂稀释制成每1ml中约含苯肼、苯胺和联苯胺各1mg的溶液，作为各对照品储备液；精密量取1ml，分别置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为各杂质对照品溶液。
2)取依达拉奉适量，加甲醇适量使溶解，再用稀释剂稀释制成每1ml中约含依达拉奉1mg的溶液，作为供试品溶液1；
3)取依达拉奉氯化钠注射液直接进样分析，作为供试品溶液2。
其中稀释剂分别采用：甲醇、初始流动相和初始流动相调节pH至2.0的溶液，按上述色谱条件进样，考察各杂质在不同稀释剂下的溶液稳定性。结果显示，本品采用初始流动相作为稀释剂时溶液最稳定，且峰形好，适合检测，但需临用新制。
表1不同稀释剂筛选结果
Figure BDA0001166459720000032
本发明提供的依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质检测方法，实现了依达拉奉及其它有关物质杂质4、杂质5、杂质6及杂质7与3个遗传毒性杂质包括杂质1苯肼、杂质2苯胺及杂质3联苯胺的分离，其中杂质4、杂质5、杂质6、杂质7分别为：
杂质4：2-(3-甲基-5-羰基-1-苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-4-基)-2-磺酸基丙酸
杂质5：5,5',5”-三甲基-2,2',2”-三苯基-2,2”,4,4”-四氢-3H,3”H-[4,4':4',4”-三吡唑]-3,3',3”(2'H)-三酮或甲基-1,1”,2'-三苯基-1H,1”H-[4,4':4',4”-三吡唑]-3'(2'H)-酮
杂质6：2-(3-甲基-5-羰基-1-苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-4-基)丙烷-2-磺酸
杂质7：4,4’-双-(3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮)或3,3’-二甲基-1,1’-二苯基-1H,1H’-4,4’-联吡唑-5,5’-二醇(杂质4、5、6、7为依达拉奉及依达拉奉氯化钠注射液中的已知杂质)。
本方法具有较高的灵敏度和专属性，操作简单，达到主成分及其他有关物质与遗传毒性杂质、遗传毒性杂质之间的分离度均大于1.5，可用于依达拉奉的质量控制，具有实用价值。该方法工艺简单、成本低廉；采用梯度洗脱的方法，检测方法科学、合理、客观，从而能够更好的控制依达拉奉的质量，具有实用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的HPLC图谱。
图2为本发明实施例2的HPLC图谱。
图3为本发明对照例的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述，检测方法参照高效液相法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。
实施例1高效液相色谱法测定依达拉奉及其杂质，考察该条件的分离效果
1)仪器与检测条件：
检测器：紫外检测器，检测波长为226nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Kromasil C18，4.6×250mm，5μm适用)；
柱温：30℃；
流动相：水相为0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(pH＝4.0)，有机相为甲醇；
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
Figure BDA0001166459720000041
流动相流速：1.0ml/min；
进样量：50μl。
2)溶液配制
取杂质1苯肼、杂质2苯胺、杂质3联苯胺、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7和依达拉奉及其注射液对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并用初始流动相稀释制成适当浓度，作为对照品溶液。
3)测定方法及结果
按1)色谱条件进样，考察各杂质之间的分离度。结果显示，各杂质之间分离良好。
表1依达拉奉中各杂质峰归属及分离情况
出峰顺序 保留时间，分钟 分离度
杂质4 2.4 6.5
杂质1 4.3 5.4
杂质2 5.3 3.5
杂质3 6.5 4.7
杂质6 8.2 23
依达拉奉 16.0 3.2
杂质7 17.2 25.2
杂质5 22.1 -
实施例2高效液相色谱法测定依达拉奉及其杂质，考察该条件的分离效果
1)仪器与检测条件：
检测器：紫外检测器，检测波长为226nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Kromasil C18，4.6×250mm，5μm适用)；
柱温：30℃；
流动相：水相为0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(pH＝5.0)；有机相为甲醇；
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
Figure BDA0001166459720000051
流动相流速：1.5ml/min；
进样量：50μl。
2)溶液配制方法同实施例1。
3)测定方法及结果
按1)色谱条件进样，考察各杂质之间的分离度。结果显示，各杂质之间分离良好。
表2依达拉奉中各杂质峰归属及分离情况
Figure BDA0001166459720000052
Figure BDA0001166459720000061
实施例3高效液相色谱法测定依达拉奉及其杂质，考察该条件的分离效果
1)仪器与检测条件：
检测器：紫外检测器，检测波长为224nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Kromasil C18，4.6×250mm，5μm适用)；
柱温：20℃；
流动相：水相为0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(pH＝3.0)；有机相为甲醇；
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
Figure BDA0001166459720000062
流动相流速：0.5ml/min；进样量：50μl。
2)溶液配制方法同实施例1。
3)测定方法及结果
按1)色谱条件进样，考察主成分与各杂质、各杂质之间的分离度。结果显示，主成分与各杂质、各杂质之间分离良好。
表3依达拉奉中各杂质峰归属及分离情况
出峰顺序 保留时间，分钟 分离度
1杂质4 2.8 6.7
杂质1 4.5 5.4
杂质2 5.6 3.2
杂质3 6.6 4.9
杂质6 8.4 22.8
依达拉奉 17.1 3.2
杂质7 18.3 25.7
杂质5 24.1 -
实施例4高效液相色谱法检测依达拉奉原料药中遗传毒性杂质
1)仪器与检测条件：
检测器：紫外检测器，检测波长为226nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Kromasil C18，4.6×250mm，5μm适用)；
柱温：40℃；
流动相：水相为0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(pH＝4.0)；有机相为甲醇；
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
Figure BDA0001166459720000071
流动相流速：1.0ml/min；
进样量：50μl。
2)取依达拉奉原料适量，精密称定，加初始流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。另取苯肼、苯胺和联苯胺适量，精密称定，加初始流动相溶解并稀释制成每1ml中约含苯肼0.02μg、苯胺0.2μg和联苯胺0.1μg的溶液，作为对照品溶液。
3)测定方法及结果
按1)色谱条件进样，考察各杂质的检测灵敏度，主成分与各杂质、各杂质之间的分离度，并根据测试结果计算样品中这几个杂质的含量。结果显示，该浓度下各杂质的检测灵敏度良好(信噪比S/N均大于10)，主成分与各杂质、各杂质之间分离良好，样品中苯肼、苯胺和联苯胺均未检出。
实施例5高效液相色谱法检测依达拉奉氯化钠注射液中遗传毒性杂质
1)仪器与检测条件：
检测器：紫外检测器，检测波长为226nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Kromasil C18，4.6×250mm，5μm适用)；
柱温：30℃；
流动相：水相为0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(pH＝4.0)；有机相为甲醇；
按下表进行梯度洗脱，洗脱条件：
Figure BDA0001166459720000081
流动相流速：1.0ml/min；
进样量：50μl。
2)以依达拉奉氯化钠注射液作为供试品溶液。另取苯肼、苯胺和联苯胺适量，精密称定，加初始流动相溶解并稀释制成每1ml中约含苯肼0.15μg、苯胺0.1μg和联苯胺0.05μg的溶液，作为对照品溶液。
3)测定方法及结果
按1)色谱条件进样，考察各杂质的检测灵敏度，主成分与各杂质、各杂质之间的分离度，并根据测试结果计算样品中这几个杂质的含量。结果显示，该浓度下各杂质的检测灵敏度良好(信噪比S/N均大于10)，主成分与各杂质、各杂质之间分离良好，样品中苯肼、苯胺和联苯胺均未检出。
对照例
高效液相色谱法测定依达拉奉及其已知杂质的混合溶液，考察该条件的分离效果
1)仪器与检测条件：
检测器：紫外检测器，检测波长为226nm；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶(Kromasil C18，4.6×250mm,5μm适用)；
柱温：30℃；
流动相：0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(pH＝3.5)：甲醇＝70：30，等度洗脱；
流动相流速：1.0ml/min；
进样量：50μl。
2)溶液配制方法同实施例1。
3)测定方法及结果
按1)色谱条件进样，等度洗脱，考察主成分与各杂质、各杂质之间的分离度。结果显示，在该色谱条件下，依达拉奉及其后出峰的杂质均有较大推迟，杂质5于60min内未出峰，且杂质2和杂质3保留时间较为接近，分离不符合要求。
表6对照例依达拉奉中各杂质峰归属及分离情况
Figure BDA0001166459720000082
Figure BDA0001166459720000091

Claims (3)

1.一种依达拉奉及其氯化钠注射液中遗传毒性杂质检测方法，其特征在于取依达拉奉适量，加甲醇适量使溶解，再用稀释剂稀释成供试品；或者依达拉奉氯化钠注射液直接作为供试品，所述稀释剂为初始流动相，采用高效液相色谱法，色谱条件为：
检测器：紫外检测器，检测波长为226nm或224nm；
色谱柱：4.6×250mm、粒径5μm十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱；
柱温：20-40℃；
流动相流速：0.5-1.5ml/min；
进样量：10-100μl；
流动相：有机相与水相的混合溶剂作为流动相，梯度洗脱，所述有机相为甲醇或乙腈，所述水相为pH为3.0～5.0的0.05mol/L的磷酸二氢铵缓冲液，洗脱条件为表1～表4任一：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
所述遗传毒性杂质为：
杂质1：苯肼；
杂质2：苯胺；
杂质3：联苯胺。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述水相为pH为4.0的磷酸二氢铵溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述检测波长为226nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min，进样量为50μl。
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