CN116808106A - 一种花椒挥发油脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花椒挥发油脂质体，它是含有如下重量体积百分比的原料制备而成：花椒挥发油0.5～1.5％，脂质1～3％，乳化剂1～3％，其余为水。本发明通过特定的辅料组成开发的红花椒挥发油的脂质体，稳定性好，包封率高，将其通过口服或经皮给药能增加其中活性成分入脑浓度和体内的生物利用度，可用于治疗脑神经疾病，如抑郁症和/或焦虑症，解决了红花椒挥发油在临床上应用难的问题，具备实际应用价值。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种花椒挥发油脂质体。
背景技术
花椒是芸香科落叶灌木植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)的干燥成熟果皮，主要包括青花椒(Zmnthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.)和红花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)，是我国传统的调味香料和药用植物，可散发出浓烈芳香，味辛、麻、辣，能散寒祛湿，还有抑菌功效。文献和本课题组研究报道红花椒挥发油具有抗抑郁，抗焦虑等作用。花椒挥发油是从其果皮中提取的易挥发性成分，含烯烃、醇类、酮类和酯类等化学物质。不同品种干花椒果皮中挥发油含量和组分差异较大，这是造成不同花椒香气和品质差异的主要原因。
研究表明：青花椒和红花椒挥发油主要成分都为烯类、醇类，但红花椒挥发油中含帖烯类物质较多，青花椒挥发油含醇类物质较多，红花椒挥发油所含柠檬烯是青花椒挥发油的1.8倍，青花椒芳樟醇含量是红花椒的3倍。青花椒和红花椒挥发油都存在水溶性及生物利用度差阻碍其在临床上应用的问题。王茹嫣等，青花椒挥发油固体脂质纳米粒的制备及质量评价[J]，食品工业，2021,42(2)公开了一种青花椒挥发油脂质纳米粒，其通过将青花椒挥发油包封于脂质体中改善了药物的体外透皮吸收，但目前还没有将红花椒挥发油制成脂质体改善其生物利用度，特别是透过血脑屏障，进入脑部含量，提高脑部生物利用度的报道。由于植物提取物是由许多成分组成的混合体，物理化学性质比较复杂，在提取物种类发生变化时，制剂辅料的筛选及制剂处方的设计也会发生变化，且成型工艺的难度也较大，无法简单将青花椒挥发油脂质体处方转用于红花椒挥发油，这极大限制了红花椒挥发油的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种花椒挥发油脂质体，它是含有如下重量体积百分比的原料制备而成：
花椒挥发油0.5～1.5％，脂质1～3％，乳化剂1～3％，其余为水。
进一步的，它是含有如下重量体积百分比的原料制备而成：
花椒挥发油1％，脂质1％，乳化剂2.5％，其余为水。
进一步的，所述脂质为固体脂质和液体脂质；所述固体脂质为单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯和/或山嵛酸甘油酯；所述液体脂质为肉豆蔻酸甘油酯、辛癸酸甘油酯和/或中链酸酸甘油酯。
进一步的，所述脂质由质量比6～8：2～4的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯组成，优选由质量比1：1的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯组成。
进一步的，所述乳化剂是由质量比1～2:1～2的大豆卵磷脂和吐温-80组成，优选由质量比1:1的大豆卵磷脂和吐温-80组成；所述花椒挥发油为红花椒挥发油。
进一步的，它还含有冻干保护剂；所述冻干保护剂为蔗糖；所述蔗糖的加入量为液体体积的1/10，g/ml。
本发明还提供了一种前述花椒挥发油脂质体的制备方法，它包括如下步骤：
1)按配比称取原料；
2)取脂质和花椒挥发油，在水浴中混合，得油相；取乳化剂和水混合，得水相；水相滴入油相中，搅拌，得初乳；
3)取步骤2)所得初乳超声，冷却，过滤，即得。
进一步地，步骤2)所述水浴的温度为50±1℃；等温的水相滴入油相中；搅拌的速度为1000r/min，时间20min；步骤3)所述超声的时间10min，功率60％；冰水浴中冷却30min；用0.45μm微孔滤膜过滤。
进一步地，所述步骤还包括过滤后的液体加1/10，g/ml蔗糖溶解，冻干。
本发明还提供了一种前述的花椒挥发油脂质体在制备治疗抑郁症和/或焦虑症的药物中的用途。
本发明通过特定的辅料组成开发的红花椒挥发油的脂质体，稳定性好，包封率高，将其通过口服或经皮给药能增加其中活性成分入脑浓度和体内的生物利用度，可用于治疗脑神经疾病，如抑郁症和/或焦虑症，解决了红花椒挥发油在临床上应用难的问题，具备实际应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1不同固体脂质制得的HEO-NLC外观形态(1:单硬脂酸甘油酯；2:二硬脂酸甘油酯；3:山嵛酸甘油酯)
图2不同液体脂质制得的HEO-NLC外观形态图。注：(1:肉豆蔻酸甘油酯；2:辛癸酸甘油酯；3:中链酸甘油酯)
图3不同乳化剂制得的HEO-NLC外观形态(1,大豆卵磷脂；2,吐温80；3，P 188；4,P188/大豆卵磷脂＝1:1；5,吐温80:大豆卵磷脂；6,吐温80:泊洛沙姆:大豆卵磷脂＝1:1)
图4脂质不同用量制得的HEO-NLC外观形态(从左至右脂质的用量分别为：0.5％，1％，2％，3％和5％)
图5固液脂质比制得的HEO-NLC外观形态(从左至右固液脂质比分别为：9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9)
图6不同比例乳化剂制备的HEO-NLC外观形态(从左至右乳化剂的用量分别为：0.5％，1％，2％，3％和5％)
图7不同乳化剂配比制备的HEO-NLC外观形态(从左至右乳化剂比分别为：1:1，1:2，1:3，2:1，3:1)
图8乳化剂不同配比制备的HEO-NLC外观形态(从左至右投药量分别为：0.5％，1％，2％，3％，5％)
图9不同制备的HEO-NLC外观形态(从左至右搅拌时间分别为:15，20，30，40和50min)
图10不同制备的HEO-NLC外观形态(从左至右超声时间分别为:5，10，15，20和30min)
图11不同超声功率制备的HEO-NLC外观形态(从左至右超声功率分别为:30％，45％，60％，75％和90％)
图12不同冻干保护剂的冻干粉外观图(A为甘露醇；B为蔗糖)
图13花椒挥发油纳米结构脂质体的透射电镜图
图14HEO-NLC的粒径和电位分布(A:粒径分布；B:电位分布)
图15二硬脂酸甘油酯、蔗糖、HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉、HEO的傅里叶变换红外光谱图
图16二硬脂酸甘油酯、蔗糖、HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉的DSC图
图17二硬脂酸甘油酯、蔗糖、HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉和HEO的X射线衍射图
图18HEO及HEO-NLC的体外释放曲线
图19HEO-NLC的体外释放拟和曲线.(A:零级动力学方程；B:一级动力学方程；C:Higuchi方程；D:Ritger-peppas方程)
图20不同浓度HEO-NLC(以芳樟醇计)对Caco-2细胞存活率的影响(与对照组相比，**p<0.01)
图21花椒挥发油及其制剂的Caco-2细胞摄取率(与HEO组相比，*p<0.05)
图22空白溶剂、空白纳米结构脂质体、HEO-NLC的组织病理分析
图23血清中芳樟醇的药-时曲线图
图24脑匀浆中芳樟醇的药-时曲线图
具体实施方式
实施例1本发明花椒挥发油纳米结构脂质载体的制备
配方：
红花椒挥发油1％，g/ml
脂质(质量比1：1的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯)1％，g/ml
乳化剂(质量比1:1的大豆卵磷脂和吐温-80)2.5％，g/ml
其余为水。
制备方法：
1)按配比称取原料；
2)取脂质和红花椒挥发油，在50±1℃水浴中混合，得油相；取乳化剂和水混合搅拌溶解，得水相；在1000r/min磁力搅拌条件下，将等温的水相缓慢滴加至油相中，搅拌20min形成初乳；
3)取步骤2)所得初乳迅速放入超声波细胞破碎仪中超声分散(超声10min，功率60％)，于冰水浴条件下冷却固化30min后，经0.45μm微孔滤膜过滤，得乳状脂质体HEO-NLC。
实施例2本发明花椒挥发油纳米结构脂质载体的制备
配方：
红花椒挥发油0.5％，g/ml
脂质(质量比3：1的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯)1％，g/ml
乳化剂(质量比1:1的大豆卵磷脂和吐温-80)2.5％，g/ml
其余为水。
制备方法：同实施例1。
实施例3本发明花椒挥发油纳米结构脂质载体的制备
配方：红花椒挥发油1.5％，g/ml
脂质(质量比2：1的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯)1％，g/ml；
乳化剂(质量比1:1的大豆卵磷脂和吐温-80)2.5％，g/ml
其余为水。
制备方法：同实施例1。
实施例4本发明花椒挥发油纳米结构脂质载体冻干粉的制备
取实施例1制备的HEO-NLC 20ml，加2.0g蔗糖混合溶解，于-80℃条件下预冻48h，预冻完全后迅速转移至冷冻干燥机中进行干燥，得HEO-NLC冻干粉。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1本发明花椒挥发油纳米结构脂质载体的制备研究
1实验材料及器材
1.1实验材料
1.2实验仪器
2实验方法
2.1 HEO-NLC的制备
2.1.1 HEO-NLC的处方组成比例
处方的具体情况如下：固体脂质二硬脂酸甘油酯0.1g，液体脂质辛癸酸甘油酯0.1g，吐温-80\大豆卵磷脂(m:m＝1:1)0.6g，花椒挥发油0.2g，制备成20mL的纳米结构脂质体。单因素考察时以此处方为基础。
2.1.2 HEO-NLC的制备过程
结合实验条件采用熔融乳化-超声分散法制备HEO-NLC。油相由固体脂质与液体脂质在50±1℃水浴条件下，加入花椒挥发油混合而成，水相由乳化剂和超纯水搅拌溶解组成，在1000r/min磁力搅拌条件下，将等温的水相缓慢滴加至油相中，搅拌20min形成初乳。将初乳迅速放入超声波细胞破碎仪中超声分散(超声10min，功率60％)，于冰水浴条件下冷却固化30min后，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得HEO-NLC。
2.2单因素考察HEO-NLC最优处方
以脂质用量、固/液脂质比、乳化剂用量、乳化剂配比、投药量、初乳搅拌时间、超声时间、超声振幅八个因素作为单因素考察对象，以平均粒径和Zeta电位为评价指标，按照“2.1.2HEO-NLC的制备过程”项下制备HEO-NLC，考察上述各因素对HEO-NLC的影响。
2.2.1固体脂质的选择
固定处方中其他因素不变，分别对单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯和山嵛酸甘油酯三种固体脂质进行考察，按照“2.1.2HEO-NLC的制备过程”项下制备纳米粒，并以外观、平均粒径、PDI和Zeta电位作为指标对所得制剂进行评价，选出最优固体脂质。
2.2.2液体脂质的选择
固定处方中其它因素不变，分别对中链甘油三酸酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛癸酸甘油酯三种液体脂质进行考察，按照“2.1.2HEO-NLC的制备过程”项下制备纳米粒，并以外观、平均粒径、PDI和Zeta电位作为指标对所得制剂进行评价，选出最优液体脂质。
2.2.3乳化剂的选择
固定处方中其它因素和制备条件不变，分别对六种单一或复合乳化剂：大豆卵磷脂、吐温-80、泊洛沙姆188、吐温-80/大豆卵磷脂(1:1)、泊洛沙姆188/大豆卵磷脂(1:1)以及泊洛沙姆188\大豆卵磷脂\吐温80(1:1:1)复合乳化剂进行考察，按照“2.1.2HEO-NLC的制备过程”项下制备纳米结构脂质体，并以外观、平均粒径、PDI和Zeta电位作为指标对所得制剂进行评价，选出最优乳化剂。
2.2.4脂质用量
选择大豆卵磷脂\吐温-80(1:1)作为复合乳化剂，用量为3％；挥发油含量1％；二硬脂酸甘油酯及辛癸酸甘油酯分别作为固、液体脂质，比例为5:5时，考察脂质用量为0.5％(0.05g:0.05g)、1％(0.1g:0.1g)、2％(0.2g:0.2g)、3％(0.3g:0.3g)、5％(0.5g:0.5g)时对HEO-NLC粒径以及Zeta电位的影响。
2.2.5固/液脂质比
选择大豆卵磷脂/吐温-80(1:1)作为复合乳化剂，用量为3％；挥发油投药量1％；二硬脂酸甘油酯及辛癸酸甘油酯分别作为固、液体脂质，总用量1％，考察固/液脂质比9:1(0.18g:0.02g)、8:2(0.16g:0.04g)、7:3(0.14g:0.06g)、6:4(0.12g:0.08g)、5:5(0.1g:0.1g)、4:6(0.08g:0.12g)、3:7(0.06g:0.14g)、2:8(0.04g:0.16g)、1:9(0.02g:0.18g)时对HEO-NLC粒径以及Zeta电位的影响。
2.2.6乳化剂用量
选择挥发油投药量1％；二硬脂酸甘油酯及辛癸酸甘油酯作为固、液体脂质，比例为5:5，总用量为1％；大豆卵磷脂/吐温-80(1:1)作为复合乳化剂，考察复合乳化剂总用量分别为0.5％、1％、2％、3％和5％时对HEO-NLC粒径以及Zeta电位的影响。
2.2.7乳化剂配比
选择挥发油投药量1％；二硬脂酸甘油酯及辛癸酸甘油酯作为固、液体脂质，比例为1:1，总用量为1％；大豆卵磷脂/吐温-80，用量为3％，配比分别为1:1(0.3g:0.3g)、2:1(0.4g:0.2g)、3:1(0.45g:0.15g)、1:2(0.2g:0.4g)时对粒径以及Zeta电位的影响。
2.2.8挥发油含量
选择大豆卵磷脂/吐温-80(1:1)作为复合乳化剂，用量为3％；二硬脂酸甘油酯及辛酸甘油酯作为固、液体脂质，比例为5:5，总用量1％；考察挥发油含量分别为0.25％(0.05g)、0.5％(0.1g)、1％(0.2g)、1.5％(0.3g)、2％(0.4g)时对HEO-NLC粒径以及Zeta电位的影响。
2.2.9搅拌时间
固定超声时间为10min，超声振幅为60％，按照“2.1.1HEO-NLC的处方组成比例”项下条件，对搅拌时间分别为15min、20min、30min、40min、50min所制备的HEO-NLC对粒径以及Zeta电位的影响。
2.2.10超声时间
固定搅拌时间为10min，超声振幅为60％，按照“2.1.1HEO-NLC的处方组组成比例”项下条件，对超声振幅分别为30％，45％，60％，75％，90％所制备的HEO-NLC测定粒径以及对粒径以及Zeta电位的影响。
2.3优化HEO-NLC处方
2.3.1实验设计
对单因素试验的考察结果后，选择乳化剂用量(A)、脂质用量(B)、乳化剂配比(C)作为试验考察因素，以平均粒径和三种成分对柠檬烯、芳樟醇和乙酸芳樟酯包封率影响的综合评分作为评价指标，设计试验对HEO-NLC处方进行优化，确定最佳处方参数后平行3次(n＝3)实验进行验证，计算实际综合评分。实验设计因素的水平表如表1所示。
表1因素水平表
2.3.2HEO-NLC最佳处方的确定及验证试验
按照试验安排预测的最佳处方进行3批平行试验，测定HEO-NLC中柠檬烯、芳樟醇和乙酸芳樟酯的含量并计算出综合评分。计算平均综合评分，验证HEO-NLC综合评分的实际值与预测值之间的差异。
2.4HEO-NLC冻干保护剂的选择
考察质量浓度为10％时，甘露醇和蔗糖2种冻干保护剂对HEO-NLC的冻干效果。将新制HEO-NLC与冻干保护剂以体积质量比20ml：2.0g混合溶解，于-80℃条件下预冻48h，预冻完全后迅速转移至冷冻干燥机中进行干燥，即得HEO-NLC冻干粉。以冻干粉的外观形态，再分散性和粒径为HEO-NLC冻干工艺的评价指标。
3实验结果
3.1HEO-NLC处方的单因素考察结果
3.1.1固体脂质的考察
图1为单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯和山嵛酸甘油酯三种固体脂质所制HEO-NLC外观图，其粒径、PDI指数和zeta电位结果见表2。不同固体脂质制备出的纳米结构脂质体平均粒径：单硬脂酸甘油酯组(155.30nm)＜二硬脂酸甘油酯组(161.34nm)＜山嵛酸甘油酯组(532.2nm)。PDI值单硬脂酸甘油酯组最小为14.9％，山嵛酸甘油酯组最大为30.9％。三种固体脂质形成的纳米结构脂质体的Zeta电位分别为：-11.0mV，-17.5mV和-21.8mV。单硬脂酸甘油酯平均粒径与二硬脂酸甘油酯的粒径接近，但Zeta电位值较小，且放置后分层明显。山嵛酸甘油酯组形成的纳米结构脂质体粒径较大，且放置后也出现分层的现象。因此，选择二硬脂酸甘油酯作为制备HEO-NLC的固体脂质。
表2不同固体脂质制得的HEO-NLC的平均粒径、PDI、Zeta电位
3.1.2液体脂质的选择
图2为肉豆蔻酸甘油酯、辛癸酸甘油酯和中链酸酸甘油酯三种液体脂质所制HEO-NLC，其粒径、PDI指数和zeta电位结果见表3。不同液体脂质制备出的纳米结构脂质体平均粒径：肉豆蔻酸甘油酯组(133.47nm)＜中链酸甘油酯(165.61nm)＜辛癸酸甘油酯组组(162.21nm)，PDI值肉豆蔻甘油酯最小为22.4％，中链酸甘油酯组最大为31.6％。三种液体脂质形成的纳米结构脂质体的Zeta电位分别为：-12.5mV，-13.8mV和-15.5mV。肉豆蔻酸甘油酯组虽然粒径和PDI值均较小，但放置后分层现象明显。辛癸酸甘油酯和中链酸甘油酯的平均粒径接近，Zeta电位值较小，但放置后无明显分层现象。因此，选择辛癸酸甘油酯作为制备HEO-NLC的液体脂质。
表3不同液体脂质制得的HEO-NLC的平均粒径、PDI、Zeta电位
3.1.3乳化剂的选择
六种单一及复合乳化剂所制HEO-NLC如图3所示，平均粒径、PDI和Zeta电位结果见表4。不同表面活性剂制备出的HEO-NLC的平均粒径和PDI均相差较大。平均粒径由小到大为吐温80:大豆卵磷脂＝1:1组＝吐温80:泊洛沙姆:大豆卵磷脂＝1:1:1组＜泊洛沙姆:大豆卵磷脂＝1:1组＜P 188组＜吐温-80组＜大豆卵磷脂组。PDI值大豆卵磷脂组最小，吐温80组、P188组和吐温80:大豆卵磷脂＝1:1组值最大。Zeta电位除泊洛沙姆组较小外，其余各组差异不大。以上结果看出，单一的乳化剂乳化能力有限。因此，本发明最终选择吐温-80/大豆卵磷脂＝1:1作为复合乳化剂制备HEO-NLC。
表4不同乳化剂制得的HEO-NLC的平均粒径、PDI、Zeta电位
3.1.4脂质用量
HEO-NLC脂质用量考察结果如图4所示。当脂质用量从0.5％-2％时，平均粒径逐渐减小；当脂质用量逐渐增大时，平均粒径也逐渐增大。当脂质用量为2％时，平均粒径最小为44.50nm，Zeta电位差异不大。因此，选择脂质用量为1～3％作优化的因素水平。
3.1.5固液脂质比
HEO-NLC固/液脂质比考察结果见图5。由图可见：随着液体脂质量的增加，平均粒径呈现出先增大后减小后几乎不变的总体趋势。当固/液脂质比为8:2时，平均粒径最大为72.1nm，当固/液脂质比为1:9时，平均粒径最大小为47.09nm。结合平均粒径和Zeta电位综合选择固液脂质比的比例为1:1。
3.1.6乳化剂用量
HEO-NLC乳化剂用量考察结果如图6所示。随着吐温-80和大豆卵磷脂用量的增加，平均粒径呈现先减小后略微增大的趋势。当乳化剂用量为3％时，测得的粒径30.32nm。因此，选择乳化剂用量1～3％作为后续优化的因素水平。
3.1.7乳化剂配比
HEO-NLC乳化剂配比考察结果见图7。由图可知：随着吐温-80比例的增加，平均粒径逐渐减小。因此，选择乳化剂配比大豆卵磷脂:吐温-80(2:1)～大豆卵磷脂:吐温-80(1:2)作为优化的因素水平。
3.1.8挥发油的加入量
HEO-NLC中挥发油的加入量考察结果如图8所示。随着HEO加入量的增加，脂质体平均粒径逐渐增大，可能是由于部分HEO未被包埋导致其吸附在纳米粒表面，从而增大平均粒径。在挥发油加入量为1％时粒径较小，且Zeta电位较大。因此，选择挥发油的含量为1％。
3.1.9搅拌时间
搅拌时间结果如图9所示。随着搅拌时间的延长，平均粒径先减小后增大，但当搅拌时间为50min时，脂质体粒径明显增大。Zeta电位变化不显著。因此，选择搅拌时间为20min。
3.1.10超声时间
不同超声时间结果如图10所示。超声时间在5～15min时，脂质体粒径逐渐减小，超声15min以后粒径略有增大，但变化不显著。Zeta电位出现先增大后减小的趋势，在超声15min时出现最低点。超声时间在20和30min时Zeta电位变化不大。考虑超声探头的损耗，故选择超声时间为10min。
3.1.11超声振幅
超声振幅结果如图11所示。超声振幅从30％～60％，随着超声振幅的增大，纳米脂质体的粒径逐渐减小，当振幅超过60％时，粒径变化不大。但当超声振幅为90％时，超声探头损耗较大，故选用超声的振幅为60％。
3.2优化HEO-NLC处方
3.2.1试验安排及结果
在HEO-NLC单因素考察结果的基础上，以乳化剂用量(A)、脂质用量(B)、乳化剂配比(C)为考察因素，以平均粒径和三种成分包封率为指标综合分析，具体见表5。
表5优化试验结果
3.2.2最佳处方的确定及验证试验
将表5的结果结合试验实际，确定最佳处方为：乳化剂用量2.5％、脂质用量1％、乳化剂配比为1:1。按照最佳处方参数进行试验验证，三批HEO-NLC的综合得分分别为0.895，0.876和0.923，实验得到的实际值表明最佳配方可作为HEO-NLC处方。
3.3冻干剂的选择
以10％的甘露醇和10％的蔗糖种冻干保护剂得到的HEO-NLC冻干粉考察结果如图12所示。两种冻干保护剂得到的HEO-NLC冻干粉外观形态均良好，但以蔗糖为冻干保护剂制得的冻干粉复溶速度快且复溶后测得的粒径较小为115.03nm。综上，选择10％的蔗糖为HEO-NLC的冻干保护剂。
4实验小结
本发明筛选出了二硬脂酸甘油酯、辛酸甘油酯和吐温-80:大豆卵磷脂＝1:1分别为最适固体脂质、液体脂质和表面活性剂。单因素考察了脂质用量、固液脂质比等八个因素对HEO-NLC平均粒径和zeta电位的影响，发现乳化剂用量、脂质用量和乳化剂配比三个因素为影响粒径和电位最大的因素，并通过BBD响应面法优化得到最佳工艺参数：乳化剂用量2.5％、脂质用量1％、乳化剂配比为1:1。该处方条件下制备得到的花椒挥发油纳米结构脂质体的平均粒径为46.32nm，柠檬烯、芳樟醇和乙酸芳樟酯的平均包封率分别为85％、86％和91％，综合得分分别为0.895，0.876和0.923与预测值0.943较接近，表明实验建立的响应面模型预测结果及优化后工艺重现性均较好。并选出10％的蔗糖为HEO-NLC的冻干保护剂。
试验例2花椒挥发油纳米结构脂质体的质量评价
1实验材料和仪器
1.1实验材料
1.2实验仪器
2 实验方法
2.1 形貌观察
按实施例1制备三批HEO-NLC，肉眼观察脂质体的颜色、澄清度、是否有沉淀析出等。采用负染色法观察HEO-NLC形态。具体操作如下：取一蜡板，吸取样品10μL滴加于带支撑膜的铜网上沉淀1min后滴加醋酸双氧铀10μL，沉淀1min，滤纸吸去浮液滤纸，常温下干燥，80-120kv进行电镜检测，拍照。
2.2粒径和电位
新制备的HEO-NLC，经超纯水稀释5倍后，使用纳米粒度仪测定其粒径、PDI及Zeta电位。
2.3包封率及载药量
色谱条件：色谱柱为HP-Innowax石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度260℃，检测器温度280℃。载气为高纯度氢气、氮气及空气，进样量1μL，分流比5:1，流速1.5mL/min。程序升温：柱起始温度60℃，保持4min；以5℃/min升温至220℃，保持5min。
供试品溶液的制备：精密量取2mL HEO-NLC置于25mL的纳氏比色管中，分别加入2mL超纯水、5mL正己烷，盖上盖子，超声30min(功率:100％)，静置30min后吸取上清液(如有乳化现象，则加入适量NaCl，混合，离心)，定容后制得供试品溶液。
将制备的HEO-NLC进行包封率及载药量的测定。
包封药量测定：精密量取HEO-NLC 2mL置于100ka的超滤管内管中，在4℃、8000r/min条件下离心20min，收集超滤管内管纳米粒，按上述方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定柠檬烯、芳樟醇和乙酸芳樟酯的浓度。
总药量测定：精密量取2mL HEO-NLC，按上述方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定柠檬烯、芳樟醇和乙酸芳樟酯的浓度。
测得的包封药量及总药量按照下列公式，代入以下公式计算脂质体的包封率和载药量：
2.4傅里叶变换红外光谱(FTIR)
按照试验例1“HEO-NLC冻干保护剂的选择”项下操作对HEO-NLC及空白NLC(按照实施例1制备的不含红花椒挥发油的脂质体)进行冷冻干燥。取适量HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉、蔗糖、双硬脂酸甘油酯，加入适量干燥溴化钾粉末进行研磨，压片。取适量HEO滴加于溴化钾片上，快速烘干后使用傅里叶变换红外光谱仪进行测定。
2.5差示扫描量热法(DSC)
分别称取适量(5～10mg)HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉、蔗糖、双硬脂酸甘油酯于铝样品盘中，压片密封，以空铝样品盘作为参照，设置氮气流速为20mL/min，以10℃·min-1的升温速率测定20℃～210℃范围内的热量变化。
2.6X射线衍射
采用X-射线衍射仪对HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉、蔗糖、双硬脂酸甘油酯和HEO进行测定。所有测试样品的2θ角测量范围为2°～45°，扫描速率为2°/min，X射线源是Cu阳极(45kV，40mA，Cu-Kɑ辐射)。
2.7体外释放
采用动态透析法测定HEO-NLC和HEO(红花椒挥发油)的释放度。精密量取34μL HEO用含10％乙醇的PBS溶液(PH7.2～7.4)稀释至5mL，以及HEO-NLC溶液5mL，芳樟醇的量为8.08mg。将上述两种溶液分别转移至截留分子量为8000～14000的透析袋中(透析袋在使用前需按照使用说明进行活化处理)后置于100mL含10％乙醇的PBS溶液(PH 7.2～7.4)中，在37±0.5℃，转速为100r/min的条件下，分别于固定时间点1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h各取样1mL，并立即补充等体积、等温的释放介质。取出的样品使用2mL正己烷萃取30min，经0.22μm微孔滤膜过滤，按“2.3气相色谱条件”项下测定，计算芳樟醇浓度，并根据以下公式计算累积释放率(Q)。
Q(％)＝[Vt∑C(i-1)+V0Ci]/m×100％
其中，Vt为每次取出释放介质的体积(mL)，Ci为第i个时间点时释放介质中芳樟醇的浓度(μg/mL)，V0为释放介质总体积(mL)，m为芳樟醇的总质量(mg)。
2.8储存稳定性
将新制的三批HEO-NLC分别置于4℃和25℃条件下避光放置3个月研究HEO-NLC的储存稳定性。在稳定性考察期间，分别于0、7、15、30、60、90天取样，观察HEO-NLC外观，并按照“2.2粒径和电位”项下条件测定其粒径、PDI和Zeta电位。
2.9细胞毒性
将融合度超过90％的Caco-2细胞用胰酶消化，调整细胞密度为每毫升1×105个。取细胞悬液100μL接种于96孔板上，放入含5％ CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养。细胞培养48h后，给药组孔板中分别加入浓度分别为5、10、25、50、100和200μg/mL(以芳樟醇计)的含药培养液，对照组加入等体积的完全培养基。细胞孵育24h后，吸弃孔内溶液，PBS清洗2～3次，每孔加入含10％的CCK-8的完全培养基溶液，继续孵育30min后于450nm测定吸光度值，计算细胞存活率。
2.10细胞摄取
Caco-2细胞用消化后，调整密度为1×105个/mL后接种于6孔板中，每孔1mL细胞悬浮液。Caco-2细胞培养14天。于第14天，先吸去培养液，用PBS洗涤3次，第3次洗涤时于培养箱中孵育30min后吸弃PBS。将花椒挥发油和纳米结构脂质体溶液(以芳樟醇计，28μg/mL)分别各取1mL于Caco-2细胞中，分别孵育1、2和4h后吸弃上清液，用PBS清洗细胞。加入100μLRIPA裂解液4℃裂解30min，随后将裂解液分成两部分：50μL裂解液中加入100μL正己烷，涡旋后12000r/min离心10min，GC-MS测定上清液中各成分的含量；剩余50μL裂解液用BCA试剂盒测定蛋白含量。按以下公式计算细胞摄取量。
细胞摄取量(μg/g)＝细胞摄取的药物量(μg)/细胞的蛋白量(g)
2.11组织相容性
分别灌胃给予正常ICR小鼠空白溶剂、空白脂质体和花椒挥发油脂质体溶液。给药28day后取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织，于4％多聚甲醛中固定。随后将组织HE染色并进行病理分析。
2.12药代动力学实验
健康ICR小鼠随机分为2组：分别灌胃剂量为300mg/kg的花椒挥发油溶液和芳樟醇等剂量的花椒挥发油纳米结构脂质体。各组动物在灌胃后1，2，4，8，12h和24h摘眼球取血，全血3000r/min离心10min，制得血清样品。处死小鼠，取脑组织，剥离血管，称重，加入脑组织质量3倍量的PBS溶液，低温匀浆，10000r/min离心10min，收集上清液。
GC-MS/MS色谱及质谱条件：HP-INNOWAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯氦气，柱流速为线速度控制模式，初始流速为1.3mL/min；进样口温度为200℃，高压不分流进样。升温程序：初始温度60℃，保持4分钟，以10℃/min升至220℃，保持5min，EI测定条件：50eV，离子源温度260℃，传输线温度220℃；动态多反应监测模式。
GC-MS/MS测定血清与脑组织匀浆中芳樟醇的含量，并采用DAS 3.0相关软件对动力学参数进行计算。
3 实验结果
3.1 形貌观察
所得纳米结构脂质体的宏观形貌如图13所示。在自然光下，肉眼观察到三批HEO-NLC澄清透明，呈淡黄色乳光且有光束，轻微震摇后层次均一，分布均匀，底部无可见不溶性颗粒。脂质体的微观形貌如13B图所示，制得的HEO-NLC为类球型粒子，颗粒大小差异较小，分布较均匀。
3.2粒径和zeta电位
HEO-NLC粒径、粒径分布及电位结果见表6和图14。由表可见，HEO-NLC的平均粒径为46.21±2.95nm，其PDI值为23.03±1.53％，Zeta电位为-26.3±1.25mv。所制备的HEO-NLC粒径较小，分布较均匀，且体系较稳定。平均粒径、PDI值和电位值的RSD较小，制剂工艺重现性较好。
表6HEO-NLC粒径和电位测定值
3.3包封率及载药量
HEO-NLC中柠檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯的包封率及载药量见表7。结果表明，柠檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯的包封率分别为85.9±2.3％、86.8±3.1％、91.0±3.4％，其载药量分别为1.23±0.19％、3.83±0.28％、2.49±0.38％。
表7HEO-NLC的包封率和载药量
3.4傅里叶变换红外光谱(FTIR)
二硬脂酸甘油酯、蔗糖、空白NLC、HEO-NLC和HEO的傅里叶红外图如图15所示。由图可知，HEO的红外光谱图显示了一系列特征吸收峰：1644.41cm-1(C＝C)和1740.26cm-1(酯C＝O)。固体脂质二硬脂酸甘油酯在3416.01cm-1(O-H)、1739.61cm-1(C＝O)、2849.34cm-1(CH3)、2915.96cm-1(CH2)和1471.90cm-1(CH2)n处有明显对应的特征吸收峰。空白NLC冻干粉、蔗糖和HEO-NLC冻干粉的红外光谱图中主要官能团伸缩振动的频率基本一致。二硬脂酸甘油酯的特征峰在HEO-NLC冻干粉中未完全消失，但吸收强度明显减弱，而HEO的特征峰减弱或消失。以上结果表明纳米结构脂质载体中成功包载HEO。
3.5差示扫描量热(DSC)
二硬脂酸甘油酯、蔗糖、空白NLC、HEO-NLC的DSC见图16。DSC通过测定相变温度和相变能量的变化，研究了NLC中生物活性物质的晶型变化。二硬脂酸甘油酯的熔融吸热峰在58.32℃出现，其总焓值为115.6J/g。蔗糖的熔融吸热峰对应的熔融温度为190.28℃，其焓值为198.9J/g；在HEO-NLC的DSC热分析谱图中，二硬脂酸甘油酯的吸热峰在49.21℃出现，熔点降低，其焓值为2.063J/g，而蔗糖的熔融吸热峰为186.59℃，焓值为95.86J/g；而在空白脂质体的DSC热分析谱图中二硬脂酸甘油酯的熔融吸热峰为51.33℃，焓值也降低为3.678J/g，蔗糖的特征峰亦前移至188.03℃，焓值亦降低为88.99J/g。与固体脂质二硬脂酸甘油酯相比，空白NLC吸热峰熔点降6.99℃，焓值减小111.922J/g；与蔗糖相比，空白NLC吸热峰熔点降低2.25℃，焓值减小109.91J/g，说明加入当加入辛酸甘油酯(液体脂质)后可改变二硬脂酸甘油酯的结晶度。与HEO相比，HEO-NLC中花椒挥发油熔融吸热峰已消失，表明挥发油已被成功包埋于纳米结构脂质载体中。与空白NLC相比，HEO-NLC中二硬脂酸甘油酯的熔融吸热峰熔点降低2.12℃，焓值减小1.615J/g，蔗糖的特征熔融吸热峰略有减少，表明加入的花椒挥发油进入到混合脂质基质中，减少晶体排列。由于HEO既是药物也是液体脂质，所以峰值的偏移可能是由于此时NLC的基质是由脂质混合物和HEO的存在造成的。
3.6X射线衍射
二硬脂酸甘油酯、蔗糖、HEO-NLC冻干粉、空白NLC冻干粉和HEO的衍射图17所示。二硬脂酸甘油酯在17°、21°和23°有特征衍射峰，蔗糖在12°、18°、24°和26°等处衍射峰较强。但空白NLC冻干粉和HEO-NLC冻干粉中，蔗糖的衍射峰基本消失，且二硬脂酸甘油酯的衍射峰强度减弱。与HEO的衍射图相比，HEO-NLC的特征衍射峰基本消失。以上结果表明，HEO-NLC冻干粉中二硬脂酸甘油酯原有的晶型排列已被改变，形成一种新的不完全晶型，证实HEO-NLC制备成功。
3.7体外释放研究
HEO-NLC制剂组及花椒挥发油原料药组(芳樟醇得量均为8.08mg)体外释放结果如图18所示。花椒挥发油原料药组在前4h释放48.14％的芳樟醇，而制剂组在前4h内芳樟醇的累计释放量约为37.29％。在整个体外释放期间，HEO-NLC组的累积释放率一直低于HEO原料药组芳樟醇的累计释放率。在48h时，HEO原料药组芳樟醇的累积释放率为96.78％，而相同时间内HEO-NLC制剂组的累积释放率为81.21％。HEO-NLC制剂组芳樟醇在初期发生突释，之后释放缓慢，表明HEO-NLC具有缓释作用。
为了进一步探究HEO-NLC制剂组中芳樟醇的缓释的机制，采用Oringin软件分别对体外数据进行零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi方程和Ritger-peppas方程拟合的结果如图19。四个动力学方程的R2值分别为0.8415，0.8459，0.9402和0.9662。其中Ritger-peppas方程相关系数R2更接近1，表明芳樟醇的释放符合Ritger-peppas模型。Ritger-peppas方程中的n为释放指数，其数值可用于阐明释药机制。对于缓控释系统，当n<0.45时，药物释放机制为扩散作用；当0.45<n<0.89时，药物释放机制为扩散和骨架溶蚀共同作用。当n>0.89时，药物释放机制为骨架溶蚀作用HEO-NLC制剂组芳樟醇的释放指数为0.3092，表明芳樟醇的释药机制可能主要为药物扩散作用。
3.8HEO-NLC对Caco-2细胞存活率的影响
HEO-NLC对Caco-2细胞的毒性结果见图20。HEO-NLC浓度在5～50μg/mL(以芳樟醇计)，Caco-2细胞胞的存活率均大于90％，但当浓度达到100μg/mL和200μg/mL时，细胞的存活率显著降低，存活率分别为59.7％和52.6％。根据细胞毒性的结果，后续选择5～50μg/mL(以芳樟醇计)的HEO-NLC进行细胞摄取实验。
3.9Caco-2细胞摄取实验
如图21所示,芳樟醇在1h、2h和4h摄取率从0.0478±0.0079μg·mg-1，0.0496±0.0079μg·mg-1和0.0566±0.0052μg·mg-1增加至0.0627±0.0079μg·mg-1，0.0659±0.0062μg·mg-1和0.0681±0.0046μg·mg-1，分别增加了31.2％，32.7％和20.4％。将花椒挥发油制备成纳米结构脂质体后，对芳樟醇的摄取率增加，原因可能是纳米结构脂质体能不仅可增加难溶性成分的溶解度，还可增大芳樟醇与细胞的接触面积，从而增加难溶性药物的口服吸收。此外,纳米结构脂质体还可能直接被细胞摄取。
3.10组织病理分析
为了评价花椒挥发油的体内生物相容性，连续灌胃给予正常小鼠空白溶剂、空白脂质体和花椒挥发油脂质体28d后，取心、肝、脾、肺、肾、脑组织，通过HE染色进行组织病理分析，结果如图22所示。与空白对照组相比，空白脂质体和花椒纳米结构脂质体均未引起心、肝、脾、肺、肾、脑组织的病理学变化，这表明花椒纳米结构脂质体载药前后均未对小鼠体内各器官造成损伤，具有良好的体内生物相容性。
3.11储存稳定性
对HEO-NLC的储存稳定性进行考察。HEO-NLC在25℃条件下，60天内，体系澄清透明，有淡黄色乳光；60～90天，体系澄清度显著降低，有大量白色沉淀生成。平均粒径整体呈现增大趋势，但变化不大，保持在42.96～53.85nm范围内。Zeta电位值在-26.3～-17.8mv范围内波动，电位值降低明显。而HEO-NLC在4℃条件下相对较稳定。90天内，外观形态未发生显著改变，溶液澄清透明，有淡蓝色乳光。平均粒径随时间变化，略有改变，维持在43.81～46.51nm范围内；Zeta电位值在-26.3～-25.7mv范围内波动，相对较稳定。
基于三个月内体系的平均粒径、多分散系数和Zeta电位测定结果可知，HEO-NLC应于4℃条件下避光保存。
3.12HEO-NLC生物利用度研究
以芳樟醇计，灌胃给予等剂量芳樟醇的挥发油和HEO-NLC溶液，芳樟醇血药浓度-时间曲线和脑药浓度-时间曲线如图23和图24所示。药代动力学参数见表8～9。血清中HEO组芳樟醇的AUC值显著低于HEO-NLC。t1/2也由(3.69±1.21)h增加到(5.98±1.69)h，将HEO制备成HEO-NLC，可达到缓释的效果。脑匀浆中组HEO-NLC芳樟醇的AUC值显著高于HEO，增加了132％，HEO-NLC可增加芳樟醇入脑浓度。
表8灌胃给与小鼠挥发油及其制剂血清中芳樟醇的主要药代动力学参数(n＝6)
表9灌胃给与小鼠挥发油及其制剂脑匀浆中芳樟醇的主要药代动力学参数(n＝6)
综上，本发明脂质体能增加包括芳樟醇在内的红花椒挥发油中活性成分的入脑浓度和体内生物利用度，解决了红花椒挥发油在临床上应用难的问题，将其通过口服或经皮给药用于治疗脑神经疾病，如抑郁症和/或焦虑症具备实际价值。
Claims (10)
1.一种花椒挥发油脂质体，其特征在于：它是含有如下重量体积百分比的原料制备而成：
花椒挥发油0.5～1.5％，脂质1～3％，乳化剂1～3％，其余为水。
2.根据权利要求1所述的花椒挥发油脂质体，其特征在于：它是含有如下重量体积百分比的原料制备而成：
花椒挥发油1％，脂质1％，乳化剂2.5％，其余为水。
3.根据权利要求1或2所述的花椒挥发油脂质体，其特征在于：所述脂质为固体脂质和液体脂质；所述固体脂质为单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯和/或山嵛酸甘油酯；所述液体脂质为肉豆蔻酸甘油酯、辛癸酸甘油酯和/或中链酸酸甘油酯。
4.根据权利要求3所述的花椒挥发油脂质体，其特征在于：所述脂质是由质量比6～8：2～4的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯组成，优选由质量比1：1的二硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯组成。
5.根据权利要求1所述的花椒挥发油脂质体，其特征在于：所述乳化剂是由质量比1～2:1～2的大豆卵磷脂和吐温-80组成，优选由质量比1:1的大豆卵磷脂和吐温-80组成；所述花椒挥发油为红花椒挥发油。
6.根据权利要求1或2所述的花椒挥发油脂质体，其特征在于：它还含有冻干保护剂；所述冻干保护剂为蔗糖；所述蔗糖的加入量为液体体积的1/10，g/ml。
7.一种权利要求1～6任一项所述花椒挥发油脂质体的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)按配比称取原料；
2)取脂质和花椒挥发油，在水浴中混合，得油相；取乳化剂和水混合，得水相；水相滴入油相中，搅拌，得初乳；
3)取步骤2)所得初乳超声，冷却，过滤，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤2)所述水浴的温度为50±1℃；等温的水相滴入油相中；搅拌的速度为1000r/min，时间20min；步骤3)所述超声的时间10min，功率60％；冰水浴中冷却30min；用0.45μm微孔滤膜过滤。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤还包括过滤后的液体加1/10，g/ml蔗糖溶解，冻干。
10.权利要求1～6任一项所述的花椒挥发油脂质体在制备治疗抑郁症和/或焦虑症的药物中的用途。
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