CN101821262A - 藤黄胺,一种具有神经保护活性的选择性TrkA激动剂 - Google Patents
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Abstract
本文描述了TrkA受体的小分子激动剂、部分激动剂和拮抗剂。这些化合物属于藤黄胺类,其中藤黄酸的羧酸基(CO2H)被胺基(CH2NR1R2)取代。在一些实施方式中,该化合物选择性地结合于TrkA而不是TrkB或TrkC,强力地诱导其酪氨酸磷酸化作用和下游包括Akt和MAP激酶的信号传导激活。而且,它们能够强烈地阻止谷氨酸诱导的神经元细胞死亡并引起PC12细胞中的突出神经突的长出。藤黄胺特异性地与TrkA受体的细胞质近膜结构域发生相互作用并引起其发生二聚。给予这些化合物可实质上减少红藻氨酸触发的神经元细胞死亡,并减小中风的短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)模型中的梗死体积。因此,这些化合物能够提供对衰弱的神经变性疾病的有效治疗,并为患者提供神经保护以免于发生中风或其他局部缺血性事件。
Description
相关申请的引用
本申请根据35 USC 119要求享有2007年9月14日提交的美国临时专利申请第60/993,763号的优先权。所述美国临时专利申请第60/993,763号公开的内容出于各种目的,以其全部内容结合于本文中作为参考。
技术领域
本发明总体上涉及选择性TrkA激动剂领域,尤其是藤黄胺(gambogic amine),以及利用该化合物提供神经保护和/或治疗或预防神经变性疾病的方法。
背景技术
神经营养因子在外周和中枢神经系统的发育和维持中起到关键的作用。神经营养因子的受体是一组高度类似的跨膜酪氨酸激酶(TrkA、TrkB和TrkC)的家族成员。每一种神经营养因子都结合至该家族中的一种优选受体:神经生长因子(NGF)主要结合TrkA,脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-4(NT-4)结合TrkB且神经营养因子-3结合TrkC,而p75NTR受体非选择性地与具有类似亲合性的神经营养因子的所有成员发生相互作用。通过NGF使TrkA发生对接(docking)以引起受体二聚体形成,受体上细胞质酪氨酸残基的催化磷酸化作用,以及包括PI 3-激酶/Akt、Ras/Raf/MAP激酶和PLC-γ1信号传导通路激活的细胞信号传导事件的级联(Kaplan and Stephens,1994)。这些信号导致阻止凋亡细胞的死亡、促进细胞分化和轴突延伸、以及胆碱乙酰转移酶(ChAT)的上调。几种神经元细胞类型包括涉及各种疾病的感官的、交感的和胆碱能的神经元表达TrkA并因此响应于NGF(Mufson et al.,1997)。在正常成年人中枢神经系统(CNS)中,包含胆碱能系统的皮质和基底核神经元在学习和记忆中起到关键作用。
在神经变性过程中,例如轻度认知受损(MCI),TrkA密度的损失与神经元萎缩症有关,并在阿尔茨海默氏症(AD)中的神经元死亡和严重认知损伤之前出现(Counts et al.,2004)。在MCI-AD发展中,TrkA损失与认知下降有关。在老年大鼠的基底前脑神经元中,NGF受体的表达降低,但是能够通过给予NGF而得到逆转(Backman et al.,1997)。据建议,NGF疗法可以延迟阿尔茨海默氏症的发作(Barinaga,1994;Lindsay,1996),并缓解周围糖尿病神经病变(Ebadi et al.,1997)。所提出的NGF的其他应用包括治疗神经元损伤(Hughes et al.,1997)和源自神经外胚层的肿瘤的靶向(Cortazzo et al.,1996;LeSauteur et al.,1995)。在体外和动物模型中的研究表明,NGF或许在临床上适用于治疗CNS疾病(Connorand Dragunow,1998)。作为预期,临床前和临床发现也建议,皮下或静脉注射神经营养因子可以是一种对于外周神经变性疾病的有效治疗(McArthur et al.,2000;McMahon and Priestley,1995)。
尽管NGF具有治疗潜力,但以这种蛋白为特征的临床试验却令人失望(Verrall,1994)。这有若干个原因,包括与利用多肽作为药物有关的固有缺陷(Saragovi et al.,1992)、体内不稳定性(Barinaga,1994)、以及由于并不是有意靶向的信号激活的多效性效应(例如,经由低亲合性NGF受体p75介导的)(Carter和Lewin,1997)。而且,生产NGF蛋白应以用于医疗应用是相对昂贵的。为了规避上述限制,人们已经做出实质上的努力来设计小的、且蛋白水解稳定,同时又具有神经营养活性且对细胞表达TrkA具有选择性的分子(Lee和Chao,2001;Saragovi et al.,1991;Saragovi et al.,1992)。它们在不存在NGF的情况下通过激活TrkA而表现出部分激动活性(或促效活性,agonistic activity)。尽管它们并不直接使受体形成二聚物,但是这些化合物引起了在使其二聚作用稳定化的TrkA上的构象改变。因此,它们更像是作为NGF作用的增强剂,而不是作为强有力的TrkA激动剂。
提供选择性TrkA激动剂和使用这些化合物的方法是有利的。本发明提供了这样的化合物和方法。
发明内容
本发明公开了一种藤黄胺(gambogic amine)。根据在胺基上的侧链,该化合物可以是TrkA激动剂、部分激动剂或拮抗剂。这些化合物以相对较高的亲合性而结合至TrkA。这些导致细胞凋亡的化合物能够用作抗癌剂,而那些抑制细胞凋亡的化合物(在那种情况下它们可以是选择性的TrkA激动剂)能够用作神经保护性化合物。本文中描述了确定这些化合物活性的分析。
某些藤黄胺选择性地结合至TrkA,触发其酪氨酸磷酸化作用,引起PI 3-激酶/Akt和MAP激酶激活,引起PC12细胞中的神经突长出(或生长),和/或防止神经元细胞死亡。而且,它们能够实质上降低MCAO之后的梗死体积。因此,这些藤黄胺能够模拟NGF并具有有效的神经营养活性。
选择性TrkA激动剂能够用于在神经受损如中风或其他局部缺血性事件之前、之中或之后提供神经保护作用。这些化合物也能够用于治疗脱髓鞘性病如多发性硬化症(MS)、增强神经再生、和/或治疗或预防神经变性疾病。这种神经变性疾病包括但不限于,癫痫、头部和脊髓损伤、帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏症、或肌萎缩侧索硬化症或神经障碍。
参照以下的详细描述将会更好地理解选择性TrkA激动剂、或部分激动剂,以及提供神经保护、或治疗和/或预防神经变性疾病或脱髓鞘性病的方法。
具体实施方式
本发明公开了藤黄胺类、包括这种藤黄胺类的药物组合物、制备这种藤黄胺类的方法、以及利用这种藤黄胺类进行治疗和预防的方法。本发明源自这一发现,即藤黄胺类是选择性的TrkA调节剂(即,激动剂、部分激动剂、或拮抗剂)。因此,这些化合物可能适用于提供神经保护作用、治疗脱髓鞘性病、和治疗和/或预防神经变性疾病。
I.藤黄胺类
藤黄胺类自身一般具有以下结构式。
例如,藤黄胺类能够采用如下所示的图解1进行制备。在藤黄酸用作前体的情况下,能够通过1)制备藤黄粗提取物(来自藤黄科植物藤黄(Garcinia hanburyi Hook)的树脂)的吡啶盐,接着在乙醇中对该盐进行反复重结晶,或2)将该盐转化成游离酸来进行纯化。采用这种工艺步骤,能够从粗提取物获得约10wt%的纯度>99%(HPLC)的藤黄酸。在藤黄酰胺用作前体(酰胺被还原为胺)的情况下,能够采用例如已知的酰胺化化学方法通过将藤黄酸转化成酰胺而获得。
藤黄胺的合成在以下反应图解,图解1中概述。
如图解1中所示,藤黄胺衍生物至少能够利用两种路径中的任一种生成:1)三步实验方案,涉及藤黄酸与各种伯胺和仲胺发生二酰亚胺偶联以形成藤黄酰胺衍生物,接着生成硫代酰胺,最后在N2气氛下通过镍发生硫代羰基还原;或2)直接由藤黄酰胺形成硫代酰胺,接着在氮气氛下发生硫代羰基还原以得到游离的伯胺。R1和R2基团可以是任何大小的烷基或羰基。各种藤黄胺衍生物可以利用不同的R1和R2基团来制备。可替代地,以未取代的化合物(R1和R2都是H)开始,能够采用烷基卤、烷芳基卤(如苄基卤),或利用其他这样的烷基化剂在氮上放置合适的取代基(包括具有以下描述的取代基的那些)。这样的反应对于本领域技术人员而言是公知的。
藤黄酰胺在保护海马神经元免于体外OGD(缺氧缺糖)或谷氨酸触发的神经元细胞死亡方面显示出强有力的神经营养效应。另外,藤黄酰胺能够强烈地阻断小鼠大脑中的红藻氨酸-诱发的神经元细胞死亡。而且,藤黄酰胺也能够有效地降低中风诱导的梗死体积。实施结构活性分析表明,在藤黄酸(和由此获得的藤黄酰胺)中的羧基对于藤黄酸家族成员的神经营养效应并不是关键的。因此,开发了本文中所述的藤黄胺化合物,以维持藤黄酰胺的活性,同时改善该化合物的水溶性。
藤黄胺衍生物能够进一步改善藤黄酰胺的生物效应。藤黄胺衍生物比藤黄酰胺具有更好的水溶性,并且在一些实施方式中,藤黄胺衍生物在抑制神经元细胞死亡方面表现出更强的神经营养活性,在治疗神经变性疾病如阿尔茨海默氏症方面产生更好的治疗效能。
这些化合物对于癌细胞中的细胞凋亡具有某些效应,并被认为是根据特定的化合物结构来调节(即,激动(agonize)、部分激动或拮抗)TrkA受体。本文中所述的分析能够以高通量(high-throughout)方式使用来识别该化合物家族中的哪些化合物具有所需的活性。实际上,具有显著细胞凋亡活性的化合物可以作为抗癌药而具有相当明显的疗效,而具有增强保护活性的化合物对于提供神经保护作用,治疗神经变性疾病等可以具有相当明显的疗效。
在能够被改性的藤黄胺的结构中具有许多官能团。这些官能团包括但不限于羟基,其能够转化成醚、酯或其他官能团;C-9和C-10之间的碳碳双键是α,β-不饱和酮的部分,其能够与亲核剂反应,而被还原成碳碳单键,或可以转化成环氧化物,其又可以进行进一步反应;C-27和C-28之间的碳碳双键是α,β-不饱和羧基的部分,其也能够与亲核剂反应,而被还原成碳碳单键,或可以转化成环丙烷环,其又可以进行进一步地反应;C-37/C-38和C-32/C-33处的两个异戊二烯碳碳双键,也可以被还原成碳碳单键,断裂形成醛基或羧基,二者都可以被改性成其他官能团,或转化成环氧化物,其又可以进行进一步地反应;C-3和C-4之间的碳碳双键也可以被还原成碳碳单键,或转化成可以进一步发生反应的环氧化物;C-12处的酮基可以被还原成醇,或可以转化成肟、半卡巴腙、或氨基;其他酮基也可以被还原,或可以转化成其他官能团。简而言之,以上所示的藤黄胺许多衍生物都能够制备,且这样的衍生物都被认为是属于本发明的范围。
烷基、芳基和芳烷基R1和R2上的可选取代基包括卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、氨基、硝基、氰基、C1-C6酰基氨基、C1-C6氨基酰基、C1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、芳氧基、烷硫基(alkylthio)、C6-C10芳基、Cd-C7环烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C10芳基(C2-C6)烯基、C6-C10芳基(C2-C6)炔基、饱和或部分饱和的5-7元杂环基、或杂芳基中的一种或多种。
有用的烷基包括直链和支链的C1-10烷基,更优选C1-6烷基。典型的C1-10烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、3-戊基、己基和辛基,其可以是可选取代的。
有用的烷氧基包括以上提及的C1-10烷基之一取代的氧,其可以是可选取代的。
有用的烷硫基包括以上提及的C1-10烷基之一取代的硫,其可以是可选取代的。也包括这种烷硫基的亚砜和砜。
有用的氨基包括-NH2、-NHR1、和-NR1R2,其中R1和R2是C1-10烷基或环烷基,或R1和R2与N组合而形成环结构,如哌啶,或R1和R2与N和另一杂原子组合而形成可选取代的、饱和或部分饱和的5-7元杂环基,如哌嗪。烷基可以是可选取代的。
有用的杂原子包括N、O或S。
芳基、芳烷基和杂芳基上的可选取代基包括酰基、烷撑二氧基(-OCH2O-)、卤素、C1-C6卤代烷基、C6-C10芳基、C6-C7环烷基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C10芳基(C1-C6)烷基、C6-C10芳基(C2-C6)烯基、C6-C10芳基(C2-C6)炔基、C1-C6羟基烷基、硝基、氨基、脲基、氰基、C1-C6酰基氨基、羟基、巯基、C1-C6酰氧基、叠氮基、C1-C6烷氧基或羧基中的一个或多个。
有用的杂烷基含有1-10个碳原子和1、2或3个杂原子。杂烷基的实例包括-CH2CH2OCH2CH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH3、-CH2CH2NHCH3、-CH2CH2N(CH2CH3)2、-CH2CH2OCH2CH2NHCH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NHCH3、-CH2CH2NHCH2CH3、-CH2C(CH3)2CH2N(CH3)2或-CH2(N-乙基吡咯烷),其可以是可选取代的。
杂烷基上的可选取代基包括卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、烷基、C1-C6酰基氨基、C1-C6氨基酰基、C1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、芳氧基、烷硫基、C6-C10芳基、Cd-C7环烷基、C2-C6烯基、链烯氧基、C2-C6炔基、C6-C10芳基(C2-C6)烯基、C6-C10芳基(C2-C6)炔基、饱和及不饱和的杂环或杂芳基中的一个或多个。
有用的芳基为C6-14芳基,尤其是C6-10芳基。典型的C6-14芳基包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯基、亚联苯基(biphenylenyl)和芴基。
有用的环烷基为C3-8环烷基。典型的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
有用的饱和或部分饱和的碳环基团为如上定义的环烷基,以及环烯基,如环戊烯基、环庚烯基和环辛烯基。
有用的卤素或卤代基包括氟、氯、溴和碘。
有用的芳烷基包括用以上提及的任何C6-14芳基取代的以上提及任何C1-10烷基。该有用的芳烷基包括苄基、苯乙基和萘甲基。
有用的卤代烷基包括用一个或多个氟、氯、溴或碘原子取代的C1-10烷基,例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1,1-二氟乙基、氯甲基、氯氟甲基和三氯甲基。
有用的酰基氨基是连接至氨基氮的任何C1-6酰基(烷酰基),例如,乙酰胺基、丙酰胺基、丁酰胺基、戊酰胺基、己酰胺基、以及芳基-取代的C2-6取代的酰基。
有用的酰氧基是连接至氧基(-O-)的任何C1-6酰基(烷酰基),例如,甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基等。
有用的饱和或部分饱和的5-7元杂环基包括四氢呋喃基、吡喃基、哌啶基、吡嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、异色满基(isochromanyl)、色满基(chromanyl)、吡唑烷基、吡唑啉基、tetronoyl和tetramoyl。
5-7元杂环基上的可选取代基包括杂芳基、杂环、烷基、芳烷基、环烷基、烷氧基羰基、氨甲酰基、芳基或C1-C6氨基酰基中的一个或多个。
有用的杂芳基包括以下的任一种:噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、吩噻噁基(phenoxanthiinyl)、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基(quinozalinyl)、噌嗪基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮苯基、菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异噁唑基、呋咱基(furazanyl)、吩噁嗪基、1,4-二氢喹噁啉基-2,3-二酮、7-氨基异香豆素、吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮、1,2-苯并异噁唑-3-基、苯并咪唑基、2-羟基吲哚基(2-oxindolyl)和2-氧代苯并咪唑基。其中杂芳基在环上含有一个氮原子,这样的氮原子可以是以N-氧化物的形式,例如,吡啶N-氧化物、吡嗪N-氧化物、嘧啶N-氧化物等。
杂芳基上的可选取代基包括一个或多个杂芳基、杂环、烷基、芳烷基、环烷基、烷氧基羰基、氨甲酰基、芳基和C1-C6氨基酰基。
某些化合物可以存在立体异构体,包括光学异构体。本发明包括所有的立体异构体和这样的立体异构体的外消旋混合物以及可以根据本领域普通技术人员公知的方法进行分离的单个对映体。
药用加成盐的实例包括无机和有机酸加成盐,如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐;以及与碱如氢氧化钠、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS,三羟甲基氨基甲烷)和N-甲基-葡糖胺的无机和有机碱加成盐。
前药的实例包括藤黄胺与各种含羧酸化合物的简单酰胺;氨基的亚胺(例如,根据本领域已知的方法与C1-4醛或酮缩合而获得的);和胺基的氨基甲酸酯(或盐)。
II.高通量的筛选方法
开发了以下高通量的筛选分析法以用于理想地以选择性方式识别模拟NGF并激活TrkA的小分子。也就是说,该分析法能够识别出属于TrkA的激动剂或部分激动剂的化合物,且理想地是对TrkA比TrkB和TrkC更具选择性的化合物。能够采用这种方法评价本文中描述的藤黄胺起到TrkA受体的激动剂、部分激动剂或拮抗剂的作用的能力,以及其对这种受体的选择性超过TrkB和TrkC。
基于细胞的细胞凋亡分析采用半胱天冬(蛋白)酶分析系统,其包括荧光法、比色法、细胞增殖法和细胞成活力分析系统,包括凋亡细胞的荧光法或比色法标记。在一个实施方式中,基于细胞的细胞凋亡分析采用细胞可渗透的荧光染料(如MR(DERD)2),其在凋亡细胞中一旦半胱天冬酶-3分解后会变红。分析中所使用的细胞能够来自任何不表达TrkA的细胞系。在一个实施方式中,细胞是来自鼠细胞系T17,其来自于基底前脑SN56细胞。T17细胞是TrkA稳定转染的SN56细胞。
这些选择性保护T17细胞,而不是选择性保护SN56细胞的候选化合物是TrkA激动剂,或通过激活下游通路而起作用。即使它们是TrkA激动剂,也还不清楚是否仅由抗细胞凋亡活性就能认为它们是选择性TrkA激动剂。因此,可以实施额外的筛选步骤来确定该化合物是否TrkA激动剂,而且如果确实如此的话,就确定它们是否是选择性TrkA激动剂。
为了辅助确证化合物是否对TrkA起作用,或在下游步骤上起作用,能够观察该化合物是否会导致TrkA发生二聚作用。即,促使TrkA发生二聚的化合物对TrkA产生作用,而不是对下游步骤产生作用。确定测试化合物是否能够触发TrkA二聚作用的一种方式是将GFP-TrkA和HA-TrkA共转染到HEK293细胞中,并使该共转染细胞暴露于该化合物。
正如本文中所用的,TrkA激动剂是一种在选择性保护T17细胞而不是SN56细胞方面具有至少90%的NGF活性,并且导致TrkA发生二聚的化合物,而部分激动剂是在选择性保护这些细胞方面具有至少90%的NGF活性,并且导致TrkA发生二聚的化合物。选择性TrkA激动剂(或部分激动剂)是对TrkA比TrkB和/或TrkC表现出显著结合亲合性,例如对TrkA比TrkB和/或TrkC表现出至少4∶1的结合亲合性的化合物。
抑制细胞凋亡并导致TrkA发生二聚的那些化合物是TrkA激动剂(或部分激动剂)。为了确定化合物是否是选择性TrkA激动剂(即,选择性优先于TrkB或TrkC而结合至TrkA),可以使用TrkB和TrkA受体或TrkC和TrkA受体共转染的细胞。如果化合物对TrkA具有选择性,则受体将不能发生二聚。选择性TrkA激动剂也会引起TrkA中的酪氨酸磷酸化作用,而不是在TrkB或TrkC受体中(或在细胞共转染以表达两个或多个这些受体,即,TrkA与TrkB和/或TrkC组合)。因此,人们能够可替代地,或同时寻找酪氨酸磷酸化作用以确定化合物是否是选择性TrkA激动剂(或部分激动剂)。可以进行剂量研究来确定该化合物是激动剂还是部分激动剂。
一旦确定了具有所需性质的化合物,则例如通过确定该化合物是否能引起PC12细胞中的神经突生长(长出),和/或阻止神经元细胞死亡来评价其实际活性。具有这些活性中的一种或两种的化合物可以是可用于治疗神经变性疾病和/或提供神经保护作用的化合物。
理想地,可以分析在这两种筛选中测试阳性的化合物的TrkA酪氨酸磷酸化作用,和/或Akt和MAP激酶信号级联激活作用。下文中将更详细地描述每一分析步骤。
T17细胞能够在多孔板(如96-孔板)中进行培养,并用约10μM的假定TrkA激动剂预培养一段时间,例如30分钟,接着用1μM星形孢菌素(STS)处理一段时间,例如9小时。当染料是MR(DEVD)2,并且这种染料被引入到细胞中时(例如,在荧光显微镜下检测前1小时),凋亡细胞将会出现红色,而活细胞则无信号。NGF能够用作阳性对照。与对照(如DMSO对照)相比,NGF将实质上降低红色细胞的数目。
在如以下实施例部分中所讨论的,采用使用半胱氨天冬酶-3活化的荧光染料的分析法,能够筛选来自Spectrum Collection Library的生物活性化合物。当筛选是针对各种藤黄酸衍生物进行时(数据未示出),由STS-引发的细胞凋亡识别的化合物选择性保护T17细胞,而不是SN56细胞。这表明该化合物直接通过TrkA受体起作用,或通过其下游信号传导效应器起作用。类似的筛选分析能够用于评价本文中所描述的藤黄胺。
即使是在缺乏NGF时,T17也比其亲本SN56细胞表现出更强烈的抗细胞凋亡效应,表明TrkA的过表达抑制半胱天冬酶-3激活。NGF处理进一步增强了这种效应。
作为存活增强剂的化合物的识别
为了比较化合物的细胞凋亡抑制剂活性,能够将其与T17和SN56细胞一起预培养(0.5μM),接着用1μM STS培养9h。细胞凋亡抑制活性的定量分析将表明哪些化合物几乎没有或没有能力保护SN56细胞免于凋亡,而哪些化合物能够强有力地抑制T17细胞的凋亡,理想地甚至具有比NGF更强的保护活性。这样的化合物可以显示出在神经保护方面的用途。
在筛选中识别出的增加T17细胞中细胞凋亡的化合物能够触发渐进式的(programmed)细胞死亡,并可以用作抗癌药物。
TrkA在海马神经元中是高度表达的(Culmsee et al.,2002;Kume et al.,2000;Zhang et al.,1993)。在病理生理条件下,TrkA和p75NTR在海马和皮层神经元中是上调的(Kokaia et al.,1998;Leeet al.,1998)。而且,在海马和皮层神经元中的NGF神经保护效应已经在体外和体内得以证明(Culmsee et al.,1999;Zhang et al.,1993)。
为了检测试验化合物是否能够促进神经元存活,需要能够制备海马神经元,并用各种试验化合物预处理初级神经元一段时间,例如30min,接着用50μM的谷氨酸盐(或酯)处理一段时间,例如16小时。MR(DEVD)2的定量细胞凋亡分析能够用于确定这些化合物是否表现出与阳性对照NGF相当的保护效应(即,细胞凋亡抑制活性)。
NGF过表达降低了转基因小鼠或心室内注射小鼠的梗死体积和神经元细胞凋亡(Guegan et al.,1998;Luk et al.,2004)。NGF也有力地保护PC12细胞在OGD(缺氧缺糖)模型中免于凋亡(Tabakman et al.,2005)。为了探索试验化合物是否会对OGD中的海马神经元发挥任何保护效应,可以在OGD刺激之前用NGF或试验化合物预处理初级制剂30min。在3小时内,细胞凋亡分析能够用于证明化合物是否表现出强有力的保护效应。滴定分析能够证明化合物是否以剂量依赖的方式保护神经元。因此,该分析能够识别出选择性保护TrkA表达细胞和初级神经元免于发生凋亡的化合物。
PC12细胞中神经突生长的测定
NGF的最显著的神经营养效应之一是触发神经元细胞中的神经突生长并引起分化。为了探索试验化合物是否具有这一活性,可以用一定浓度的试验化合物(例如,0.5M的化合物)培养PC12细胞一段时间,例如5天。可以周期性地,例如每隔一天补充含有这些化合物的细胞培养基。
在这种类型的分析中,NGF会在处理5天之后引起PC12细胞中的显著神经突萌发。在上述一个或多个分析中具有活性,并且也在PC12细胞中引起神经突生长的那些试验化合物,就能够认为是神经营养/神经保护性的。
通过试验化合物产生的神突网络能够用作这些化合物具有强神经营养活性的证据。剂量依赖性分析能够用于揭示引起PC12细胞中显著神经突萌发的理想浓度,并由此识别在某浓度下具有与NGF相当的有力的神经营养活性并强力引起神经突生长的化合物。
触发海马神经元中TrkA酪氨酸磷酸化作用的化合物的鉴别
NGF结合至受体TrkA并引发其发生二聚作用和在酪氨酸残基上的自身磷酸化作用。TrkA上的许多酪氨酸残基在受到NGF刺激后发生磷酸化作用。例如,Y490磷酸化作用就是Shc关联和MAP激酶信号传导级联的活化所需的。Y751磷酸化作用对于PI 3-激酶对接和活化是关键的。
为了评价试验化合物是否也能够触发TrkA酪氨酸磷酸化作用,可以用以某一浓度的假定化合物(例如,0.5μM)处理初级海马神经元一段特定时间(例如,30min)。细胞溶解产物能够例如通过采用抗-磷-TrkA Y490抗体的免疫印迹进行分析。
NGF处理将会显示出引起强烈的TrkA磷酸化作用,并且该分析能够识别出像NGF一样的类似地引起TrkA磷酸化作用的化合物。海马神经元中的TrkA酪氨酸磷酸化作用也能够通过采用抗-TrkA Y490特异抗体的免疫荧光染色而证实。
为了确定试验化合物是否能够触发TrkA二聚作用,可将GFP-TrkA和HA-TrkA共转染到HEK293细胞中,并用0.5μM藤黄酰胺处理该细胞30min。共免疫沉淀分析可用于确定任何试验化合物是否引起TrkA二聚作用,理想地甚至比NGF更强,更理想地采用阴性对照(如DMSO)产生基线。
共转染TrkA和TrkB或TrkC受体将不会发生二聚作用,无论用NGF还是用也选择性触发TrkA受体二聚作用的化合物预处理都是如此。选择性TrkA激动剂将引起TrkA中而不是TrkB或C受体中的酪氨酸磷酸化作用(或在细胞中共转染以表达两个或多个这些受体,即,TrkA与TrkB和/或TrkC组合)。
一些化合物可以按照这种方式起效以至于与野生型TrkA相比,TrkA-KD将显示出酪氨酸磷酸化作用降低,这将会表明,不仅TrkA发生自身磷酸化作用,而且其他酪氨酸激酶也被激活,并有助于Y490磷酸化作用。由此,这些分析能够识别模拟NGF和选择性引起TrkA二聚作用和酪氨酸磷酸化作用的化合物。
引起Akt和MAP激酶激活的化合物的识别
NGF通过TrkA受体触发PI 3-激酶/Akt和Ras/MAP激酶信号传导级联激活。为了探究试验化合物是否具有类似的促有丝分裂作用,可以用各种试验化合物处理T17细胞30min。分别采用抗-磷-Erk1/2和磷-Akt-473抗体的免疫印迹法来分析细胞溶解产物。
NGF处理刺激可论证的Erk1/2和Akt磷酸化作用。类似地引起Erk1/2和Akt强烈磷酸化作用的那些化合物将会表现出是有效的TrkA激动剂(或部分激动剂)。
不能激活MAP激酶但是能强烈引起Akt激活的化合物可以有差别地通过TrkA受体或其下游细胞靶来调节PI 3-激酶/Akt和Ras/MAP激酶通路。
该分析能够拓展到初级海马神经元。NGF和某些试验化合物可以激活Akt,而其他化合物可以稍微上调Akt磷酸化作用。利用海马神经元进行的时程分析(Time course assay)能够用于证实某些化合物是否在5min处理之后就引起Akt磷酸化作用,以及Akt激活是否随时间增加,其是否能够维持,及其是否以剂量依赖的方式引起Akt激活。将这些信息结合在一起,就能识别在神经元中模拟NGF和强力激活Akt和MAP激酶激活作用的化合物。
结合TrkA受体的细胞质近膜结构域的化合物的识别
邻近膜的TrkA胞外区域中的免疫球蛋白(Ig)样结构域(TrkA-d5结构域)是特异性结合NGF所需的(Urfer et al.,1995)。为了研究TrkA受体的哪部分结合至试验化合物,并且该化合物基于以上所述的分析看起来也就是TrkA激动剂,可以采用通过共价连接这些化合物至固体底物如亲合胶102(affi-gel 102)的固定化的化合物来实施体外结合分析。
可以制备GFP-标记的TrkA截形物(truncate),并将其转染至HEK293细胞中。结合分析能够用于证明胞外域是否是关联所必需的。细胞质近膜结构域对于配体结合是关键的。尽管Trk家族成员的胞内域(ICD)共有较大的同源性,但在近膜区域是不同的。体外结合分析能够用于证明试验化合物是否选择性结合至野生型和/或激酶-失效的TrkA,而不是TrkB或TrkC。因此,选择性TrkA激动剂(或部分激动剂)能够被识别。
如果试验化合物对Trk-KD的亲合性比野生型TrkA要弱,和/或不能结合至p75NTR、ErbB3或EGF受体,这能够证明试验化合物特异性关联TrkA而不是其他的神经营养因子受体或跨膜酪氨酸激酶受体。
为了确定试验化合物和TrkA之间的结合常数,可以采用共价连接至试验化合物的GFP-TrkA-结合珠来实施竞争分析。如果与珠粒关联的TrkA的浓度随着试验化合物游离浓度升高而降低,则竞争数据的定量分析将显示试验化合物的Kd。结合FITC的试验化合物与PC12细胞一起培养10min,能够引起它们与TrkA受体的关联,而仅有FITC不能渗透到细胞中。利用这些信息,就能确定试验化合物是否渗透细胞膜并通过相同或不同于NGF的区域紧密结合于TrkA受体。
确定试验化合物是否能够防止红藻氨酸触发的神经元细胞凋亡并降低中风大鼠脑中的梗死体积
红藻氨酸(KA)是一种AMPA受体的强力激动剂。KA的外周注射导致海马中神经元选择群落反复发作和随后的退化(Nadleret al.,1980;Schauwecker和Steward,1997;Sperk et al.,1983)。已经证实,半胱天冬酶-3的激活是KA-引起细胞死亡的必要组成(Faherty et al.,1999)。为了探究试验化合物是否能够阻断KA引发的神经毒性,随后可以将这些化合物(例如,浓度为2mg/kg)皮下注射至C57BL/6小鼠体内,接着注射25mg/kg KA。在5天内,对小鼠进行灌注,并将脑切成厚度为5μm的切片并安装在载玻片上。在不存在神经保护化合物的情况下,TUNEL染色显示KA导致海马中大量细胞凋亡。如果这种细胞凋亡通过试验化合物显著降低,则该分析能够证实试验化合物是神经保护性的。
为了进一步确定体内神经保护潜能,可以在成年雄性大鼠的短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)中风模型中测试试验化合物。在2hMCAO后进行再灌注之后,在再灌注开始前5min,使这些动物接受载体或试验化合物(2mg/kg)。如果所有或绝大多数试验动物在局部缺血性损伤和用试验化合物处理后存活,则证明该化合物是神经保护性的。
在载体处理的和化合物处理的大鼠中发生MCAO后,用TTC将代表性的大脑切片染色24h,能够经受TTC切片的面积和体积测量表明用化合物处理是否显著减小了这种暂时缺血性中风模型中的梗死体积。可将阳性结果与NGF的结果进行比较,因为已知NGF能够减小局灶性局部缺血中的梗死体积和细胞凋亡(Guegan et al.,1998)。
LDF(激光多普勒血流仪,laser-Doppler flowmetry)能够对同侧顶叶皮质进行测定。在随后接受试验或载体处理的大鼠中5minMCAO内能够测量相对CBF(脑血流量)的降低。
将上述分析结合到一起,就能够识别强力TrkA激动剂(或部分激动剂),其能够防止神经元细胞死亡并保护由兴奋性神经毒性和中风诱发的神经变性。
II.采用TrkA激动剂提供神经保护的方法
选择性TrkA激动剂能够用于治疗或预防神经变性疾病。该方法涉及向动物给予有效量的选择性TrkA激动剂或选择性TrkA激动剂的药用盐或前药,从而提供神经保护作用,并治疗或预防神经变性疾病。
选择性TrkA激动剂和部分激动剂,如利用以上描述的筛选方法识别的那化合物,能够在神经损伤如中风或其他局部缺血性事件之前、之中或之后用于提供神经保护作用。该化合物的神经保护作用能够预防在这些涉及记忆编码和表现出阿尔茨海默氏症和局部缺血的早期退化的区域内由兴奋毒性剂(或外毒素剂,exitotoxicagent)诱导的神经元细胞生存力丧失。
选择性TrkA激动剂和部分激动剂也能够用于治疗脱髓鞘病,例如MS。尽管并不期望受束缚于具体理论,但是可以认为选择性TrkA激动剂通过诱导髓鞘蛋白基因来治疗或预防例如在多发性硬化症(MS)中观察到的自身免疫脱髓鞘。
选择性TrkA激动剂和部分激动剂能够进一步用于治疗或预防神经变性病,例如癫痫、头部和脊髓损伤、帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏症、或肌萎缩侧索硬化症或神经障碍。能够利用选择性TrkA激动剂来治疗的其他神经疾病有运动障碍、疼痛等。
选择性TrkA激动剂或部分激动剂能够进一步用于促进神经细胞存活,并能够保护神经细胞免于细胞死亡,例如,由于神经毒性剂作用造成的细胞死亡。
在这些方法的每一种中,TrkA激动剂或部分激动剂,或其药用盐或前药,以有效量向动物给药,可选地以药物组合物的方式给药,从而提供神经保护作用、治疗脱髓鞘性病、增强神经再生、和/或治疗或预防神经变性疾病。
这些化合物提供了优于NGF的优点,即,相对于NGF而言,由于它们是小分子从而能够口服给药并且能够以相对低的廉造价和相对高的纯度来制备。而且,这些化合物通过选择性结合于TrkA,而不是非选择性地结合于TrkA、TrkB和TrkC,从而具有比NGF更高的选择性。
IV.药物组合物
可将本文中描述的化合物结合到药物组合物中并用于预防易感这种病症或疾病的受治疗者的病症或疾病,和/或治疗患有这种病症或疾病的受治疗者。本文中描述的药物组合物包括本文中所述的一种或多种和厚朴酚(honokiol)类似物,和/或其药用盐。可选地,活性化合物能够作为外消旋混合物、作为纯对映体、或作为不同对映体纯度的化合物来使用。
化合物的给药方式可以是不同的。该组合物优选口服给药(例如,以在溶剂中的液体形式给药,如含水或无水液体,或在固体载体中给药)。优选的口服给药组合物包括丸剂、片剂、胶囊剂、囊片剂(caplet)、糖浆剂、以及溶液,包括硬质凝胶胶囊和时间缓释胶囊。组合物可以配置成单位剂量形式,或多倍或亚单位剂量形式。优选的组合物是以液体或半固体形式。可以使用包括液体药物惰性载体如水或其他药物相容性液体或半固体的组合物。这样的液体和半固体的使用对于本领域技术人员而言是众所周知。
组合物也可以经由注射给药,即静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、动脉注射、胸内注射;和脑室内注射。静脉注射给药是优选的注射方法。用于注射的合适载体对于本领域技术人员而言是众所周知的,并且包括5%的葡萄糖溶液、盐水和磷酸盐缓冲的盐水。该化合物也能够作为输注液或注射液给药(例如,作为在药用液体或液体混合物中的混悬液或乳液)。
制剂也可以采用其他方式给药,例如,直肠给药。适用于直肠给药的制剂,如栓剂,是本领域技术人员公知的。该化合物也能够通过吸入给药(例如,以气雾剂的形式鼻吸或采用授予Brooks等的美国专利第4,922,901号所述的那些递送物类型,其公开内容以其全文结合于本文作为参考);局部给药(例如,以洗剂形式);或经皮肤给药(例如,采用来自Novartis and Alza Corporation的商用技术的皮肤贴剂)。尽管也可以以大量活性化学品的形式给药,但优选使每种化合物以有效药物组合物或制剂的形式存在并进行有效给药。
可将这些化合物结合于药物递送器件中,如纳米颗粒、微粒、微胶囊等。代表性的微粒/纳米颗粒包括那些用环糊精,如PEG化环糊精、包括小的单层泡囊的脂质体、以及经过尺寸设计而驻留在生长中的肿瘤周围的毛细管床的脂质体来制备的那些。合适的药物递送器件,描述于例如以下文献中:Heidel JD,et al.,Administrationin non-human primates of escalating intravenous doses of targetednanoparticles containing ribonucleotide reductase subunit M2 siRNA,Proc Natl Acad Sci USA.2007年4月3日;104(14):5715-21;Wongmekiat et al.,Preparation of drug nanoparticles by co-grindingwith cyclodextrin:formation mechanism and factors affectingnanoparticle formation,Chem Pharm Bull(东京).2007年3月;55(3):359-63;Bartlett和Davis,Physicochemical and biologicalcharacterization of targeted,nucleic acid-containing nanoparticles,Bioconjug Chem.2007年3-4月;18(2):456-68;Villalonga et al.,Amperometric biosensor for xanthine with supramoleculararchitecture,Chem Commun(Camb).2007年3月7日;(9):942-4;Defaye et al.,Pharmaceutical use of cyclodextrines:perspectives fordrug targeting and control of membrane interactions,Ann Pharm Fr.2007年1月;65(1):33-49;Wang et al.,Synthesis ofOligo(ethylenediamino)-beta-cyclodextrin Modified Gold Nanoparticleas a DNA Concehtrator;Mol Pharm.2007年3-4月;4(2):189-98;Xia etal.,Controlled synthesis of Y-junction polyaniline nanorods andnanotubes using in situ self-assembly of magnetic nanoparticles,JNanosci Nanotechnol.,2006年12月;6(12):3950-4;以及Nijhuis et al.,Room-temperature single-electron tunneling in dendrimer-stabilizedgold nanoparticles anchored at a molecular printboard,Small.2006年12月;2(12):1422-6。
用于给予这种化合物的示例性方法对于熟练的技术人员而言是显而易见的。这些制剂的有用性可以取决于所使用的特定组合物和接受治疗的特定受治疗者。这些制剂可以含有可以是油性的、水性的、乳化的或含适合于某种给药模式的溶剂的液体载体。
组合物能够间歇地或以逐渐的、连续的、恒定的或以受控速率向温血动物(例如,哺乳动物如小鼠、大鼠、猫,兔、狗、猪、奶牛或猴)给药,但有利的是向人类给药。另外,给予该药物制剂的天数和每天给予的次数可以是不同的。
优选地,给予该组合物以使得活性成分与癌细胞所在的区域发生相互作用。本文中所描述的化合物在治疗这些癌症时是非常有效的。
在某些情况下,本文中描述的化合物能够作为与其他预想预防或治疗具体癌症的化合物的药物组合物的部分一起使用,即组合疗法。除了有效量的本文中所述化合物之外,药物组合物也能够包含作为添加剂或佐剂的各种其他组分。
组合疗法
组合疗法可以按照以下几方面进行给药:(a)单一一种药物组合物,包含本文中所述的选择性TrkA激动剂或部分激动剂(例如,藤黄胺)、至少一种本文中所述的其他药剂、以及药用赋形剂、稀释剂、或载体;或(b)两种单独的药物组合物,包含(i)第一药物组合物,含包本文中所述的选择性TrkA激动剂或部分激动剂和药用赋形剂、稀释剂或载体,和(ii)第二组合物,包含至少一种本文中所述的其他药剂和药用赋形剂、稀释剂、或载体。药物组合物可以同时或按序和以任何次序进行给药。
当用于治疗脱髓鞘病如MS时,选择性TrkA激动剂或部分激动剂能够与已知用于治疗MS的其他化合物如干扰素和PEG化的干扰素(Pegasys)一起给药。
当用于提供神经保护时,选择性TrkA激动剂或部分激动剂能够与已知用于提供神经保护作用的其他化合物(如腺苷)一起给药(Dall’lgna et al.,“Neuroprotection by caffeine and adenosine A2A受体blockade of -amyloid neurotoxicity”British Journal ofPharmacology(2003)138,1207-1209)。
以下实施例是举例说明性的,而不是限制本发明的方法和组合物。在临床治疗中所遇到的各种条件和参数,以及对于本领域技术人员显而言易见的其他合适修改和变化,都属于本发明的精神和范围。
实施例1:藤黄酸
工艺步骤1:
步骤A
干藤黄粉(140g)在室温下用甲醇提取(3×600mL)1周,过滤后,减压下除去溶剂,得到黄色粉末状的粗提物(122g)。
步骤B.藤黄酸吡啶盐
将以上的粗提物(120g)溶解于吡啶(120mL)中,然后向搅拌的溶液中加入温水(30mL)。冷却至室温后,观察到一些沉淀。向混合物中加入己烷(120mL),过滤该混合物并用己烷冲洗固体,干燥。通过乙醇反复重结晶而纯化该盐,从而得到藤黄酸吡啶盐(75g);HPLC:99%。
步骤C.藤黄酸
将藤黄酸吡啶盐(0.4g)溶解于醚(25mL)中并与HCl水溶液(1N,25mL)振荡1h。随后用水(2×10mL)冲洗该醚溶液,干燥并蒸发而得到标题化合物(345mg);HPLC:99%。1H NMR(CDCl3):12.66(s,1H),7.43(d,J=6.9Hz,1H),6.48(d,J=10.2Hz,1H),5.97(t,J=75Hz,1H),5.26(d,J=9.9Hz,1H),4.91(m,2H),3.37(m,1H),3.24-2.98(m,2H),2.81(d,J=6.6Hz,1H),2.41(d,J=9Hz,1H),2.20(m,J1=8.4Hz,J2=51HZ,1H),1.88(m,1H),1.63(s,3H),1.60(s,3H),158(s,3H),153(s,3H),151(s,3H),1.43(s,3H),1.26(s,3H),118(s,3H).MS:627(M-H)。
工艺步骤2:
藤黄的粗提物(300mg)采用Combi Flash SG 100分离系统通过反复柱色谱(SiO2,己烷-EtOAc梯度)来纯化,得到18mg藤黄酸;HPLC:94%,MS.627(M-H)。
由此制备的藤黄酸能够用于,例如采用以上图解1中所示出的化学方法来制备藤黄胺。
实施例2:保护TrkA表达细胞免于细胞凋亡的基于细胞的筛选
为了识别模拟NGF和激活TrkA的小分子,我们开发了一种采用细胞渗透性荧光染料MR(DERD)2的基于细胞的细胞凋亡分析法,在凋亡的细胞中半胱天冬酶-3分解会使得该染料变红。我们利用衍生于基底前脑SN56细胞的鼠细胞系T17。T17细胞是TrkA稳定转染的SN56细胞。第一轮筛选选择性保护T17而不是SN56细胞的候选物,随后对其进行第二轮筛选的神经突生长分析。对于TrkA酪氨酸磷酸化作用、Akt和MAP激酶信号传导级联激活,可以分析阳性化合物。
T17细胞能够在96-孔板中培养并用10μM化合物预培养30分钟,接着用1μM星形孢菌素(STS)处理9h。在荧光显微镜下检查前1h将MR(DEVD)2引入细胞中。凋亡的细胞变红,而活细胞则没有信号。作为阳性对照,与DMSO对照相比,NGF显著降低了红色细胞数目。利用半胱天冬酶-3-激活的荧光染料作为可视分析,就能够筛选出藤黄胺化合物。
这些选择性地保护T17而不是SN56细胞免于STS-诱发的细胞凋亡的化合物可能是直接通过TrkA受体或其下游信号传导效应器发生作用。即使在没有NGF存在的情况下,T17也会表现出比其亲本SN56细胞更强的抗细胞凋亡效应,这表明TrkA过表达抑制了半胱天冬酶-3的激活。NGF处理进一步强化了这种效应。
藤黄胺作为存活增强剂的鉴定
为了比较各种化合物的细胞凋亡抑制活性,可将T17和SN56细胞与藤黄胺衍生物(0.5μM)一起预培养,接着用1μm STS处理9h。细胞凋亡抑制活性的定量分析能够确定化合物是否保护SN56细胞免于细胞凋亡。作为对照,藤黄酸、藤黄酰胺、藤黄酸二甲酯和二氢藤黄酸在T17细胞中强力抑制细胞凋亡,且保护活性甚至比NGF更强。这些发现结果间接表明,一些藤黄酸衍生物能够触发渐进性的细胞死亡,这与先前报道的它们具有抗癌活性(Kasibhatla et al.,2005)是一致的。
TrkA在海马神经元中是高度表达的(Culmsee et al.,2002;Kume et al.,2000;Zhang et al.,1993)。在病理生理条件下,TrkA和p75NTR在海马和皮层神经元中是上调的(Kokaia et al.,1998;Leeet al.,1998)。而且,在海马和皮层神经元中,NGF的神经保护效应已经在体外和体内得到了证明(Culmsee et al.,1999;Zhang et al.,1993)。为了检查这些化合物是否能够促进神经元存活,可以制备海马神经元,并用各种藤黄胺衍生物预处理初级神经元30min,接着用50μM的谷氨酸盐处理16h。MR(DEVD)2定量细胞凋亡分析能够用于证实藤黄胺是否表现出与阳性对照NGF相同的保护效应。
NGF过表达降低转基因小鼠或心室内注射小鼠中的梗死体积和神经元细胞凋亡(Guegan et al.,1998;Luk et al.,2004)。NGF也强力地保护PC12细胞在OGD(缺氧缺糖)模型中免于细胞凋亡(Tabakman et al.,2005)。为了探索藤黄胺是否对OGD中海马神经元发挥任何保护效应,可以在OGD刺激之前用NGF或各种化合物预处理初级制剂30min。在3h内,细胞凋亡分析能够用于证明藤黄胺是否表现出强有力的保护效应。滴定分析能够证明化合物是否以剂量依赖性的方式保护神经元。这些数据能够鉴别出选择性保护TrkA表达细胞和初级神经元免于细胞凋亡的那些藤黄胺。
PC12细胞中神经突生长的引发
NGF的最显著神经营养效应之一是触发神经元细胞中神经突生长并发生分化。为了探索藤黄胺化合物是否拥有这一活性,可以用0.5μM藤黄胺培养PC12细胞5天。含有这些化合物的细胞培养基能够每隔一天进行补充。在处理后5天,NGF引发PC12细胞中的显著神经突萌发。可以类似地评价藤黄胺的化合物能够诱使PC12细胞中显著的神经突生长。剂量依赖性分析能够揭示10~50nM的藤黄胺是否足以引起PC12细胞中显著的神经突萌发。因此,能够确定藤黄胺在一定浓度时是否具有相当于NGF的强力神经营养活性,以及有力地引起神经突生长。
海马神经元中TrkA酪氨酸磷酸化作用的触发
NGF结合至受体TrkA并引起其发生二聚作用和在酪氨酸残基上的自动磷酸化作用。TrkA上的许多酪氨酸残基在受到NGF刺激后发生磷酸化作用。例如,Y490磷酸化作用就是Shc关联和MAP激酶信号传导级联的活化所需的。Y751磷酸化作用对于PI 3-激酶对接和活化是关键的。为了评价藤黄胺化合物是否也能够触发TrkA酪氨酸磷酸化作用,可以用0.5μM的各种药剂处理初级海马神经元30min。细胞溶解产物能够通过采用抗-磷-TrkA Y490抗体的免疫印迹法进行分析。NGF处理引起强烈TrkA磷酸化作用,并且藤黄胺能够评价类地引起这种效应的能力。正如通过采用抗-TrkAY490特异抗体的免疫荧光染色所证实的,也能够确定藤黄胺是否在海马神经元中引发的显著TrkA酪氨酸磷酸化作用。为了确定藤黄胺是否能够触发TrkA二聚作用,可将GFP-TrkA和HA-TrkA共转染到HEK293细胞中,并用0.5μM藤黄胺处理该细胞30分钟。共免疫沉淀分析能够用于确定藤黄胺是否引起了甚至比NGF更强的TrkA二聚作用。也能够评价藤黄胺是否也引了TrkA受体中而不是TrkB或TrkC受体中的酪氨酸磷酸化作用。因此,能够确定藤黄胺是否模拟NGF并选择性引起TrkA二聚作用和酪氨酸磷酸化作用。
引起Akt和MAP激酶的激活
NGF通过TrkA受体触发PI 3-激酶/Akt和Ras/MAP激酶信号传导级联激活。为了探究藤黄胺是否拥有类似的促有丝分裂作用,可以用各种藤黄胺衍生物处理T17细胞30min。分别采用抗-磷-Erk1/2和磷-Akt-473抗体的免疫印迹法来分析细胞溶解产物。NGF处理刺激可论证的Erk1/2和Akt磷酸化作用,并且可以评价藤黄胺实施该行为的能力。也可以将分析拓展至初级海马神经元。NGF显著地激活Akt,并且可以评价藤黄胺激活Akt的能力。利用海马神经元的时程分析(Time course assay)能够证实藤黄胺(0.5μM)在5min处理之后是否引起Akt磷酸化作用,以及Akt激活是否在10min之后增加,并维持60min。也能够确定藤黄胺是否以剂量依赖性方式引起Akt激活。将这些观察结果结合到一起,就能证实藤黄胺在神经元中模拟NGF和强力活化Akt和MAP激酶活化作用。
结合TrkA受体细胞质近膜结构域
邻膜的TrkA胞外区域中的免疫球蛋白(Ig)样结构域(TrkA-d5结构域)是特异性结合NGF所需的(Urfer et al.,1995)。为了研究TrkA受体的哪部分结合至藤黄胺,可以利用通过共价连接至亲合胶102(affi-gel 102)的固定化的藤黄胺来实施体外结合分析。为了在该分析中使用,我们生成了许多GFP-标记TrkA截形物,并将其转染到HEK293细胞中。结合分析证明胞外域并不是关联所必需的。有意思的是,细胞质近膜结构域对于配体结合是关键的。尽管Trk家族成员的胞内域(ICD)共有较大的同源性,但在近膜区域是不同的。体外结合分析能够用于证明藤黄胺是否选择性结合至野生型和/或激酶-失效的TrkA,而不是TrkB或TrkC。如果Trk-KD表现出对藤黄胺比野生型TrkA具有更弱的亲合性,且这种胺不能结合于p75NTR、ErbB3或EGF受体,则这些信息将会强调藤黄胺特异性关联TrkA而不是其他神经营养素受体或跨膜酪氨酸激酶受体的发现。为了确定藤黄胺和与TrkA之间的结合常数,可以采用GFP-TrkA-结合的藤黄胺珠来实施竞争分析。竞争数据的定量分析能够用于揭示Kd。结合FITC-的藤黄胺与PC12细胞一起培养10min,能够用于引起其与TrkA受体的关联,而仅有FITC不能渗透到细胞中。因此,这些信息能够显示藤黄胺是否渗透细胞膜并通过与NGF不同的区域紧密结合至TrkA受体。
红藻氨酸触发的神经元细胞凋亡的预防和中风大鼠脑中梗死体积减小
红藻氨酸(KA)是一种AMPA受体的强力激动剂。KA的外周注射导致海马中神经元选择群落反复发作和随后的退化(Nadleret al.,1980;Schauwecker and Steward,1997;Sperk et al.,1983)。已经证实,半胱天冬酶-3的激活是KA-引起细胞死亡的必要组成(Faherty et al.,1999)。为了探究藤黄胺是否能够阻断KA引发的神经毒性,向C57BL/6小鼠皮下注射2mg/kg藤黄胺,接着注射25mg/kg KA。在5天内,对小鼠进行灌注,并将脑切成厚度为5μm的切片并安装在载玻片上。TUNEL染色显示KA是否会导致海马中大量细胞凋亡,以及这种效应是否会通过藤黄胺而显著降低。海马中细胞凋亡的定量分析显示,在CA1和CA3区域中KA诱导了47%和53%的细胞死亡,并将该结果与藤黄胺的结果进行比较。
为了进一步确定体内神经保护潜能,可以在成年雄性大鼠的短暂大脑中动脉闭塞(MCAO)中风模型中测试藤黄胺。在2h MCAO后进行再灌注之后,在再灌注开始前5min,使这些动物受载体或藤黄胺(2mg/kg)。如果所有或绝大多数动物在局部缺血性损伤和用藤黄胺处理后存活,则证明藤黄胺具有神经保护性潜能。从TTC切片的面积和体积测量能够表明用藤黄胺处理是否显著降低了中风这种暂时性局部缺血模型中的梗死体积。如果确实如此,则可将这些结果与NGF能够减小局灶性局部缺血中的梗死体积和细胞凋亡的现有报道(Guegan et al.,1998)进行比较。LDF(激光多普勒血流仪)能够对同侧顶叶皮质进行测定。可以评价藤黄胺对相对CBF(脑血流量)的影响。在丝体撤出(filament withdrawal)后(120min),在载体处理的组中和藤黄胺处理的组中也能够测量相对CBF,并与缺血前水平比较。对于两组之间没有显著差异的那些藤黄胺,这些数据暗示了相对局部缺血性损伤在所有组中是等价的。
越来越多的证据表明,Trk家族成员在人类的许多肿瘤的发生、发展和转移中起到关键作用(Descamps et al.,2001;Douma et al.,2004;McGregor et al.,1999)。神经营养因子受体家族的成员,在各种人类癌症,包括前列腺癌(Weeraratna et al.,2000)、胰腺癌(Zhanget al.,2005)和胸癌中是上调的。例如,NGF强烈地刺激胸癌细胞生长,这分别是由TrkA和p75NTR介导的(Dolle et al.,2004)。新的证据表明,TrkA在这些癌症的发展中起到了关键作用。在胰腺癌的情况下,TrkA的表达增加还与疼痛水平增加有关。来自Cephalon Pharmaceuticals的星形孢菌素Trk抑制剂已经显示出优异的临床前抗肿瘤效能(George et al.,1999)并已经进入人类临床试验(Lippa et al.,2006;Marshall et al.,2005)。由于在许多肿瘤中的TrkA异常性激活会推动癌症发展,因此像藤黄胺这样的小分子可能不仅能防止神经元细胞死亡,它们可能也会促进癌细胞增殖。
藤黄酸已经被用于传统中药来治疗癌症。其强有力地体外阻断人体和动物中癌细胞增殖(Wu et al.,2004;Zhang et al.,2004;Zhaoet al.,2004)。近来,已经表明,转铁蛋白受体作为藤黄酸的细胞靶而发挥作用,从而发挥其抗癌活性。假定藤黄胺可以结合转铁蛋白受体以及TrkA。藤黄酸与转铁蛋白关联的Kd为2.2μm(Kasibhatlaet al.,2005)。可以设想,藤黄胺将结合至TrkA受体,比转铁蛋白受体更具有特异性并且更加紧密。因此,它们发挥的神经营养活性可能会比细胞凋亡效应更加强烈些选择性更高。NGF通过严格的蛋白激酶级联作用,如磷酸肌醇3-激酶/Akt和促有丝分裂剂-激活的蛋白激酶途径来调节神经元细胞凋亡。由于神经变性是各种神经系统疾病(包括阿尔茨海默氏症和肌萎缩侧索硬化)的根本原因,因此识别对神经元提供营养支持的分子并界定其行为机制是很重要的。除了起到靶衍生的存活因子的作用之外,NGF也调节成体神经元中活性依赖性的神经元可塑性。而且,NGF可以适用于治疗神经变性病如阿尔茨海默氏症(Olson,1993)。因此,那些属于激动剂(和部分激动剂)并防止神经元细胞死亡的藤黄胺,在临床上对于治疗各种神经变性疾病和中风是很重要的。
材料和方法
细胞和药剂
PC12细胞于37℃,5%CO2气氛在调节湿度的培养箱中被维持在培养基A(具有10%胎牛血清(FBS)、5%马血清和100单位的青霉素-链霉素的DMEM)中。通过将N18TG2成神经细胞瘤细胞与来自产后21天隔膜的鼠(菌株C57BL/6)神经元融合而产生小鼠中隔神经元x成神经细胞瘤杂合体SN56细胞。SN56细胞在37℃下用5%CO2气氛维持于含有1mM丙酮酸盐和10%FBS的DMEM培养基中。在含有300μg/mL G418的相同培养基中孵育大鼠TrkA稳定转染的T17细胞。细胞是由波士顿大学(Boston University)的Brygida Berse博士赠送的。NGF来自Roche。磷-Akt-473或308、Akt和核纤层蛋白A/C抗体来自Cell Signaling。抗-磷-Akt 473抗体来自Upstate Biotechnology,Inc.。含有2000种生物活性化合物的化学物质文库来自Spectrum Collection(MicroSource DiscoverySystem,Inc.Gaylordsville,CT 06755)。以上没有包括的所有化学品都购自Sigma。
基于细胞的筛选
可以在100μL全部培养基中以10,000细胞/孔在96孔板中接种T17细胞。细胞孵育过夜,接着用10μM化合物在DMSO中(来自Spectrum Collection library的10mM原液浓度)预处理30min。然后用1μM星形孢菌素处理细胞9h。在实验终止前1小时,引入10μMd MR(DEVD)2,其是一种细胞渗透性半胱天冬酶-3-激活的荧光染料。用4%的多聚甲醛固定细胞15min。随后用PBS冲洗细胞并与1μg Hoechst 33342一起孵育10min。随后用PBS冲洗盖玻片,安装,并利用荧光显微镜检查。
藤黄胺类的固定,以及FITC-藤黄胺的合成
藤黄胺类能够被固定于含有与藤黄胺上的胺基具有反应活性的环氧基团的合适亲合胶(如,Bio-Rad的ProfinityTM EpoxideResin)。该反应可在室温下进行。反应混合物经过冲洗除去过量的试剂,而藤黄胺-结合的微珠能够在黑暗中保持在4℃的1×PBS中。荧光素的异氰酸酯形式,FITC,能够与藤黄胺结合。这些胺能够在合适的溶剂如乙醇中引入FITC中。在2h室温下培养之后,反应溶液能够倾入水中,随后用乙酸乙酯萃取。有机层能够进行干燥并浓缩而得到粗产物,能够通过色谱(SiO2,EtOAc-己烷)纯化而得到所需化合物。
共免疫沉淀和体外结合分析
HEK293细胞或PC12细胞的10-cm孔板在PBS中冲洗1次,并在1mL溶胞缓冲剂(50mM Tris,pH 7.4,150mM NaCl、1mMEDTA、0.5%Triton X-100、1.5mM Na3VO4、50mM NaF、10mM焦磷酸钠、10mM甘油磷酸钠、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mg/ml抑肽酶、1mg/ml亮肽素、1mg/ml胃酶抑素A)中溶解,并以14,000×g在4℃下离心10min。将上清液转移至新管中。在SDS-PAGE之后,将样品转移至硝酸纤维素膜。利用各种抗体进行蛋白质印迹分析。
红藻氨酸/藤黄胺药物的给药
对60日龄的雄性C57BL/6小鼠皮下注射(s.c.)单剂量的盐水中的30%乙醇或KA(25mg/kg)(Sigma,MO)或藤黄胺(2mg/kg)接着注射KA。连续监控这些动物2h以监控发作活性的开始。在治疗5天时,可以对动物进行麻醉,并用0.1M磷酸盐缓冲盐水中的4%多聚甲醛灌注。切除脑,后固定过夜并石蜡包埋处理。切成5μm的连续切片,并置于于载玻片(Superfrost-plus,Fisher)上。处理该载玻片以用于TUNEL染色,从而评价DNA断裂的程度。
局灶性局部缺血模型
大鼠可用于局灶性局部缺血研究。对于研究组包括/不包括大鼠的标准可基于脑血流量(CBF)的激光多普勒血流仪(LDF)测量结果。为了确保局部缺血性损伤的相对均匀性,从同组中排除平均局部缺血性LDF>40%基线LDF的动物。这个过程导致始终如一的较大和较均匀的梗死,降低了实验的变化性。麻醉能够通过吸入5%的异氟烷(在N2/O2 70%/30%混合物中)进行并通过吸入2%异氟烷维持。采用SurgiVet(model V3304;Waukesha,WI,USA)脉冲血氧定量仪,血液能够进行监控SpO2并维持在90%的水平。在整个手术期间监控体温(经由直肠探针)并采用加热毯(HarvardApparatus,South Natick,MA,USA)维持在36.5~37.5℃。在颞肌上覆的皮肤中切开小切口,并将激光多普勒探针(Moor Instruments,Wilmington,Delaware,USA)置于颞骨上部(离前囟点侧向6mm,后向2mm)。局部缺血能够按照先前的描述通过右中脑动脉的梗塞诱发(Sayeed et al.,2006)。病变体积:用过量戊巴比妥钠溶液(75mg/kg)后闭塞(post-occlusion)24h将鼠处死。小心切除脑并置于冰冷盐水中,随后从后极1mm处开始至前极切成具有大鼠脑基质(Harvard Apparatus)的厚度为2mm的片7连续冠状切片。切片之后,将切片用2%的氯化2,3,5-三苯基四唑(TTC,Sigma)盐水溶液染色并在37℃在黑暗中保持10min。随后将染色的切片在10%缓冲的福尔马林中固定。采用高分辨扫描仪(Epson Perfection 2400Photo)扫描每一染色的冠状切片的两半球,随后通过数字图像分析(Image Pro System,Media Cybemetics,Silver Spring,MD,USA)进行评价。给药:随机分配经过MCAO引起局部缺血性损伤<40%基线LDF的大鼠以接受GA(n=4)、或载体(n=4)处理。在再灌注开始前5min,按照2mg/kg的剂量通过ip注射给予GA。除了它们接受相同体积/重量的仅仅载体之外,对载体组的大鼠实施相同的实验方案。
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现在已经全面地描述了本发明,本领域普通技术人员应该理解到,在宽泛的和等价范围的条件、制剂和其他参数范围内同样能够实施本发明,而不会影响本发明或其任何实施方式的范围。本文中引述的所有专利、专利申请和出版物都以其全文全部结合于本文作为参考。
Claims (13)
1.一种藤黄酸的胺类似物,其中,所述胺基具有结构式(CH2NR1R2),其中R1和R2单独地是氢、可选取代的低级烷基、可选取代的芳基、可选取代的低级芳烷基、或可选取代的低级烷基芳基基团,
其中,所述取代基是选自由卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、氨基、硝基、氰基、C1-C6酰基氨基、C1-C6氨基酰基、C1-C6酰氧基、C1-C6烷氧基、芳氧基、烷硫基、C6-C10芳基、Cd-C7环烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C6-C10芳基(C2-C6)烯基、C6-C10芳基(C2-C6)炔基、饱和或部分饱和的5-7元杂环基、或杂芳基组成的组中一种或多种,
或其药用盐或前药。
2.一种藤黄酸的胺类似物或其药用盐或前药,其中,所述酰胺基具有结构式(CONH2)。
3.一种药物组合物,包含根据权利要求1或2中任一项所述的化合物、和药用载体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物,进一步包含除了藤黄酸的胺类似物之外的化合物,所述化合物具有神经保护活性、髓磷脂保护活性、或调节神经递质的释放。
5.一种用于治疗或预防哺乳动物中响应于TrkA激动作用的神经变性疾病的方法,包含向需要这种治疗的哺乳动物给予有效量的根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3或4所述的药物组合物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述疾病是中风、帕金森氏症、轻度认知受损、阿尔茨海默氏症、癫痫、ALS、和其他的神经变性疾病。
7.一种在局部缺血事件之前、期间或之后提供神经保护的方法,包含向需要神经保护的患者给予根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3或4所述的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述化合物或组合物在中风或其他局部缺血事件之后给药。
9.根据权利要求7所述的方法,其中,所述化合物或组合物在暴露于神经毒素之后给药。
10.根据权利要求7所述的方法,其中,所述化合物或组合物与至少一种已知的神经保护药剂、或所述神经保护药剂的药用盐一起给药。
11.一种用于治疗或预防脱髓鞘病的方法,包含向需要这种治疗或预防的患者给予根据权利要求1或2中任一项所述的化合物或根据权利要求3或4所述的药物组合物。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,所述脱髓鞘病是多发性硬化症。
13.根据权利要求11所述的方法,其中,所述化合物或组合物与干扰素或其聚乙二醇化形式一起给药。
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