CN105477633B - 一种竹红菌素阳离子脂质体制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种竹红菌素阳离子脂质体制剂及其制备方法与应用。该竹红菌素阳离子脂质体制剂的制备方法中，用包括下述组分的原料制备得到竹红菌素阳离子脂质体制剂：竹红菌素、阳离子磷脂、1,2‑二油酰基卵磷脂、胆固醇和十八烷基三苯基溴化膦。该脂质体是特别针对视网膜黄斑变性光动力医疗设计的一类新型竹红菌素脂质体。该脂质体是用薄膜超声法制备的阳离子脂质体，并包裹了含有三苯基膦(TPP)官能团的十八烷基三苯基溴化膦(STPP)分子，使得其可以实现靶向病灶新生血管内皮，选择性的富集于内皮细胞线粒体的目标。此外，该脂质体的制备工艺简便，稳定性高，生物光动力活性是母体竹红菌素的2倍以上，是非常有潜力的黄斑变性光动力医疗药物。

Description

一种竹红菌素阳离子脂质体制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种竹红菌素阳离子脂质体制剂及其制备方法与应用。
背景技术
视网膜黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)已成为老年人群致盲的常见病之一，它的疾病类型分为干性和湿性黄斑变性，研究表明约90％的黄斑变性致盲患者属于湿性黄斑变性(J.Ambati,B.K.Ambati,S.H.Yoo,S.Lanchulev andA.P.Adamis,Age-related maculardegeneration:etiology,pathogenesis,andtherapeutic strategies,Surv.Ophthalmol.,2003,48,257-293.)。湿性黄斑变性的主要特点是视网膜黄斑区有异常畸生的新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)，光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)已成为湿性黄斑变性的首选疗法之一，相较于其他疗法，它不仅安全、高效，且可反复多次使用，不会产生耐药性。目前临床批准可用的光敏剂仅有该药价格昂贵，且用光动力治疗后，会促使血管内皮增长因子等的表达增加，可能会增加视网膜下新的新生血管的生成，所以该光敏剂的光动力治疗通常需要多个疗程；再者黄斑变性属于浅表性疾病，它的病灶深度浅(<1mm)，的光动力疗法所选取的光疗窗口是红光，红光光照下对组织的穿透深度远大于1mm，这样可能会引发深层正常组织的损伤。
目前，黄斑变性光动力医疗的新型光敏剂主要包括有：二氢卟吩、酞菁和苝醌类等光敏剂。其中，属于苝醌家族的一类光敏剂，竹红菌素，包括竹红菌甲素(Hypocrellin A，简称HA，如式I所示)和竹红菌乙素(Hypocrellin B，简称HB，如式II所示)两种成分，是我国具有特色资源和基础研究优势的一类天然光敏剂，具有诸多理想光敏剂的特点，如光动力活性高、暗毒性低、组织代谢速率快、易于化学修饰等；并且竹红菌素的主吸收峰位于蓝绿光区域，该光照对组织的穿透深度正好与黄斑变性的病灶深度相符，因此竹红菌素有望开发成针对湿性黄斑变性光动力医疗的个性化药物。
然而，竹红菌素为脂溶性分子，为了实现其在体内的药物输送，对其进行化学修饰来改善其亲水性，制备得到的竹红菌素衍生物并不能很好的实现靶向病灶畸生新生血管的目的(J.Q.Zhao,H.Deng,J.Xie,X.Liu,Y.Zhang,N.Y.Huang and Y.Gu,Towardscharacteristics of photodynamic drugs specifically aimed at microvasculardiseases,Mini-Rev.Med.Chem.,2010,10,332-341；H.Deng,X.Liu,J.Xie,R.Yin,N.Y.Huang,Y.Gu and J.Q.Zhao,Quantitative and site-directed chemicalmodification of hypocrellins toward direct dug delivery and effectivephotodynamic activity,J.Med.Chem.,2012,55,1910-1919)。脂质体是将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊，是一类首选的医药运输载体，它具有生物相容性高、靶向性好、药物释放快等优势，但现有的竹红菌素脂质体制剂并不能实现准确靶向新生血管内皮的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种竹红菌素阳离子脂质体制剂及其制备方法与应用，该脂质体制剂可靶向病灶新生血管内皮细胞，并定位于这类细胞的线粒体中，生物光动力活性提高至2倍以上，可作为视网膜黄斑变性光动力医疗的光敏剂。
本发明提供的竹红菌素阳离子脂质体制剂的制备方法，用包括下述组分的原料制备得到竹红菌素阳离子脂质体制剂：竹红菌素、阳离子磷脂、1,2-二油酰基卵磷脂、胆固醇和十八烷基三苯基溴化膦。
上述的制备方法中，所述原料还包括下述组分中的至少一种：冻干保护剂、有机溶剂和缓冲溶液。
上述的制备方法中，所述冻干保护剂可为蔗糖、甘露糖和海藻糖中的至少一种；所述有机溶剂可为二氯甲烷、氯仿、甲醇和乙醇中的至少一种；所述缓冲溶液可为磷酸盐缓冲溶液，pH值可为7.2～7.4，浓度可为0.01M。
上述的制备方法中，所述竹红菌素可为竹红菌甲素或竹红菌乙素；所述阳离子磷脂可1,2-二油酰基-3-三甲胺丙烷甲基氯盐(缩写为DOTPA，英文名称为：1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride salt))、双十八烷基二甲基溴化铵(缩写为DDAB，英文名称为Didecyl-dimethylammonium bromide)和1,2-二棕榈酰基-3-三甲胺丙烷甲基氯盐(缩写为DPTAP，英文名称为1,2-Dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane(chloride salt))中的至少一种。
上述的制备方法中，以重量份数计，所述原料的配比如下：竹红菌素1～5份、阳离子磷脂18～89份、1,2-二油酰基卵磷脂19～97份、胆固醇2～11份、十八烷基三苯基溴化膦0.5～2.5份、冻干保护剂50～150份、3000～7960份的有机溶剂(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、1000～5000份的缓冲溶液(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
以重量份数计，所述原料的配比具体可为下述1)-10)中的任一种：
1)竹红菌素1～5份、阳离子磷脂18～89份、1,2-二油酰基卵磷脂19～97份、胆固醇2.2～11份、十八烷基三苯基溴化膦0.5～2.5份、冻干保护剂50～150份、有机溶剂3000～7960份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液1000～5000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
2)竹红菌素1～3份、阳离子磷脂18～53.4份、1,2-二油酰基卵磷脂19～58.2份、胆固醇2.2～6.6份、十八烷基三苯基溴化膦0.5～1.5份、冻干保护剂50～100份、有机溶剂3000～7960份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液1000～3000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
3)竹红菌素2～4份、阳离子磷脂37～71.2份、1,2-二油酰基卵磷脂37～77.6份、胆固醇4.4～8.8份、十八烷基三苯基溴化膦1～2份、冻干保护剂90～120份、有机溶剂6000～6320份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液2000～4000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
4)竹红菌素3～5份、阳离子磷脂53.4～89份、1,2-二油酰基卵磷脂58.2～97份、胆固醇6.6～11份、十八烷基三苯基溴化膦1.5～2.5份、冻干保护剂100～150份、有机溶剂7900～7960份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液3000～5000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
5)竹红菌素1份、阳离子磷脂18份、1,2-二油酰基卵磷脂19份、胆固醇2.2份、十八烷基三苯基溴化膦0.5份、冻干保护剂50份、有机溶剂3000份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液1000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
6)竹红菌素2份、阳离子磷脂37份、1,2-二油酰基卵磷脂37份、胆固醇4.4份、十八烷基三苯基溴化膦1份、冻干保护剂90份、有机溶剂6000份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液2000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
7)竹红菌素3份、阳离子磷脂53.4份、1,2-二油酰基卵磷脂58.2份、胆固醇6.6份、十八烷基三苯基溴化膦1.5份、冻干保护剂100份、有机溶剂7960份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液3000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
8)竹红菌素4份、阳离子磷脂71.2份、1,2-二油酰基卵磷脂77.6份、胆固醇8.8份、十八烷基三苯基溴化膦2份、冻干保护剂120份、有机溶剂6320份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液4000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
9)竹红菌素5份、阳离子磷脂89份、1,2-二油酰基卵磷脂97份、胆固醇11份、十八烷基三苯基溴化膦2.5份、冻干保护剂150份、有机溶剂7900份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液5000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)；
10)竹红菌素2份、阳离子磷脂35.6份、1,2-二油酰基卵磷脂38.8份、胆固醇4.4份、十八烷基三苯基溴化膦1份、冻干保护剂100份、有机溶剂5300份(每50mg竹红菌素对应100mL的有机溶剂)、缓冲溶液2000份(每50mg的竹红菌素对应50mL的缓冲溶液)。
上述的制备方法中，所述制备的工艺步骤如下：
(1)将竹红菌素、阳离子磷脂、1,2-二油酰基卵磷脂、胆固醇和十八烷基三苯基溴化膦溶于有机溶剂中，减压旋蒸制成薄膜；
(2)在上述步骤(1)制得的薄膜中加入缓冲溶液，经搅拌后得多室脂质体；
(3)超声步骤(2)制得的多室脂质体，得单室脂质体；
(4)采用凝胶层析法除去上述单质脂质体中未包封的十八烷基三苯基溴化膦，加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥即得所述竹红菌素阳离子脂质体制剂。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述减压旋蒸的压力可为4～10mbar，具体可为4～8mbar、8～10mbar、4mbar、8mbar或10mbar；时间为2～4h，具体可为2～3h、3～4h、2h、3h或4h。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述摇床震荡的转速可为200rpm；时间可为4～6h，具体可为4～5h、5～6h、4h、5h或6h。
上述的制备方法，步骤(3)中，所述超声的温度可为0～15℃，具体可为0～10℃、4～15℃、0℃、4℃、10℃或15℃；功率可为80～200W，具体可为80～120W、120～200W、100～150W、80W、100W、120W、150W或200W；时间可为0.5～1h，具体可为0.5～0.75h、75～1h、0.5h、0.75h或1h。
上述的制备方法，步骤(4)中，所述凝胶层析法的步骤如下：将步骤(3)中制得的单室脂质体加入至层析柱中，用洗脱液洗脱，收集红色组分即可除去未包封的十八烷基三苯基溴化膦。
上述的制备方法，步骤(4)中，所述层析柱中的凝胶为葡聚糖凝胶G-15；所述洗脱剂为磷酸盐缓冲溶液。
本发明进一步提供了一种上述的制备方法制备得到的竹红菌素阳离子脂质体制剂。
上述的竹红菌素阳离子脂质体制剂在制备或作为黄斑变性光动力医疗中的光敏剂中的应用；
或，在制备具有血管内皮细胞的线粒体靶向性的黄斑变性光动力医疗中的光敏剂中的应用，也在本发明的保护范围内。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的竹红菌素阳离子脂质体制剂，相较于竹红菌素母体而言，不仅具有较好的生物相容性，可以直接用于静脉注射给药；还能实现靶向病灶新生血管内皮细胞，并定位于这类细胞的线粒体中，生物光动力活性提高至2倍以上，可以说是特别适合视网膜黄斑变性光动力医疗的一类光敏剂。
(2)本发明脂质体制剂制备工艺简便，载药浓度高，且剂型稳定性高，在制备视网膜黄斑变性光动力医疗药物方面有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例中竹红菌素阳离子脂质体的透射电镜图。
图2为竹红菌乙素阳离子脂质体(Cationic LHB)、竹红菌甲素阳离子脂质体(Cationic LHA)和竹红菌乙素(HB)的二甲基亚砜溶液在光敏化充氧的过程中，9,10-二苯基蒽(9,10-DPA)在376nm处的吸收值随光照时间的变化，插图为9,10-DPA在不同时间下的吸收光谱图(从上到下的时间依次为0min、1min、2min、3min、4min和5min)。
图3为竹红菌乙素阳离子脂质体(Cationic LHB)和竹红菌乙素(HB)在RF/6A脉络膜-视网膜血管内皮细胞内分布及线粒体定位情况的研究。第一列是各光敏剂在细胞内分布的红色荧光图；第二列是Mtio-tracker标记线粒体的绿色荧光图像；第三列是第一列和第二列图像的叠加图。
图4为在竹红菌乙素阳离子脂质体(Cationic LHB)和竹红菌乙素(HB)光动力作用介导后，RF/6A细胞的存活率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PBS缓冲溶液(pH＝7.2～7.4，浓度为0.01M)的配方如下：磷酸二氢钾(1.4mM)、磷酸氢二钠(4.3mM)、氯化钠(137mM)以及氯化钾(2.7mM)。
RF/6A猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞购自中国科学院细胞库，目录号为GNO12。
实施例1、制备竹红菌素阳离子脂质体制剂
按照如下步骤制备竹红菌素阳离子脂质体制剂：
(1)将竹红菌乙素50mg、DOTAP 900mg、DOPC 950mg、胆固醇110mg和STPP 25mg溶于100mL(150g)的氯仿中，再置于旋转蒸发仪内，于8mbar压力下旋蒸2小时，制备成薄膜。
(2)在上述步骤(1)制得的薄膜中加入50mL(50g)的PBS溶液，在200rpm条件下震荡摇匀4h成多室脂质体。
(3)将上述步骤(2)制得的多室脂质体置于0℃，超声功率80W条件下超声45min，得粒径分布为57-119nm的单室脂质体。
(4)将上述步骤(3)制得的单室脂质体用Sephadex G-15葡聚糖凝胶进行层析分离(洗脱液：PBS，pH＝7.2～7.4，浓度为0.01M)，除去脂质体中未被包封的STPP，收集红色组分的脂质体；将2.5g蔗糖加入至脂质体中充分溶解，过孔径220nm的滤膜超滤灭菌，分装后冷冻干燥得冻干脂质体粉剂，充氮气避光密封保存，即得所述竹红菌素阳离子脂质体制剂。
实施例2、制备竹红菌素阳离子脂质体制剂
按照如下步骤制备竹红菌素阳离子脂质体制剂：
(1)将竹红菌乙素100mg、DPTAP 1850mg、DOPC 1850mg、胆固醇220mg和STPP 50mg溶于200mL(300g)的氯仿中，再置于旋转蒸发仪内，于10mbar压力下旋蒸3小时，制备成薄膜。
(2)在上述步骤(1)制得的薄膜中加入100mL(100g)的PBS溶液，在200rpm条件下震荡摇匀4h成多室脂质体。
(3)将上述步骤(2)制得的多室脂质体置于4℃，超声功率120W条件下超声0.5h，得粒径分布为55-122nm的单室脂质体。
(4)将上述步骤(3)制得的单室脂质体用Sephadex G-15葡聚糖凝胶进行层析分离(洗脱液：pH＝7.2～7.4，浓度为0.01M)，除去脂质体中未被包封的STPP，收集红色组分的脂质体；将4.5g蔗糖加入至脂质体中充分溶解，过孔径220nm的滤膜超滤灭菌，分装后冷冻干燥得冻干脂质体粉剂，充氮气避光密封保存，即得所述竹红菌素阳离子脂质体制剂。
实施例3、制备竹红菌素阳离子脂质体制剂
按照如下步骤制备竹红菌素阳离子脂质体制剂：
(1)将竹红菌乙素150mg、DDAB2670mg、DOPC 2910mg、胆固醇330mg和STPP 75mg溶于300mL(398g)的二氯甲烷中，再置于旋转蒸发仪内，于10mbar压力下旋蒸4小时，制备成薄膜。
(2)在上述步骤(1)制得的薄膜中加入150mL(150g)的PBS溶液，在200rpm条件下震荡摇匀5h成多室脂质体。
(3)将上述步骤(2)制得的多室脂质体置于15℃，超声功率200w条件下超声1h，得粒径分布为50-120nm的单室脂质体。
(4)将上述制得的单室脂质体用Sephadex G-15葡聚糖凝胶进行层析分离，除去脂质体中未被包封的STPP，收集红色组分的脂质体；将5g海藻糖加入至脂质体中充分溶解，过孔径220nm的滤膜超滤灭菌，分装后冷冻干燥得冻干脂质体粉剂，充氩气避光密封保存，即得所述竹红菌素阳离子脂质体制剂。
实施例4、制备竹红菌素阳离子脂质体制剂
按照如下步骤制备竹红菌素阳离子脂质体制剂：
(1)将竹红菌甲素200mg、DPTAP 3560mg、DOPC 3880mg、胆固醇440mg和STPP 100mg溶于400mL(316g)的甲醇中，再置于旋转蒸发仪内，于4mbar压力下旋蒸2小时，制备成薄膜。
(2)在上述步骤(1)制得的薄膜中加入200mL(200g)的PBS溶液，在200rpm条件下震荡摇匀6h成多室脂质体。
(3)将步骤(2)中制得的多室脂质体置于10℃，超声功率150W条件下超声1h，得粒径分布为65-135nm的单室脂质体。
(4)将步骤(3)制得的单室脂质体用Sephadex G-15葡聚糖凝胶进行层析分离，除去脂质体中未被包封的STPP，收集红色组分的脂质体；将6g甘露糖加入至脂质体中充分溶解，过孔径220nm的滤膜超滤灭菌，分装后冷冻干燥得冻干脂质体粉剂，充氮气避光密封保存。
实施例5、制备竹红菌素阳离子脂质体制剂
按照如下步骤制备竹红菌素阳离子脂质体制剂：
(1)将竹红菌乙素250mg、DOTAP 4450mg、DOPC 4850mg、胆固醇550mg和STPP 125mg溶于500mL(395g)的乙醇中，再置于旋转蒸发仪内，于4mbar压力下旋蒸4小时，制备成薄膜。
(2)在上述步骤(1)制备得到的薄膜中加入250mL(250g)的PBS溶液，在200rpm条件下震荡6h摇匀成多室脂质体。
(3)将上述步骤(2)制得的多室脂质体置于0℃，超声功率100W条件下超声0.5h，得粒径分布为68-150nm的单室脂质体。
(4)将上述步骤(3)制得的单室脂质体用Sephadex G-15葡聚糖凝胶进行层析分离，除去脂质体中未被包封的STPP，收集红色组分的脂质体；将7.5g蔗糖加入至得到的脂质体中充分溶解，过孔径220nm的滤膜超滤灭菌，分装后冷冻干燥得冻干脂质体粉剂，充氩气避光密封保存。
实施例6、制备竹红菌素阳离子脂质体制剂
按照如下步骤制备竹红菌素阳离子脂质体制剂：
(1)将竹红菌甲素100mg、DOTAP 1780mg、DOPC 1940mg、胆固醇220mg和STPP 50mg溶于200mL(265g)的二氯甲烷中，再置于旋转蒸发仪内，于4mbar压力下旋蒸3小时，制备成薄膜。
(2)在上述步骤(1)制得的薄膜中加入100mL(100g)的PBS溶液，在200rpm条件下震荡摇匀4h成多室脂质体。
(3)将步骤(2)制得的多室脂质体置于0℃，超声功率120w条件下超声0.5h，得粒径分布为52-128nm的单室脂质体。
(4)将步骤(3)制得的单室脂质体用Sephadex G-15葡聚糖凝胶进行层析分离，除去脂质体中未被包封的STPP，收集红色组分的脂质体；将5g海藻糖加入至脂质体中充分溶解，过孔径220nm的滤膜超滤灭菌，分装后冷冻干燥得冻干脂质体粉剂，充氮气避光密封保存。
实施例7、竹红菌素阳离子脂质体制剂的效果评价
本实施例分别对上述制备得到的竹红菌素阳离子脂质体制剂的基本性质(粒径大小、形态、多分散系数、Zeta电位和包封率)、光敏化活性和光动力活性进行的测量。
一、竹红菌素阳离子脂质体基本性质测试
(1)用马尔文激光粒度仪Zetasizer Nano ZS90测定上述实施例1-6制备得到的竹红菌素阳离子脂质体的平均粒径、多分散指数(Polydispersity Index，PDI)和Zeta电位，实验结果如表1所示。
(2)采用下述方法对实施例1-实施例6制备得到的竹红菌素阳离子脂质体的包封率进行测定:取1g竹红菌素阳离子脂质体冻干粉剂溶于1mL的PBS缓冲液中(pH＝7.2～7.4，浓度为0.01M)得脂质体溶液。往脂质体溶液中加入1mL石油醚进行萃取，让未被包封的竹红菌素溶于石油醚中。然后将上述PBS缓冲液和石油醚的混合溶液置于离心机中于4000rpm转速下离心分离，取上层悬浮液，将其溶液蒸干得到残余物。接着重复上述萃取离心操作两次，将各次得到的残余物收集溶于10mL氯仿中，测量其吸收值，与竹红菌素的浓度标准曲线(浓度范围为0.5-10μM)对照，即可得未被包封的竹红菌素浓度(E1)。计算公式如下：
E＝(1-E1/E2)×100％(1)；
式(1)中，E表示竹红菌素阳离子脂质体的包封率，E1表示未被包封的竹红菌素浓度，E2表示制备制剂加入的竹红菌素总浓度。
结果如表1所示。
表1、竹红菌素阳离子脂质体粒径、多分散指数和Zeta电位。
由表1可知，本发明制备得到的竹红菌素阳离子脂质体制剂粒径分布窄，多分散系数在0.1附近，Zeta电位值高，包封率大于80％，说明其粒径均一、有良好的分散性且剂型稳定，包封率高，质量可以满足临床用药的基本要求。
(3)竹红菌素阳离子脂质体透射电镜测试
将实施例1-6中制备得到的脂质体样品分别稀释至0.05mg/mL，将其滴与喷碳铜网上，接着用醋酸双氧铀对其进行负染色后晾干，置于透射电镜下(Tecnai G2 20,Hillsboro,USA)观察其形貌和粒径，实施例1制得的竹红菌素阳离子脂质体的投射电镜照片如图1所示，由图1可以观察到该制剂具有典型脂质体圆整的形貌，分布均一，粒径大小分布与实验测量值相符。实施例2-实施例6制备得到的竹红菌素阳离子脂质体的透射电镜照片与图1无实质性差别。
二、单线态氧量子产率测试
竹红菌素阳离子脂质体的单线态氧量子产率采用9,10-DPA漂白法进行测定，具体步骤为：以中压钠灯(450W)为光源，用滤光片取470-800nm的光，以充氧的竹红菌乙素(HB)的二甲基亚砜溶液为参照，将竹红菌素阳离子脂质体与HB在470-800nm的处吸收值调至相等。再往以上两种溶液中加入等量的9,10-DPA，测量9,10-DPA在376nm处的吸收的变化值，其结果如图2所示。
以HB的单线态氧量子产率0.76为标准计算，得到实施例1制备的竹红菌乙素阳离子脂质体(Cationic LHB)、实施例4制备的竹红菌甲素阳离子脂质体(Cationic LHA)的单重态氧量子产率分别为0.71和0.74，二者都保持了优良的光敏化活性。
三、竹红菌素阳离子脂质体制剂在血管内皮细胞内分布实验测试
除了光敏剂的光敏化活性之外，光敏剂的亚细胞定位同样也是影响光动力活性的重要因素之一，本实施例对竹红菌素阳离子脂质体制剂在血管内皮细胞的亚细胞定位情况进行了研究。
测定方法：RF/6A猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞培养至5×104个/mL接种于含10％血清RMPI-1640培养基的培养皿中，培养24h使细胞完全贴壁。接着用不含血清的培养基稀释脂质体和竹红菌乙素(HB)至其浓度为5μM，将光敏剂(实施例1制得的竹红菌素阳离子脂质体)加入至培养皿中，过1.5h后，再将Mito-Tracker线粒体荧光探针(浓度为200nM)加入至上述培养皿中继续孵育0.5h后吸弃皿中培养基，用PBS溶液清洗3次。
将各培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内光敏剂的分布情况，使用488nm激光激发，分别收集绿光(500-550nm)和红光(600-650nm)下的信号，拍照得荧光探针绿光和光敏剂红光下的荧光图像，最后将红绿光荧光图像叠加，结果如图3所示。
荧光探针和光敏剂的混合荧光为黄色，黄色越深说明光敏剂在线粒体的分布值越大，因此由图3可以得出竹红菌乙素阳离子脂质体(Cationic LHB)在细胞内线粒体的定位分布值明显强于竹红菌乙素(HB)，说明本发明竹红菌素阳离子脂质体制剂可以实现靶向靶体血管内皮，并定位于细胞内线粒体的目标。研究表明如果光敏剂大量分布于细胞线粒体中，光动力作用损伤线粒体可以达到快速诱导肿瘤细胞凋亡的目的，进而提高光动力治疗效果(D.J.Granville,B.A.Cassidy,D.O.Ruehlmann,J.C.Choy,C.Brenner,G.Kroemer,C.Van-Breemen,P.Margaron,D.W.Hunt and B.M.McManus,Mitochondrial release ofapoptosis-inducing factor and cytochrome c during smooth muscle cellapoptosis.Am.J.Pathol.,2001,59,305-311；H.Zhao,D.Xing,Q.Chen,New insights ofmitochondria reactive oxygen species generation and cell apoptosis induced bylow dose photodynamic therapy.Eur.J.Cancer,2011,47,2750–2761)，因此，本发明竹红菌素阳离子脂质体制剂具有良好的光动力活性。
四、竹红菌素阳离子脂质体制剂生物光动力活性测试
RF/6A细胞按5×104个/mL接种于96孔板内，过24小时后待细胞都贴壁后，加入不同浓度的竹红菌乙素阳离子脂质体(实施例1)和竹红菌乙素光敏剂，继续孵育细胞4小时，后弃去含光敏剂的培养基，换新的培养基后，将96孔板置于KTP激光(波长为532nm)下照光1000s，照光功率为20mw/cm2。照光后将96孔板置于培养箱孵育24h，接着用MTT法测量各孔在490nm处的光密度值，测量各孔的细胞存活率。
两种光敏剂不同浓度下的细胞存活率结果如图4所示，通过图4可得竹红菌乙素阳离子脂质体(Cationic LHB)和竹红菌乙素(HB)的半数致死浓度分别为71nM和181nM，也就是说同等浓度下，本发明的脂质体的光动力活性是母体HB的2倍多，这应该是归功于该脂质体良好的光敏化活性和比HB高得多的靶体血管内皮细胞线粒体的分布率，说明该脂质体非常有潜力开发成黄斑变性光动力医疗的光敏剂。

Claims (8)

1.一种竹红菌素阳离子脂质体制剂的制备方法，其特征在于：用包括下述组分的原料制备得到竹红菌素阳离子脂质体制剂：竹红菌素、阳离子磷脂、1,2-二油酰基卵磷脂、胆固醇和十八烷基三苯基溴化膦；
所述原料还包括下述组分中的至少一种：冻干保护剂、有机溶剂和缓冲溶液；
以重量份数计，所述原料的配比如下：竹红菌素 1~5份、阳离子磷脂 18~89份、1,2-二油酰基卵磷脂 19~97份、胆固醇 2~11份、十八烷基三苯基溴化膦 0.5~2.5份、冻干保护剂50~150份、有机溶剂3000~7960份、缓冲溶液1000~5000份。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂为蔗糖、甘露糖和海藻糖中的至少一种；所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、甲醇和乙醇中的至少一种；所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.2~7.4，浓度为0.01 M。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述竹红菌素为竹红菌甲素或竹红菌乙素；所述阳离子磷脂为1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基氯盐、双十八烷基二甲基溴化铵和1,2-二棕榈酰基-3-三甲胺丙烷甲基氯盐中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述制备的工艺步骤如下：
（1）将竹红菌素、阳离子磷脂、1,2-二油酰基卵磷脂、胆固醇和十八烷基三苯基溴化膦溶于有机溶剂中，减压旋蒸制成薄膜；
（2）在上述步骤（1）制得的薄膜中加入缓冲溶液，经震荡后得多室脂质体；
（3）超声步骤（2）制得的多室脂质体，得单室脂质体；
（4）采用凝胶层析法除去上述单质脂质体中未包封的十八烷基三苯基溴化膦，加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥即得所述竹红菌素阳离子脂质体制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述减压旋蒸的压力为4~10 mbar，时间为2~4h；步骤（2）中，应用摇床震荡，所述摇床震荡的转速为200 rpm，时间为4~6 h；步骤（3）中，所述超声的温度为0~15℃，功率为80~200W，时间为0.5~1h；步骤（4）中，所述凝胶层析法的步骤如下：将步骤（3）中制得的单室脂质体加入至层析柱中，用洗脱液洗脱，收集红色组分即可除去未包封的十八烷基三苯基溴化膦。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述层析柱中的凝胶为葡聚糖凝胶G-15；所述洗脱液为磷酸盐缓冲溶液。
7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备得到的竹红菌素阳离子脂质体制剂。
8.权利要求7所述的竹红菌素阳离子脂质体制剂在制备黄斑变性光动力医疗中的光敏剂中的应用；
或，在制备具有血管内皮细胞的线粒体靶向性的黄斑变性光动力医疗中的光敏剂中的应用。
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