CN116789799A - 一种重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)及其肝/肺纤维化制药应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组疫苗PfTrx‑HMGB117(95‑111)及其肝/肺纤维化制药应用。本发明通过将HMGB1的抗原表位(aa 95‑111,PKRPPSAFFLFCSEYRP)插入PfTrx的原核表达质粒pET28‑PfTrx，构建重组疫苗PfTrx‑HMGB117(95‑111)。重组疫苗免疫小鼠后，可使小鼠产生高效价的抗HMGB1中和性抗体，减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化及博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化。除此之外，本发明的PfTrx‑HMGB117(95‑111)疫苗具有良好的免疫原性，免疫抗体能特异性地阻断HMGB1与TLR4结合并阻断其介导的生物学作用，还可被用作HMGB1功能研究的工具。
Description
技术领域
本发明属于肝/肺纤维化治疗药物技术领域，涉及一种用于治疗肝、肺纤维化的高迁移率族蛋白B1重组疫苗及其应用，具体涉及一种用于治疗肝/肺纤维化的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)及其应用。
背景技术
纤维化可发生于多种器官，主要病理改变为各种原因引起组织中实质细胞损伤，伴随纤维结缔组织异常增多，最终导致器官结构破坏和功能减退甚至衰竭，严重威胁人类健康和生命。其中，肝纤维化较为常见，尚无特效药物，主要治疗措施是延缓肝纤维化的发生发展，防止其进展为肝硬化。同时肺纤维化的发病率近年来也不断上升，而吡非尼酮及尼达尼布作为治疗特发性肺纤维化(IPF)的新药具有一定效果，但价格相对较高，故探索安全有效的抗肝肺纤维化治疗方法至关重要。
高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)由215个氨基酸残基组成，分子量约25kDa，几乎存在于所有真核生物细胞内，广泛分布于淋巴组织、脑、肺、肝脏等组织中。HMGB1由A-Box(aa 7-79)，B-Box(aa 89-162)，C-tail(aa 186-215)三个结构域组成，其中B-box是HMGB1发挥促炎作用的活性区域，而A-box具有拮抗HMGB1促炎的作用。Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是HMGB1的主要受体之一，TLR4是目前研究最多的TLR，HMGB1与TLR4结合后，激活细胞内的信号转导，活化募髓样分化因子88(myeloiddifferentiation factor 88,MyD88)，进而激活NF-κB，或激活MAPK等途径，参与炎症反应和进一步的免疫调节。
越来越多的研究结果表明，HMGB1-TLR4途径与纤维化疾病如肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化、囊性纤维化等发生发展密切相关。而HMGB1作为纤维化的一个治疗靶标也已受到关注，阻止HMGB1释放、中和HMGB1及阻断HMGB1介导的致炎通路被认为及被实验研究证实可能会作为抗炎的有效手段，但临床试验尚未见研究，还存在诸多问题的待发现和解决，如HMGB1拮抗剂的副作用、安全性及实用性等。
抗细胞因子疫苗是通过主动免疫的方式，刺激机体产生针对自身细胞因子的抗体，从而阻断病理状态的细胞因子活性。现有的细胞因子疫苗在动物实验中研究很多，包括抗IL-1β疫苗用于治疗糖尿病和关节炎、抗IL-27疫苗治疗关节炎等，初步治疗效果可靠。因此，丰富能够治疗肝肺纤维化的重组疫苗也是本领域重点研究的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)及其肝/肺纤维化制药应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)，将HMGB1的抗原表位aa第95至111的氨基酸插入到原核表达质粒中，获得重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)；其中，所述HMGB1的抗原表位aa第95至111的氨基酸的序列如SEQ.ID.NO.1所示。
优选地，所述原核表达质粒为PfTrx的原核表达质粒pET28-PfTrx。
本发明还公开了上述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)在制备抗肝纤维化的药物中的应用。
优选地，所述的药物为降低肝组织中α-SMA、Col1a2、Col3a1、CTGF、TGF-β1、PDGF-B、vimentin和PAI-1表达水平的药物。
优选地，所述的药物为抑制肝组织内成纤维细胞的活化、减少胶原的合成与分泌、减少组织细胞外基质沉积的药物。
本发明还公开了上述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)在制备抗肺纤维化的药物中的应用。
优选地，所述的药物为降低肺组织中α-SMA、Col1a2、Col3a1、CTGF、TGF-β1、PDGF-B、vimentin和PAI-1表达水平的药物。
优选地，所述的药物为抑制肺组织内成纤维细胞的活化、减少胶原的合成与分泌的药物。
优选地，所述的药物为减少组织细胞外基质沉积的药物。
本发明还公开了上述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)在制备抗HMGB1中和性抗体中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种用于治疗肝/肺纤维化的HMGB1重组疫苗，通过将HMGB1的抗原表位(aa 95-111,PKRPPSAFFLFCSEYRP)插入PfTrx的原核表达质粒pET28-PfTrx，构建重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)。重组疫苗分别免疫小鼠后，可使小鼠产生高效价的抗HMGB1中和性抗体。本发明的PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗具有良好的免疫原性，免疫抗体能特异性地阻断HMGB1与TLR4结合并阻断其介导的生物学作用，可被用作HMGB1功能研究的工具。
经PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗免疫小鼠后造模，可以明显减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化及博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化。进一步的研究中我们证实HMGB1重组疫苗免疫可以明显减少肝肺组织细胞外基质的沉积，抑制小鼠肝肺内的成纤维细胞的活化，减少胶原的合成与分泌，进而发挥抗纤维化作用。另外，免疫后小鼠体内的α-SMA、Col1a2、Col3a1、CTGF、TGF-β1、PDGF-B、vimentin、PAI-1的水平也明显下降，这极有利于减缓纤维化的进程。结果表明，PfTrx-HMGB117(95-111)重组疫苗可以成功抑制CCl4诱导的实验性肝纤维化及BLM诱导的小鼠肺纤维化。因此，PfTrx-HMGB117(95-111)重组疫苗有望被开发为治疗肝肺纤维化的有效手段。
附图说明
图1为PfTrx-HMGB117(95-111)表达及纯化电泳图；
图2分别为PfTrx、PfTrx-HMGB117(95-111)免疫小鼠后的抗体滴度图；其中(a)为PfTrx；(b)为PfTrx-HMGB117(95-111)；
图3为验证PfTrx-HMGB117(95-111)免疫抗体特异性的western blot图；
图4为PfTrx-HMGB117(95-111)免疫抗体特异性阻断HMGB1与TLR4结合的直方图；其中(a)为OD450 nm吸光度下读数；(b)为计算的抑制率；
图5为验证PfTrx-HMGB117(95-111)免疫抗体中和活性的直方图；其中，(a)为TNF-αmRNA结果；(b)为IL-1β表达水平；
图6为疫苗免疫及肝纤维化造模流程图；
图7为小鼠肝脏形态图；
图8为小鼠肝组织天狼星红染色图；
图9为小鼠肝组织羟脯氨酸含量测定分析图；
图10为小鼠血清ALT、AST水平图；其中，(a)为ALT；(b)为AST；
图11为小鼠肝组织中α-SMA表达的免疫组化染色图；
图12为western blot法检测小鼠肝组织中α-SMA的表达水平图；
图13为qRT-PCR法检测肝组织α-SMA(a)、Col1a2(b)、Col3a1(c)、TGF-β1(d)、CTGF(e)、PDGF-B(f)、PAI-1(g)和vimentin mRNA(h)水平图；
图14为qRT-PCR法检测体外培养的LX2细胞中α-SMA、Col1a2、TGF-β1、CTGF、vimentin、PAI-1的mRNA水平图；
图15(a)为小鼠肺组织天狼星红染色图，(b)为Masson染色。
图16为小鼠肺组织羟脯氨酸总量测定分析图；
图17为小鼠肺组织α-SMA表达的免疫组化染色图；
图18为western blot法检测小鼠肺组织中α-SMA的表达水平图；
图19为qRT-PCR法检测肺组织α-SMA(a)、Col1a2(b)、Col3a1(c)、TGF-β1(d)、CTGF(e)和PAI-1(f)的mRNA水平图；
图20为qRT-PCR法检测体外培养的原代肺成纤维细胞α-SMA、Col1a2、Col3a1、TGF-β1、CTGF、PAI-1的mRNA水平图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
1、PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗的制备
(1)pET28-PfTrx的载体构建
参照国家发明专利《用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用，专利号：ZL 2018 1 0214405.3》
(2)HMGB117(95-111)抗原表位的选择
针对HMGB1与TLR4作用的位点，设计了17个氨基酸的短肽，即PKRPPSAFFLFCSEYRP(aa 95-111)，标记为HMGB117(95-111)，如SEQ.ID.NO.1所示。
(3)pET28-PfTrx-HMGB117(95-111)原核表达载体的构建及表达纯化
采用PCR技术以正常人基因组cDNA为模板，扩增HMGB117(95-111)编码序列，引物序列如下：
HMGB1 95-111F:5’-CCCTGCAGGGCCCAAGAGGCCTCCTTCG-3’(斜体为Pst I酶切位点)
HMGB1 95-111R:5’-CCGGATCCTGGGCGATACTCAGAGCAG-3’(斜体为BamH I酶切位点)
具体做法参照博士学位论文《李倩，抗HMGB1疫苗阻断HMGB1-TLR4途径减轻博来霉素诱导的肺组织炎症及纤维化，陕西：西安交通大学，2020》
结果分析见图1，细菌裂解上清及Ni-NTA纯化洗脱产物经12％ SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色分析，可见pET28-PfTrx在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约15kDa的重组蛋白PfTrx条带，而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带；经Ni-NTA系统纯化后可见约15kDa的重组蛋白PfTrx纯化条带。pET28-PfTrx-HMGB117(95-111)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约17kDa的重组蛋白PfTrx-HMGB117(95-111)条带，而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带；经Ni-NTA系统非变性条件下纯化后可见约17kDa的重组蛋白PfTrx-HMGB117(95-111)纯化条带。
2、PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗的免疫原性验证
(1)将重组蛋白分别免疫ICR小鼠，50μg/只，每2周免疫一次，共免疫4次。
(2)抗体滴度检测
原核表达纯化的重组人HMGB1(rhHMGB1)按100ng/孔包被于96孔酶标板，4℃过夜，次日以10％牛血清进行封闭。采用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清抗体滴度。
结果显示：PfTrx-HMGB117(95-111)免疫小鼠后，ELISA法检测小鼠抗体滴度(rhHMGB1包被)，表明小鼠免疫后可以产生高效价抗HMGB1抗体(表1)。PfTrx免疫后取小鼠尾血清，用PfTrx包被的酶标板检测表明小鼠产生高效价抗PfTrx抗体(表2)。抗体滴度以log10表示，参见图2。
表1 PfTrx-HMGB117(95-111)免疫抗体滴度
表2 PfTrx免疫抗体滴度
(3)抗体特异性检测
Western blot法验证PfTrx-HMGB117(95-111)免疫后是否含有能特异性识别rhHMGB1的抗HMGB1抗体。
结果显示，以rhHMGB1为抗原，一抗为PBS、PfTrx纯化多抗(1:500)时，均未见HMGB1蛋白条带；而一抗为PfTrx-HMGB117(95-111)免疫抗体(1:500)时，可见明确的HMGB1蛋白条带(参见图3)。证实PfTrx-HMGB117(95-111)多抗中含有抗HMGB1特异性抗体。
(4)验证PfTrx-HMGB117(95-111)免疫抗体与TLR4特异性结合的能力
具体做法参照博士学位论文《李倩，抗HMGB1疫苗阻断HMGB1-TLR4途径减轻博来霉素诱导的肺组织炎症及纤维化，陕西：西安交通大学，2020》
a)取包被好的TLR4板条(human TLR4/CD284 Protein，包被浓度：50ng/孔)，PBST洗涤并拍干。
b)加入rhHMGB1-HRP(1:10000，2％人血清白蛋白/PBST稀释)以及不同浓度的anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体(0.00、0.04、0.20、1.00、5.00μg/mL)，37℃孵育1h。anti-HBcΔ抗体与未免疫小鼠IgG(anti-NC抗体)作为对照(5.00μg/mL)。
c)PBST洗板5次，每次洗完均拍干。
d)加入显色液，OD450 nm吸光度下读数。
e)根据OD值，绘制抗体结合直方图，同时计算抑制率并绘图。
结果可见：以TLR4包板，rhHMGB1-HRP可以特异性的结合TLR4并显色，rhHMGB1-HRP与anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体共同孵育后加入TLR4包被的板条中，anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体可以结合HMGB1，进而阻止HMGB1与TLR4的结合，随anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体浓度的增加，抑制HMGB1与TLR4结合的能力越强，anti-PfTrx抗体及未免疫小鼠IgG(anti-NC抗体)无明显作用，如图4所示，图4中(a)为OD450 nm吸光度下读数，(b)为计算的抑制率)。
(5)抗体中和活性验证
培养THP-1细胞，分组如下：
空白对照组：RPMI1640完全培养基培养；
HMGB1：培养基中加rhHMGB1至终浓度为100ng/mL；
HMGB1+anti-PfTrx抗体组：rhHMGB1终浓度100ng/mL及PfTrx免疫后纯化抗体25μg/mL；
HMGB1+anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体组：rhHMGB1终浓度100ng/mL及不同浓度PfTrx-HMGB117(95-111)免疫纯化抗体(1,5,25,125μg/mL)。
培养24h后，qRT-PCR法测THP-1细胞TNF-α及IL-1β基因表达水平。结果证实HMGB1可以刺激THP-1细胞表达TNF-α及IL-1β，免疫纯化所得的anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体可以中和HMGB1的生物学活性，如图5，(a)为TNF-αmRNA结果，(b)为IL-1β表达水平。注：**P<0.01与空白对照组、HMGB1、HMGB1+anti-PfTrx抗体组相比。
3、PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗抑制CCl4诱导的实验性小鼠肝纤维化
(1)免疫并监测小鼠抗体滴度
40只6周龄ICR雄鼠均分为正常组、CCl4组、PfTrx/CCl4组、PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4四个组。免疫剂量及方法同第2节所述；
(2)CCl4制备小鼠肝纤维化模型
参照国家发明专利《用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用，专利号：ZL 2015 1 0075963.2》，造模流程参见图6。
(3)评价小鼠肝纤维化程度
1)肝脏形态
肉眼观察正常小鼠肝脏呈暗红色，边缘锐利，表面光滑，而CCl4造模后的小鼠肝脏体积增大，边缘圆钝，表面不光滑，出现大量弥散分布的小结节。PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组的小鼠肝脏边缘稍锐利，表面不光滑，但出现的小结节明显小于造模组，而PfTrx/CCl4组小鼠肝脏的大体形态与造模组无明显差异(图7)。
2)天狼星红染色
如图8，正常组小鼠肝组织未见明显胶原着色，而PfTrx/CCl4组与CCl4组的小鼠肝组织胶原着色范围大，将肝组织分割成假小叶，PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组小鼠肝组织胶原面积较PfTrx/CCl4组与CCl4组少(标尺：200μm)。
3)肝组织羟脯氨酸含量测定。
结果显示，CCl4组、PfTrx/CCl4组小鼠肝脏的羟脯氨酸含量明显高于正常组，PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组小鼠肝脏的羟脯氨酸含量明显低于对照免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(参见图9)。
4)小鼠血清AST及ALT水平测定。
结果显示，CCl4组、PfTrx/CCl4组小鼠血清ALT、AST水平明显高于正常组，PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组小鼠血清ALT、AST含量明显低于对照免疫组与模型组(参见图10)。
4、PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗抑制肝星状细胞(HSC)活化
1)免疫组化检测肝组织α-SMA表达情况
结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组肝脏的α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx/CCl4组与CCl4组，参见图11(标尺：400μm)。
2)Western blot法检测α-SMA表达情况
结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组肝组织α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx/CCl4组与CCl4组(图12)。
3)qRT-PCR法检测α-SMA、Col1a2、Col3a1、TGF-β1、CTGF、PDGF-B、vimentin、PAI-1mRNA水平
结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)/CCl4组肝组织中α-SMA、Col1a2、Col3a1、TGF-β1、CTGF、PDGF-B、vimentin、PAI-1mRNA表达水平较PfTrx/CCl4组、CCl4组明显降低(如图13)。引物序列参照国家发明专利《用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用，专利号：ZL 2018 1 0214405.3》
4)细胞学实验
培养LX2细胞(人肝星状细胞)，细胞分组方法：
空白对照组：DMEM完全培养基培养；
HMGB1组：培养基中加rhHMGB1至终浓度为1μg/mL；
HMGB1+anti-PfTrx抗体组：培养基中加rhHMGB1至终浓度为1μg/mL及anti-PfTrx抗体(10μg/mL)；
HMGB1+anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体组：培养基中加rhHMGB1至终浓度为1μg/mL及anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体(10μg/mL)。
按上述分组方法分别对每组细胞进行干预；24小时后，收获各组细胞RNA，qRT-PCR法检测α-SMA、Col1a2、CTGF、TGF-β1、vimentin、PAI-1的mRNA表达水平。
结果显示，HMGB1+anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体组α-SMA、Col1a2、CTGF、TGF-β1、vimentin、PAI-1表达水平明显低于HMGB1组、HMGB1+anti-PfTrx抗体组，且差异具有统计学意义(参见图14，**P<0.01,vs NC；&P<0.05,&&P<0.01,vs HMGB1、HMGB1+anti-PfTrx IgG)。
5、PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗抑制小鼠肺纤维化
(1)72只6周龄ICR雄鼠均分为正常组、BLM组、PfTrx/BLM组、PfTrx-HMGB117(95-111)/BLM四个组。免疫剂量及方法同第2节所述。
(2)肺纤维化模型制备及标本采集
BLM肺纤维化造模方法参照国家发明专利《用于治疗肺纤维化的白细胞介素1β重组疫苗及其应用，专利号：ZL 2018 1 0214405.3》，分别于BLM造模后3天、7天、28天处死各组部分小鼠(3天、7天各处死组内5只小鼠，剩余小鼠造模28天时处理)，收集肺组织。
(3)评价小鼠肺维化程度
1)评价肺纤维化程度：
BLM造模28天后肺组织天狼星红染色(a)及Masson染色(b)结果参见图15(标尺：200μm)，PfTrx-HMGB117(95-111)/BLM组小鼠肺组织胶原沉积明显低于BLM组及PfTrx/BLM组。
2)肺组织羟脯氨酸总量检测
参照羟脯氨酸试剂盒(南京建成科技有限公司)检测方法，小鼠肺组织羟脯氨酸总量＝羟脯氨酸含量×肺组织总重。结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)/BLM小鼠肺脏羟脯氨酸总量明显低于PfTrx/BLM组与BLM组，且差异具有统计学意义(参见图16，其中*P<0.05，**P<0.01)。
(4)PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗抑制肺纤维化的机制
1)免疫组化检测肺组织α-SMA表达情况，结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)/BLM组肺组织的α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx/BLM组与BLM组(参见图17，标尺：100μm)。
2)Western blot法检测α-SMA表达水平，结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)组小鼠肺组织α-SMA的蛋白表达水平明显低于PfTrx组与BLM组，且差异具有统计学意义(图18)。
3)qRT-PCR法检测α-SMA、Col1a2、Col3a1、TGF-β1、CTGF、PAI-1mRNA水平，结果显示，PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗降低肺组织中α-SMA、Col1a2、Col3a1、TGF-β1、CTGF及PAI-1mRNA表达水平(如图19，其中*P<0.05，**P<0.01)。
4)细胞学实验
培养小鼠原代肺成纤维细胞，细胞分组及处理方法同LX2细胞，其中rhHMGB1终浓度为100ng/mL；anti-PfTrx抗体及anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体终浓度为1μg/mL。
结果显示，HMGB1+anti-PfTrx-HMGB117(95-111)抗体组α-SMA、Col1a2、Col3a1、CTGF、TGF-β1、PAI-1表达水平明显低于HMGB1组及HMGB1+anti-PfTrx抗体组(参见图20，**P<0.01,vs NC；&&P<0.01,vs HMGB1、HMGB1+anti-PfTrx IgG)。
6、统计学分析
实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多组间均数比较采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)和图基事后检验(Tukey'spost hoc test)，双侧P<0.05为显著性检验标准。
综合本发明的结果，PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗免疫小鼠后，可使小鼠产生高效价的抗HMGB1中和性抗体。经PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗免疫小鼠后，可以明显减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化及BLM诱导的肺纤维化。进一步的研究，证实抗HMGB1重组疫苗免疫可以明显减少肝肺组织细胞外基质的沉积，抑制小鼠肝组织及肺组织内成纤维细胞活化，减少其胶原的合成与分泌，进而发挥抗纤维化作用。另外，免疫后小鼠体内的TGF-β1、CTGF、PDGF、vimentin、PAI-1的水平也明显下降，这极有利于减缓纤维化的进程。结果表明，PfTrx-HMGB117(95-111)重组疫苗可以成功抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化及CCl4诱导的实验性肝纤维化。因此，PfTrx-HMGB117(95-111)重组疫苗有望被开发成为治疗肝脏及肺脏纤维化的有效手段。
综上所述，本发明提供一种用于治疗肝肺纤维化的抗HMGB1重组疫苗，该重组疫苗是将HMGB1的抗原表位(aa 95-111,PKRPPSAFFLFCSEYRP)插入PfTrx的原核表达质粒pET28-PfTrx，构建重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)。重组疫苗分别免疫小鼠后，可使小鼠产生高效价的抗HMGB1中和性抗体。经PfTrx-HMGB117(95-111)疫苗免疫小鼠后造模，可以明显减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化及BLM诱导的肺纤维化。同时，该PfTrx-HMGB117(95-111)重组疫苗免疫可以明显减少肝肺组织细胞外基质的沉积，抑制小鼠肝肺内的成纤维细胞的活化，减少胶原的合成与分泌，进而发挥抗纤维化作用。另外，免疫后小鼠体内的TGF-β1、PDGF、PAI-1的水平也明显下降，这极有利于减缓纤维化的进程。结果表明，PfTrx-HMGB117(95-111)重组疫苗可以成功抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化及CCl4诱导的实验性肝纤维化。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)，其特征在于，将HMGB1的抗原表位aa第95至111的氨基酸插入到原核表达质粒中，获得重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)；其中，所述HMGB1的抗原表位aa第95至111的氨基酸的序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.如权利要求1所述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)，其特征在于，所述原核表达质粒为PfTrx的原核表达质粒pET28-PfTrx。
3.权利要求1或2所述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)在制备抗肝纤维化的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低肝组织中α-SMA、Col1a2、Col3a1、CTGF、TGF-β1、PDGF-B、vimentin和PAI-1表达水平的药物。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制肝组织内成纤维细胞的活化、减少胶原的合成与分泌、减少组织细胞外基质沉积的药物。
6.权利要求1或2所述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)在制备抗肺纤维化的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低肺组织中α-SMA、Col1a2、Col3a1、CTGF、TGF-β1、PDGF-B、vimentin和PAI-1表达水平的药物。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制肺组织内成纤维细胞的活化、减少胶原的合成与分泌的药物。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物为减少组织细胞外基质沉积的药物。
10.权利要求1或2所述的重组疫苗PfTrx-HMGB117(95-111)在制备抗HMGB1中和性抗体中的应用。
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