CN116790509A - 一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用，属于生物医药领域。单克隆杂交瘤细胞株命名为312H‑C3，其已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23018，保藏日期为2021年8月4日。所述杂交瘤细胞株能够稳定分泌特异性识别PRVgB蛋白的单克隆抗体，可用于制备阻断法抗体检测试剂盒，且酶标单抗最佳使用浓度可达1:4000，极大的节省了原材料。基于312H‑C3建立的抗体检测试剂盒操作简易、特异性好、对猪伪狂犬病病毒变异株gB抗体的检测敏感性优于进口试剂盒和国内其他试剂盒，可以更好地评价猪群免疫状况。

Description

一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞 株及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

猪伪狂犬病(Porcine Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(PorcinePseudorabies Virus，PRV)引起的一种急性传染病。哺乳仔猪感染PRV均出现发热及神经症状，死亡率几乎高达100％；妊娠母猪感染PRV可导致出现流产、死胎、产弱仔和木乃伊胎。该病具有高度的传染性，极易通过空气、接触经呼吸道传播，给我国乃至全球养猪业造成了巨大的经济损失。尤其是2011年下半年以来，我国多个免疫Bartha K61株疫苗的猪场频繁暴发猪伪狂犬病，研究表明该疫情是由变异的PRV引起，现有疫苗不能对免疫猪只提供完全的保护。通过对PRV流行株进行全基因组遗传演化分析发现，我国当前的PRV流行株与国外流行株之间存在比较大的差异，国外流行株属于基因Ⅰ型，而国内流行株属于基因Ⅱ型，与国内以往毒株相比在分子水平和抗原性上也存在差异。PRV变异株的出现和流行，给我国预防和控制该病提出了新的任务和挑战。我们不仅要研制针对流行毒株的疫苗，同时也要研制针对新流行毒株的特异性和敏感性更好的诊断试剂。

对猪血清中的PRV抗体进行检测，一方面可以了解猪只免疫状况、合理安排疫苗接种时间，另一方面可以监测野毒感染状况，对该病的防控具有重要意义。糖蛋白gB是PRV的主要免疫原性蛋白之一，无论是弱毒活疫苗或灭活疫苗免疫还是野毒感染，都可以产生针对该蛋白的抗体，因此gB抗体也是伪狂犬病的主要检测抗体之一。

目前市场上检测gB抗体的商品化试剂盒主要是间接或阻断ELISA方法。所使用的包被抗原多为经典毒株(因为猪伪狂犬病病毒变异株2011年下半年才出现)或国外毒株，对现在流行的变异株抗体检测的敏感性欠佳。因此，对猪伪狂犬病病毒变异株进行深入研究，并应用其开发一种对现地流行的变异株抗体检测更为准确敏感的产品是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明的312H-C3杂交瘤细胞株能够稳定分泌特异性识别PRV gB蛋白的单克隆抗体，可用于特异性检测PRV gB蛋白抗体的阻断ELISA方法的建立。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株312H-C3，其已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23018，保藏日期为2021年8月4日。

本发明还提供一种所述的单克隆杂交瘤细胞株312H-C3的构建方法，包括以完整的病毒粒子为免疫原获得免疫小鼠，取所述免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，对融合细胞进行筛选、纯化与鉴定的步骤；

所述病毒粒子为猪伪狂犬病病毒变异株HeN1，所述猪伪狂犬病病毒变异株HeN1的保藏编号为CGMCC No.6656。

本发明还提供一种由所述的单克隆杂交瘤细胞株312H-C3制备的抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白的抗体。

本发明还提供一种所述的杂交瘤细胞株312H-C3或所述的抗体在制备检测猪伪狂犬病病毒的产品中的应用。

本发明还提供一种所述的杂交瘤细胞株312H-C3或所述的抗体在制备检测猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的产品中的应用。

本发明还提供一种所述的杂交瘤细胞株312H-C3或所述的抗体在制备检测猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，包括所述的抗体和由猪伪狂犬病病毒包被的ELISA板；

在ELISA板中，所述猪伪狂犬病病毒为猪伪狂犬病病毒PRVTP株，保藏编号为CGMCCNo.12300。

进一步地，所述抗体由辣根过氧化物酶标记，所述猪伪狂犬病病毒为灭活病毒。

进一步地，还包括封闭液、洗涤液、稀释液、显色液和终止液。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开了分泌抗猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)gB蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株312H-C3、gB抗体阻断ELISA方法的建立与优化、及gB抗体阻断ELISA试剂盒的组装与应用。本发明的312H-C3杂交瘤细胞株能够稳定分泌特异性识别PRV gB蛋白的单克隆抗体，可用于特异性检测PRV gB蛋白抗体的阻断ELISA方法的建立。

本发明的312H-C3杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可以用于制备阻断法抗体检测试剂盒，且酶标单抗最佳使用浓度可达1:4000，极大地节省了原材料。

本发明的312H-C3杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体所识别抗原表位为构象表位，与线性表位相比，构象抗原表位更加稳定，特异性更高。本发明的包被抗原PRVTP株极易大量制备，抗原包被用量少，而且灭活的全病毒蛋白极大的维持了蛋白的天然结构，相比于原核表达蛋白具有更强的抗原性，因此，其对中国流行的猪伪狂犬病病毒变异株感染后的现地血清具有更高的特异性，敏感性。

基于312H-C3建立的抗体检测试剂盒操作简易、特异性好、对猪伪狂犬病病毒变异株gB抗体的检测敏感性优于进口试剂盒和国内其他试剂盒，可以更好地评价猪群免疫状况。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为11株单抗与病毒抗原的反应原性分析，其中1-11为11株单抗，对应编号同表1；12为阴性对照；

图2为PRV阳性血清对11株单抗与病毒抗原结合的阻断效应分析，其中1-11为11株单抗，对应编号同表1；

图3为不同稀释度阳性血清对312H-C3和1E7单抗与病毒结合的阻断效果比较；

图4为312H-C3和1E7两株单抗识别抗原表位是否为线性表位的Western Blot鉴定，其中1代表蛋白Marker，2代表1E7单抗或312H-C3单抗与变性的病毒蛋白的WesternBlot反应；

图5为纯化的单抗SDS-PAGE电泳结果；

图6为阴阳性样品临界值的交互点状图分析；

图7为gB抗体阻断ELISA试验特异性检测结果；

图8为gB抗体阻断ELISA试验敏感性检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

2011年下半年开始，许多使用常规疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病流行的现象，主要表现为母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。本发明团队对送检的组织进行PCR鉴定和病毒分离，证明这些猪场确实存在猪伪狂犬病野毒感染。发明人实验室从河南、黑龙江、辽宁、内蒙等省免疫过猪伪狂犬病活疫苗的猪场分离到多株猪伪狂犬病病毒(PRV)强毒，经gE基因序列比对显示新分离的这些毒株序列同源性高达99.3％以上，与以往分离的毒株相比处于一个相对独立的分支中。对其中6株病毒的细胞培养特性和毒力进行了比较。将6株病毒以相同剂量接种Vero细胞和IBRS2细胞进行培养，在感染后48小时收获并测定病毒滴度，结果显示不同毒株之间病毒毒价差异明显，猪伪狂犬病病毒HeN1株、HeN8株、NM3株毒价较高，均在10^7.5TCID₅₀/mL以上，而其他毒株毒价在10^5.3～10^6.43TCID₅₀/mL之间，但两种细胞繁殖的同一毒株之间的病毒滴度差异不显著。利用BALB/c小鼠对各毒株的毒力比较发现，HeN1株对小鼠的LD₅₀最低，为10^2.38TCID₅₀，而HLJ1株对小鼠的LD50最高，为10^3.32TCID₅₀。综合各株病毒在细胞上的增殖水平和毒力差异，我们选择猪伪狂犬病病毒HeN1株作为猪伪狂犬病病毒新流行株的代表性毒株，进一步利用动物试验证实免疫现地广泛使用的疫苗(Bartha K61株)不能提供对新流行毒株攻击的完全保护。

2013年发明人团队率先在国内(中国预防兽医学报,2013,35(1))、国际(EmergInfect Dis,2013,19(11):1749-55.)杂志上发表文章表明PRV发生变异，引起了国内、外广泛关注。此后，国内其他科研机构也开始关注猪伪狂犬病疫情，猪伪狂犬病病毒(HeN1株)也成为变异株序列分析的参考毒株。2014年，猪伪狂犬病病毒(HeN1株)获得了国家发明专利(微生物保藏编号为CGMCC No.6656，已记载在公开号为CN102994458A，公开日为2014-04-02，发明名称为“猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用”的专利申请中)。

鉴于猪伪狂犬病病毒HeN1株是国内最早分离的变异株的代表性毒株，且该毒株在细胞上的增殖毒价更高，因此本发明选择该毒株作为免疫小鼠的免疫原。另外，其他研究也有选择表达gB蛋白作为免疫原的，但无论是原核表达蛋白还是真核表达蛋白，蛋白的构像都不可能与病毒粒子上天然gB蛋白的构像一致，免疫小鼠后制备的单抗识别的抗原表位在表达蛋白和病毒粒子上的空间结构不一样，从而导致结合的特异性和敏感性也会存在差异。而且，制备单抗的目的主要是为了建立诊断方法，无论是阻断或竞争ELISA方法，都是利用猪血清中的gB抗体(免疫病毒产生)与单抗竞争性结合抗原的能力，如果制备单抗的免疫原也是病毒粒子，那么该单抗与血清中相应的gB抗体竞争结合的抗原位点结构更一致，这样检测的特异性和敏感性更高，这也是本发明中选择完整病毒粒子作为免疫原的重要原因。

实施例1特异性识别PRV gB蛋白且能用于阻断ELISA方法建立的单克隆抗体的制备及鉴定

(1)猪伪狂犬病病毒(HeN1株)的培养及纯化

将猪伪狂犬病病毒变异株(HeN1株)以0.1％的量接种已长成单层的Vero细胞(购自ATCC)，置37℃培养24小时，当90％以上细胞出现病变时收获病毒液。由于gB蛋白位于病毒粒子表面，为脂质双层的囊膜蛋白，极易被破坏，我们选择仅灭活病毒核酸、不破坏抗原结构的β-丙内酯作为灭活剂，病毒液与灭活剂按2000∶1(v/v)的比例混合，置于4℃灭活24小时，置于37℃水浴1小时，终止灭活反应。灭活后的病毒液以4000r/min离心20分钟，取上清，将上清再以26000r/min超速离心2小时，弃上清，用适量PBS重悬沉淀即为纯化的免疫原。

(2)小鼠免疫及细胞融合

对纯化的病毒进行蛋白定量、用弗氏佐剂乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，100μg/只，间隔2周进行加强免疫，共免疫3次。取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)在PEG作用下进行细胞融合，在HAT选择培养基培养10d后进行间接免疫荧光检测。

(3)阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆纯化

利用96孔板中感染猪伪狂犬病病毒变异株HeN1株的Vero细胞作为抗原，取融合后细胞培养上清进行间接免疫荧光试验，筛选出分泌的抗体能与PRV反应的杂交瘤细胞，并通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆纯化。经过3次的有限稀释即可获得纯化的能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。在2013年-2018年间，共筛选到11株能分泌针对PRVHeN1株抗体的杂交瘤细胞(表1)。

(4)单克隆抗体识别蛋白的鉴定

猪伪狂犬病疫苗主要是gE基因缺失疫苗，gB蛋白是其主要的免疫原性蛋白，因此本发明的目标是筛选到分泌抗gE和gB蛋白抗体的杂交瘤细胞，分别用于建立野毒感染的鉴别检测和疫苗免疫效果评价的方法。本发明为了筛选到特异性针对gB或gE蛋白的单抗，分别构建了表达gB和gE蛋白的真核表达质粒，具体方法如下：利用扩增gB基因的特异性引物(上游引物：5’-ATAGGATCCTACCATGCCCGCTGGTGGCGGTC-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物：5’-AGTGAATTCCTAGGGGGCGTCGGGGTC-3’(SEQ ID NO.2))和gE的特异性引物(上游引物：5’-ATGGAATTCGCCACCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物：5’-ATGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC-3’(SEQ ID NO.4))以HeN1株病毒基因组为模板进行PCR扩增，回收2754bp的gB基因片段和1740bp的gE基因片段，分别经BamH I和EcoR I(gB)或EcoR I和XhoI(gE)双酶切后与经同样酶切处理的pcDNA3.1(+)载体(购自Clontech公司)连接，转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确的质粒标记为pcDNA3.1-gB或pcDNA3.1-gE。将质粒纯化后分别转染293T细胞(购买自ATCC)作为抗原，培养的阳性杂交瘤细胞上清作为待检抗体进行间接免疫荧光试验。结果显示，获得的11株单抗中有4株是针对gB蛋白，2株针对gE蛋白，另外5株单抗针对其他蛋白(表1)。

表111株单抗识别的病毒蛋白鉴定结果

(5)单克隆抗体的反应原性鉴定

采用间接ELISA方法对单抗的反应原性进行鉴定。具体方法为：酶标板孔中包被有灭活并纯化后的猪伪狂犬病病毒(HeN1株)抗原，将11株单抗细胞培养上清加入到酶标板孔中，100μL/孔，同时设DMEM为阴性对照，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST300μL重复洗涤4次，拍干。每孔加入羊抗鼠IgG酶标抗体(1∶5000倍稀释)100μL，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL，重复洗涤4次，拍干。每孔加入TMB底物溶液100μL，置37℃显色(避光孵育)10min。每孔加入终止液50μL，轻微震荡混合均匀后，在波长为450nm用酶标仪读取OD_450nm值(应在加入终止液后15min内完成读数)。

结果显示，11株单抗中有9株能与包被在ELISA板上的PRV(HeN1株)病毒抗原发生良好的免疫反应，有2株反应原性较差(图1)。

(6)单克隆抗体与病毒的反应能否被PRV阳性血清阻断

为了筛选到能够建立阻断或竞争ELISA抗体检测方法的单抗，本发明对11株单抗与病毒的结合能否被猪伪狂犬病病毒阳性血清阻断进行了鉴定。酶标板孔中包被有灭活并纯化后的猪伪狂犬病病毒(HeN1株)抗原，猪伪狂犬病病毒阳性血清1：2稀释后加入孔中，100μL/孔，同时设阴性血清作为对照，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL重复洗涤4次，拍干。每孔加入单抗细胞培养上清100μL，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL，重复洗涤4次，拍干。每孔加入羊抗鼠IgG酶标抗体(1∶5000倍稀释)100μL，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μL，重复洗涤4次，拍干。每孔加入TMB底物溶液100μL，置37℃显色(避光孵育)10min。每孔加入终止液50μL，轻微震荡混合均匀后，在波长为450nm用酶标仪读取OD450nm值。结果显示，11株单抗中仅有2株针对gB蛋白的单抗(1E7和312H-C3)与PRV病毒的结合可以被猪伪狂犬病阳性血清所阻断(图2)。

将猪伪狂犬病阳性血清(同时设阴性血清作为对照)进行2倍倍比稀释后，按照上述阻断ELISA流程进一步对2株单抗的阻断效应进行了比较。结果显示：不同稀释度的阴性血清对2株单抗与PRV抗原结合没有明显影响(OD值均在1.35左右)，阳性血清随着血清稀释度的增加，血清中PRV特异性抗体水平下降，对单抗与PRV抗原结合的阻断效果下降，说明阳性血清对单抗的阻断效应是特异性的，同时可以看出随着阳性血清稀释度的增加对312H-C3株单抗的阻断效果比对1E7效果更好，这预示着选择312H-C3株单抗建立阻断或竞争ELISA方法对阳性血清的检测敏感性更高(图3)。

单克隆杂交瘤细胞株312H-C3已于2021年8月4日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.23018。

(7)两株抗gB蛋白单抗(1E7株和312H-C3株)识别的抗原表位的鉴定

为了鉴定两株单抗识别的B细胞抗原表位，首先我们对猪伪狂犬病病毒全病毒蛋白(HeN1株)进行线性化处理，通过Western Blot来鉴定两株单抗识别的抗原表位是否为线性表位，进一步利用大肠杆菌表达系统逐步表达截短的gB蛋白以确定单抗所识别的最短抗原表位。结果显示312H-C3不能与线性化处理的全病毒蛋白反应，即所识别的抗原表位为构象表位；1E7则能够与线性化处理的全病毒蛋白反应(图4)，且进一步地研究发现其所识别的最短抗原表位为⁸¹SAEESLE⁸⁷。相比于线性表位而言，由于构象抗原表位特殊且不寻常的分子形状，使其在免疫系统中很容易被识别并引起免疫反应，其产生的抗体在血清中含量更高，即猪只在免疫后更容易产生这类抗体，因此，即使对阳性血清高倍稀释，312H-C3依然能表现出优异的阻断效果。此外。由于构象抗原表位是蛋白在三维结构上的特定立体构型，在与抗体或受体的结合过程中具有极强特异性，因此，选用全病毒蛋白作为包被抗原同时配合312H-C3所建立的阻断ELISA具有极强的特异性。

实施例2单克隆抗体312H-C3的纯化与标记

312H-C3单抗腹水的制备：取6～8周龄BALB/C小鼠，均腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只，接种7天后，每只小鼠腹腔注射5×10⁵个生长良好的312H-C3杂交瘤细胞。接种一周后，待小鼠腹腔有明显膨大时抽取腹腔积液，以5000r/min离心10分钟，取上清，-70℃保存备用。

312H-C3单抗的纯化：将制备的312H-C3单抗的腹水1mL置室温(15～25℃)溶解后，以10000r/min离心10分钟，弃去上层油脂及管底沉淀，取上清。腹水上清与bindingbuffer1:10混合后，用0.45μm滤膜过滤。将装有10mLBinding Buffer的注射器与HiTrap proteinG柱子连接，打开柱子底部盖子，推动注射器，使Binding Buffer流经柱子，流速1mL/min。注射器吸入样品，使样品流经柱子，流速为0.2～1mL/min。用10mL Binding Buffer洗脱未结合的样品。在收集管中加60μL 1MTris-HCl。用1mL Elution Buffer洗脱结合在柱子上的单克隆抗体，收集滤液至收集管，置-70℃保存。对纯化后的单克隆抗体进行蛋白浓度测定，结果表明，蛋白浓度为4.638mg/mL，纯化的单克隆抗体经SDS-PAGE电泳，出现两条特异性条带，其中重链约55kDa，轻链约25kDa，纯度为90％(图5)。

单克隆抗体312H-C3的辣根过氧化物酶(HRP)标记：称取5mg HRP，溶于0.5mL0.06M醋酸盐缓冲溶液(pH5.6)中，加入新鲜配制的0.5mLNaIO₄溶液混匀，置4℃作用25min。加入0.5mL乙二醇(0.16mol/L)，室温(25℃)避光静置30分钟。将活化的酶溶液与1.5mg纯化312H-C3株单克隆抗体混合均匀，调节pH值至9.0左右，转入透析袋中，用现配的碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.5)缓缓搅拌透析16小时，分别在透析2小时、4小时和12小时时换液。取出透析液后，加入0.2mLNaBH₄溶液(5mg/mL)，混匀后，置4℃放置2小时。在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，置4℃，以3000r/min离心30min(离心机预冷4℃)，去上清，沉淀以1mLPBS(0.02mol/L，pH值7.4)液溶解，装入透析袋，以PBS(0.02mol/L，pH值7.4)液体在4℃透析除盐过夜，分别在透析2小时、4小时和12小时时换液。次日取出离心，10000rpm离心30分钟以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，将标记抗体移入新的离心管，加入甘油冻存。将酶标抗体倍比稀释后，利用包被有猪伪狂犬病病毒(HeN1株)的ELISA板对标记的单抗进行效价测定，P/N比值大于2.1的最大稀释度为其ELISA效价(P/N＝被检样品OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值)。结果显示，标记的抗体ELISA效价可达16000倍(表2)。

表2酶标抗体效价测定结果

实施例3猪伪狂犬病gB抗体阻断ELISA方法的建立

1.PRVgB抗体阻断ELISA方法的建立

(1)抗原包被：以纯化灭活的猪伪狂犬病病毒(TP株，其微生物保藏编号为CGMCCNO.12300，专利号ZL201610629865.3)包被ELISA板，500ng/孔，4℃过夜；

(2)封闭：取出包被好的ELISA板，PBST洗涤4次，拍干；加入200μL/孔1％BSA封闭液，置37℃恒温培养箱孵育1.5h；PBST洗涤4次，拍干；

(3)待检血清孵育：将待检血清与稀释液1:1混合后加入ELISA板，每孔加入100μL，同时设阳性血清和阴性血清做对照，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤4次，拍干；

(4)酶标单抗孵育：将HRP标记的312H-C3用PBST做4000倍稀释，每孔加入100μL，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤4次，拍干；

(5)底物显色：加入底物TMB进行显色，每孔加入100μL，置37℃恒温培养箱避光作用10min；

(7)终止反应：每孔加入50μL 2M H₂SO₄进行终止，酶标仪450nm处测量吸光度A值；

(8)计算S/N值：S/N＝待检血清OD_450nm值/阴性对照OD_450nm值。

按照上述优化好的反应条件，检测181份已知PRV抗体阴性的猪血清和219份已知PRV抗体阳性的猪血清，用Medcalcv15.8软件进行分析，结果显示，当敏感性为99.1％、特异性为97.8％时，其最佳的cut-off值为0.6(图6)。因此，阻断ELISA检测结果的判定标准为：当S/N值≤0.6时判定为gB抗体阳性，当S/N值>0.6时判定为gB抗体阴性。

2.PRV gB抗体阻断ELISA方法的特异性、敏感性、重复性以及与商品化试剂盒的比较

2.1特异性试验

按照优化的阻断ELISA方法，对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒(PCV2)的特异性血清(上述特异性血清均为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备和保存)进行检测，根据临界值判定阴阳性，评估本方法的特异性。结果显示仅PRV特异性血清检测结果为阳性，其他病毒阳性血清检测结果的S/N值均高于临界值(图7)，表明本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性。

2.2敏感性试验

5份猪伪狂犬病病毒变异株活疫苗(PRVTP株，该疫苗尚处于新兽药注册阶段，为哈尔滨维科生物技术有限公司中间试制产品。PRVTP株保藏编号为CGMCC No.12300，专利授权公告号CN 106282128 B，公告日2019-05-14，专利名称：一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用)免疫后采集的猪血清，2倍倍比(1:2～1:2048)稀释后按照优化的阻断ELISA方法进行检测，根据临界值判定阴阳性，并分别与国内外两个公司产品(A：猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒(阻断ELISA)，购自IDEXX公司；B：猪伪狂犬病毒gB竞争ELISA抗体检测试剂盒，购自莱普生公司)的检测结果进行比较，评估本方法的敏感性。结果显示对这5份血清本试剂盒的检测敏感性比国外A公司和国内B公司试剂盒高2～8倍(图8)。分析引起该差异的主要原因在于，本试剂盒的包被抗原是在猪伪狂犬病病毒变异株(HeN1株)基础上致弱的病毒(TP株)，检测抗体312H-C3单抗也是通过免疫猪伪狂犬病病毒变异株(HeN1株)的全病毒而非表达蛋白制备的，且312H-C3单抗识别的是构像性表位其能更好地刺激机体产生抗体，因此本试剂盒在检测变异株疫苗免疫后产生的抗体时具有更好的敏感性。

2.3重复性试验

包被3批次ELISA板，从每批次板中随机各取3块板，对5份血清进行检测，对结果进行统计学分析，评估本方法的批内及批间重复性。结果显示批内和批间重复性的变异系数均小于4％，表明本发明建立的方法具有良好的重复性(表3)。

表3批内和批间重复性试验结果

实施例4猪伪狂犬病gB抗体阻断ELISA检测试剂盒组装与应用

1.猪伪狂犬病gB抗体阻断ELISA检测试剂盒原理

猪伪狂犬病gB抗体阻断ELISA试剂盒的基本原理是酶标单抗与被检血清竞争性结合微孔板中的PRV抗原，根据单抗与抗原的结合率确定血清中是否存在PRV抗体。试验中被检血清两倍稀释后使用，血清和酶标单抗与抗原的反应分两步进行，整个试验过程在PRV抗原包被的微孔中完成。在第一次的孵育阶段，被检血清中的PRV抗体与塑料板孔内的抗原反应。洗涤后，酶标单抗加到微孔板中，并在第二次孵育中竞争结合病毒抗原。如果被检血清中没有PRV gB抗体，酶标抗体与抗原自由反应。相反，如果被检血清中存在PRV gB抗体，则酶标单克隆抗体与抗原的反应被阻断。孵育后，未反应的酶标抗体被洗去，加入底物/显色剂溶液。在酶的存在下，底物转变为一种能与显色剂反应产生黄色的物质。使用分光光度计测量450nm下的吸收值A(450)。被检样品的A(450)值除以阴性对照的平均A(450)值，计算得出样品/阴性值(S/N)。样品中PRV抗体的含量与其A(450)S/N值成反比。如果存在PRV gB抗体，表明以前曾感染PRV野毒株或应用过普通的弱毒疫苗、灭活疫苗或应用过gE缺失疫苗。

2.试剂盒主要成分与含量

试剂盒主要成分与含量见表4。

表4主要成分与含量

3.储存

所有试剂储存于2-8℃条件下，有效期为12个月。

4.用法

4.1使用方法

(1)试剂的准备用前将所有的试剂和样品恢复至(20～25℃)，试剂应轻轻地旋转或震荡子以混合。

(2)洗涤液的配制取1份10倍浓缩洗涤液加入到9份双蒸水中，混匀。

配制好的洗涤液，应在3日内用完。

4.2ELISA操作步骤

(1)待检血清处理取样品稀释板，每孔加入样品稀释液60μL，随即加入待检血清60μL，混合均匀。

(2)加样根据样品数量，取可拆卸包被板，每孔加入稀释好的待检血清

100μL。同时设阳性对照血清和阴性对照血清各2孔(阴阳性对照无需稀释)。

(3)孵育置于37℃孵育30分钟。

(4)洗涤弃去孔中液体，每孔加入洗涤液300μL，洗涤4次，拍干。

(5)加入酶标单抗每孔加入酶标单抗100μL。

(6)孵育置于37℃孵育30分钟。

(7)洗涤方法同(4)。

(8)显色每孔加入底物溶液，100μL/孔，置37℃避光孵育10分钟。

(9)终止每孔加入终止液(2mol/L硫酸溶液)50μL，轻微震荡混合均匀后，在波长为450nm下读取OD_450nm值(应在加入终止液后5分钟内完成读数)。

(10)计算按下式计算SN值。

S/N＝待检血清OD_450nm值/阴性对照平均OD_450nm值

4.3判定

(1)试验成立的条件阴性对照血清平均OD_450nm值在0.8～1.7之间，阳性对照平均S/N值≤0.4，则判为试验成立。

(2)判定待检血清样品S/N值≤0.6时，判为阳性；S/N值＞0.6时，判为阴性。

4.5注意事项

(1)试剂盒应在2～8℃运输及保存。

(2)贮藏时，所有的板条一定要用封口膜密封，防止潮气对包被板的损伤。否则，不得使用。

(3)不要使底物溶液接触强光和氧化物。所有试剂取出后，均不得再加回瓶中。

(4)仔细阅读说明书，不要使用过期的组分或者不同批次试剂混合使用。

(5)稀释10倍浓缩洗涤液时，如发现结晶，置37℃使其溶解后再使用。

(7)注意加样和洗涤过程，应确保试验的准确度，严禁用嘴吸液。

(8)待检血清发生腐败时勿用于检测。

(9)检验用器皿必须清洁，操作过程避免与金属类器物接触。

(10)应严格按照试剂盒说明书进行操作，严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。

(11)操作过程中使用手套，终止液是硫酸，具有腐蚀性，使用时要小心。

所有废液和废物要进行无害化处理。

4.6临床样品的检测

按照已优化的阻断ELISA方法，检测已知的492份血清，与IDEXX抗体检测试剂盒的检测结果对比。本方法检测结果为304份阳性血清，182份阴性血清，本试验建立的阻断ELISA方法与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为98.78％(表5)。

表5本方法与IDEXX试剂盒检测临床样本的符合率

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株312H-C3，其特征在于，其已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23018，保藏日期为2021年8月4日。

2.一种如权利要求1所述的单克隆杂交瘤细胞株312H-C3的构建方法，其特征在于，包括以完整的病毒粒子为免疫原获得免疫小鼠，取所述免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，对融合细胞进行筛选、纯化与鉴定的步骤；

所述病毒粒子为猪伪狂犬病病毒变异株HeN1，所述猪伪狂犬病病毒变异株HeN1的保藏编号为CGMCCNo.6656。

3.一种由权利要求1所述的单克隆杂交瘤细胞株312H-C3制备的抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白的抗体。

4.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株312H-C3或如权利要求3所述的抗体在制备检测猪伪狂犬病病毒的产品中的应用。

5.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株312H-C3或如权利要求3所述的抗体在制备检测猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的产品中的应用。

6.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株312H-C3或如权利要求3所述的抗体在制备检测猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒中的应用。

7.一种检测猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的抗体和由猪伪狂犬病病毒包被的ELISA板；

在ELISA板中，所述猪伪狂犬病病毒为猪伪狂犬病病毒PRVTP株，保藏编号为CGMCCNo.12300。

8.根据权利要求6所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述抗体由辣根过氧化物酶标记，所述猪伪狂犬病病毒为灭活病毒。

9.根据权利要求6所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，还包括封闭液、洗涤液、稀释液、显色液和终止液。