CN116789581A - 一种艾地骨化醇有关异构体杂质、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种艾地骨化醇有关异构体杂质、制备方法和应用。本发明旨在保护一种全新结构的艾地骨化醇发酵杂质F,经制备和结构确认,该杂质是艾地骨化醇合成工艺中产生的25‑位异构体杂质,杂质F在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0%,且经传统纯化方式难以清除,给产品安全性带来隐患。本发明提供了一种新的制备杂质F的方法,其液相纯度均高于95.0%,对杂质对照品的制备具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于药物化学合成技术领域,具体涉及一种艾地骨化醇有关异构体杂质的制备方法和应用。
背景技术
艾地骨化醇(Eldecalcitol),化学名为:(1R,2R,3R,5Z,7E)-2-(3-羟基丙氧基)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,25-三醇,结构式为:
艾地骨化醇是一种具有生理活性的维生素D3衍生物,其制剂剂型主要为软胶囊,规格为0.5μg和0.75μg,适应症为骨质疏松症。艾地骨化醇软胶囊原研厂家为日本中外制药株式会社,于2011年1月21日在日本获批上市,商品名为Edirol。在预防骨质疏松骨折方面,艾地骨化醇疗效优于阿法骨化醇,且安全性与阿法骨化醇相当。
艾地骨化醇生理活性高,单次服用剂量极小,且性质不稳定,对光和热敏感,含有多个手性中心,传统合成路线较长,在合成过程中无可避免的容易产生一些异构体杂质及其它有关物质,难于分离纯化,因而合成工艺技术门槛高、难度大。我们在开发艾地骨化醇原料药的合成工艺中,在步骤八的微生物转化反应中,除了会在25-位羟化,也会在26-位或者27-位发生羟化反应,生成两个25-位异构体杂质。该杂质在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0%,经传统的柱层析、重结晶等纯化方式难以清除,会给产品安全性带来隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种艾地骨化醇有关异构体杂质、制备方法和应用。本发明旨在保护杂质F的制备方法,建立检测方法,分析杂质含量,并确定合理的杂质限度,以保证艾地骨化醇的产品质量及用药安全性。
实现上述发明目的的技术方案是:
第一方面,本发明提供一种艾地骨化醇杂质F,其具有如下所示结构:
进一步地,所述杂质F由两个互为异构体的杂质组成,结构式如下:
所述式(I)和式(II)互为异构体。
第二方面,本发明提供一种艾地骨化醇杂质F的制备方法,反应路线如下:
所述的制备方法步骤如下:
(1)以式1化合物为原料,经微生物转化反应,在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物;
(2)式2化合物在1,3-丙二醇和碱的作用下,发生环氧开环反应得到式3化合物;
(3)式3化合物在光敏剂和碱的作用下,经光化学及热异构化反应得到含有杂质F的粗品;
(4)将步骤(3)所得粗品溶解后,采用DAC-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化,最终得杂质F。
根据本发明实施方案,步骤(1)中所述微生物转化反应是将式1化合物作为反应底物,然后将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌HRW001菌体,并将所述菌体应用于微生物转化,在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物;
根据本发明实施方案,所述微生物转化反应在有机溶剂中进行,所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合;优选地,所述溶剂选自乙醇。
根据本发明实施方案,步骤(1)中假诺卡氏菌HRW001,经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定,分类命名为假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.HRW001,该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.17524,保藏地址:中国北京。
根据本发明实施方案,步骤(2)中所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合;所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2~4;
优选地,所述碱选自叔丁醇钾,所述式2化合物与碱的摩尔比为1:3;式2化合物与1,3-丙二醇的质量比为1:20;
优选地,所述反应在氮气保护下进行,反应温度控制在100~120℃,反应时间为2~4h。
进一步优选地,反应温度控制在110℃,反应时间为3h。
根据本发明实施方案,步骤(3)光化学及热异构化反应是在有机溶剂中进行,所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合;
根据本发明实施方案,所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合;所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2~4;
优选地,所述溶剂选四氢呋喃,所述碱选自三乙胺,所述式3化合物与碱的摩尔比为1:3;
优选地,所述光敏剂蒽类光敏剂,具体可以是蒽、9-乙酰基蒽、2-乙酰基蒽、蒽-9-甲酸、9,10-二苯基蒽中的一种;
进一步优选地,所述光敏剂为蒽,所述式3化合物与蒽的摩尔比是1:0.5~1。
进一步优选地,步骤(3)中光化学及热异构化反应是将式3化合物溶于四氢呋喃中,加入蒽和三乙胺,氮气保护下,于-5±5℃时,500W高压紫外汞灯进行光化学反应,保温反应5h,然后升温至65℃,保温反应4h,将反应液减压浓缩,柱层析纯化,得到含有杂质F的粗品。
根据本发明实施方案,步骤(4)中采用DAC-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化,取粗品溶液进样,洗脱剂为乙腈和水的混合溶液,其中乙腈和水的体积比为:乙腈/水=55/45,流速:80ml/min,波长:265nm。
第三方面,本发明还提供所述艾地骨化醇发酵杂质F在药物工艺研究中的应用,其可用于艾地骨化醇杂质研究。
第四方面,本发明提供一种检测艾地骨化醇原料药中杂质F的方法,具体包括以下步骤:
(1)样品配制:
供试品溶液取本品约3mg,置10ml量瓶中,加2ml甲醇振摇使溶解,用稀释剂稀释至刻度,摇匀(于30分钟内进样)。
对照溶液精密量取供试品溶液1ml,置20ml量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀;再精密量取1ml,置10ml量瓶中,用稀释剂稀释至刻度,摇匀。
系统适用性溶液取杂质F对照品1mg,置同一50ml量瓶中,加甲醇振摇使溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取3ml,置10ml量瓶中,加稀释剂稀释至刻度,摇匀,作为杂质储备液。取艾地骨化醇对照品3mg,置10ml量瓶中,先加2ml甲醇振摇使溶解,精密加入杂质储备液1ml,再用稀释剂稀释至刻度,摇匀。
(2)色谱条件设置:
色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
流速:0.5~1.1ml/min;
柱温:20~40℃;
波长:260~270nm;
进样量:30~50μl;
流动相:以乙腈流动相A,以水为流动相B进行梯度洗脱;
(3)检测:
精密量取上述溶液各50μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按照面积归一化法计算样品中杂质F含量。
根据本发明实施方案,步骤(1)中稀释剂为80%甲醇溶液。
根据本发明实施方案,步骤(2)中色谱柱型号为:YMC-Pack ODS-AM,4.6mm×150mm,3μm。
根据本发明实施方案,步骤(2)中按照下表进行梯度洗脱:
根据本发明实施方案,步骤(2)中流速可以设置为0.5ml/min,0.8ml/min,1.0ml/min,1.1ml/min;优选为1.0ml/min;步骤(2)中柱温可以设置为20℃,25℃,30℃,35℃,40℃;优选为30℃;步骤(2)中波长设置为260nm,265nm,270nm,优选为265nm;步骤(2)中进样量为30μl,40μl,50μl,优选为50μl;运行时间:20min~60min;
(3)检测:
精密量取上述溶液各50μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按照面积归一化法计算样品中各杂质含量。
与现有技术相比,本发明涉及的有益效果在于:
(1)本发明提供了一种全新结构的艾地骨化醇发酵杂质F,经制备和结构确认,该杂质是艾地骨化醇合成工艺中产生的25-位异构体杂质,杂质F在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0%,且经传统纯化方式难以清除,给产品安全性带来隐患。本发明提供了一种新的制备杂质F的方法,其液相纯度均高于95.0%,对杂质对照品的制备具有重要的现实意义。
(2)本发明通过制备获取该杂质,并对其进行结构确证从而确认该化合物的结构,并公开HPLC检测方法用于检测艾地骨化醇原料药中杂质F的方法。本发明的实施有助于更好地控制艾地骨化醇的质量,对于研究和控制药物生产质量,以及研究药物受体的不良反应具有重要的意义。
附图说明
图1是艾地骨化醇粗品有关物质检测HPLC图谱。
图2是式(I)化合物的HPLC图谱。
图3是式(I)化合物的氢谱。
图4是式(I)化合物的碳谱。
图5是式(II)化合物的HPLC图谱。
图6是式(II)化合物的氢谱。
图7是式(II)化合物的碳谱。
图8是艾地骨化醇纯品有关物质检测HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围,如无特别说明,所用原料均可通过市售或自制获得。
我们在开发艾地骨化醇原料药的合成工艺中,意外发现其中有一步反应,即化合物AD-M07经微生物转化反应得中间产物AD-M08的过程中,由于菌种的不纯,除了会在AD-M07的25位-上羟基生成AD-M08外,还会在AD-M07的26-位或27-位上羟基生成AD-M08的异构体杂质,该杂质会经步骤九和步骤十反应并向后传递,最终生成杂质F。杂质F由两个互为25-位异构体杂质组成,结构式如下:
由于这两个异构体杂质化学结构和性质极为相似,因此,在艾地骨化醇的质量控制中,将其合并一起控制,该杂质在艾地骨化醇粗品中的含量超过3.0%,艾地骨化醇粗品有关物质HPLC检测结果如表1,对应检测图谱见图1。
表1
组分名称 | 杂质D | 艾地骨化醇粗品 | 杂质F |
保留时间(min) | 25.891 | 28.916 | 34.341 |
含量(%) | 3.71 | 87.95 | 3.45 |
上述杂质经传统的柱层析、重结晶等纯化方式难以清除,也无法在反应过程中完全去除,会给产品安全性带来隐患。具体工艺研究与考察过程如下:
反应式:
艾地骨化醇合成工艺中的步骤八为微生物转化反应,反应底物为AD-M07,经微生物转化反应在25-位反应位点羟化后生成产物AD-M08。而微生物转化过程中的羟化反应在菌体细胞内,通过菌体代谢完成。参与反应的菌体胞内酶系成分复杂,并非单一酶参与反应。因此,步骤八中不可避免的会在AD-M07的24-位、26-位、27-位反应位点羟化生成不同的杂质,其中,26-位和27-位生成的杂质相同,经步骤九环氧开环和步骤十的光化学反应后生成杂质F,而杂质F由两个艾地骨化醇的25-位异构体杂质组成,化学结构和理化性质与艾地骨化醇相近,通过传统的柱层析和重结晶方式无法完全清除。
本发明经艾地骨化醇中间产物AD-M07微生物转化反应,再与1,3-丙二醇环氧开环,然后经光化学反应和热异构化反应,最后经DAC制备分离纯化得到杂质F,并经结构确证,其结构式和命名如下:
杂质F,命名为:(1R,2R,3R,5Z,7E)-2-(3-羟基丙氧基)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,26-三醇
化学结构式:
本发明旨在保护杂质F的制备方法,建立检测方法,分析杂质含量,并确定合理的杂质限度,以保证艾地骨化醇的产品质量及用药安全性。
实施例1杂质F的制备方法
反应式:
步骤一:取100g式1化合物溶于800ml的无水乙醇中,作为反应底物,然后通过对假诺卡氏菌HRW001进行四级扩大培养(一级、二级、三级种子培养和发酵培养)后获得大量菌体细胞,利用菌体细胞内的P450相关羟化酶系进行微生物转化,对底物的26-位或27-位碳进行羟化。再将发酵液固液分离后进行萃取、干燥、浓缩,经柱层析纯化得到40g含有式2的化合物。
本发明所述微生物转化方法,可参考专利CN110527650A说明书公开的方法,微生物发酵采用的假诺卡氏菌HRW001,经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定,分类命名为假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.HRW001,该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.17524。
步骤二:将上述式2化合物和800g的1,3-丙二醇加入反应瓶中,开启搅拌,降温至0~20℃,缓慢分批加入32g叔丁醇钾。氮气保护,升温至110℃,保温反应2h,取样TLC监控,直至式2化合物反应完全,降至室温,分别用水和乙腈洗涤、乙酸乙酯和正己烷搅洗过滤,再用甲醇重结晶,过滤干燥,得到20g含有式3的化合物。
步骤三:将上述化合物溶于2L四氢呋喃中,加入3.5g蒽和6g三乙胺,氮气保护,降温至-5±5℃时,500W高压紫外汞灯进行光化学反应,保温反应5h,然后转移至反应瓶中,升温至65℃,保温反应4h,将反应液于45℃减压浓缩,再柱层析纯化,得到7g含有杂质F的粗品。
步骤四:将上述粗品溶于60ml甲醇中,采用DAC-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化,洗脱剂为乙腈和水的混合溶液,其中乙腈和水的体积比为:乙腈/水=55/45,流速:80ml/min,波长:265nm;取粗品溶液进样,每次上样约1g,分别收集目标制备液,再分别合并后,减压浓缩。再分别用乙酸乙酯和正己烷重结晶,过滤,真空干燥,最终得450mg式(I)化合物和200mg式(II)化合物。
式(I)化合物的HPLC纯度:98.6%,保留时间34.963min,HPLC谱图见图2,核磁共振氢谱见图3、碳谱见图4,[M+Na]+的m/z为513.35413,数据如表2和表3所示。
式(II)化合物的HPLC纯度:97.0%,保留时间33.832min,HPLC谱图见图5,核磁共振氢谱见图6、碳谱见图7,[M+H]+的m/z为491.37296,数据如表4和表5所示。
表2式(I)化合物核磁共振氢谱测定结果
表3式(I)化合物核磁共振碳谱测定结果
/>
表4式(II)化合物核磁共振氢谱测定结果
/>
表5式(II)化合物核磁共振碳谱测定结果
/>
/>
实施例2
一种艾地骨化醇有关物质的检测方法,可以有效分离杂质F及其他已知杂质,具体包括以下步骤:
(1)样品配制:
供试品溶液取本品约3mg,置10ml量瓶中,加2ml甲醇振摇使溶解,用80%甲醇稀释至刻度,摇匀(于30分钟内进样)。
对照溶液精密量取供试品溶液1ml,置20ml量瓶中,用80%甲醇稀释至刻度,摇匀;再精密量取1ml,置10ml量瓶中,用80%甲醇稀释至刻度,摇匀。
系统适用性溶液取杂质F对照品1mg,置同一50ml量瓶中,加甲醇振摇使溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取3ml,置10ml量瓶中,加80%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为杂质储备液。取艾地骨化醇对照品3mg,置10ml量瓶中,先加2ml甲醇振摇使溶解,精密加入杂质储备液1ml,再用80%甲醇稀释至刻度,摇匀。
(2)色谱条件设置:
色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(YMC-Pack ODS-AM,4.6mm×150mm,3μm或效能相当的色谱柱);
流速:1.0ml/min;
柱温:30℃;
波长:265nm;
进样量:50μl;
运行时间:60min;
流动相A为乙腈,流动相B为水,按下表进行梯度洗脱:
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 45 | 55 |
30 | 50 | 50 |
35 | 80 | 20 |
36 | 100 | 0 |
50 | 100 | 0 |
51 | 45 | 55 |
60 | 45 | 55 |
(3)检测:
精密量取上述溶液各50μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按照面积归一化法计算样品中各杂质含量。
实施例3
一种艾地骨化醇的纯化方法,具体包括以下步骤:将艾地骨化醇粗品溶于甲醇中,超声溶解至澄清,采用SFC200型超临界二氧化碳流体色谱系统进行制备分离,以CO2为流动相A,甲醇为流动相B。设定总流速为150ml/min,柱温40℃,流动相B进样比例30%,检测波长265nm,进样体积不超过20ml。收集目标产物溶液,制备液中控,将中控检验合格段制备液合并,减压浓缩至无液体滴出,向残余物中加入乙酸乙酯和正己烷,室温下搅拌析晶,过滤干燥,得到艾地骨化醇。SFC分离后的艾地骨化醇有关物质HPLC检测结果如表6,对应检测图谱见图8。由检测结果可知,通过SFC制备分离纯化,我们有效控制了艾地骨化醇中杂质F的含量,限度控制在0.10%以内。
表6
组分名称 | 杂质D | 艾地骨化醇 | 杂质F |
保留时间(min) | RRT:0.895 | 28.679 | 34.232 |
含量(%) | 未检出 | 99.61 | 0.05 |
Claims (10)
1.一种艾地骨化醇发酵杂质F,其具有如下所示结构:
2.根据权利要求1所述的艾地骨化醇发酵杂质F,其特征在于,所述杂质F由两个互为异构体的杂质组成,结构式如下:
所述式(I)和式(II)互为异构体。
3.一种艾地骨化醇发酵杂质F的制备方法,反应路线如下:
所述制备方法步骤如下:
(1)以式1化合物为原料,经微生物转化反应,在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物;
(2)式2化合物在1,3-丙二醇和碱的作用下,发生环氧开环反应得到式3化合物;
(3)式3化合物在光敏剂和碱的作用下,经光化学及热异构化反应得到含有杂质F的粗品;
(4)将步骤(3)所得粗品溶解后,采用DAC-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化,最终得杂质F。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述微生物转化反应是将式1化合物作为反应底物,然后将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌HRW001菌体,并将所述菌体应用于微生物转化,在式1化合物的26-位或27-位上羟基得到式2化合物;
所述微生物转化反应在有机溶剂中进行,所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合;优选地,所述溶剂选自乙醇。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中假诺卡氏菌HRW001,经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定,分类命名为假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.HRW001,该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.17524。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合;所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2~4;
优选地,所述碱选自叔丁醇钾,所述式2化合物与碱的摩尔比为1:3;式2化合物与1,3-丙二醇的质量比为1:20;
所述反应在氮气保护下进行,反应温度控制在100~120℃,反应时间为2~4h;
优选地,反应温度控制在110℃,反应时间为3h。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)光化学及热异构化反应是在有机溶剂中进行,所述溶剂选自乙醇、甲醇、丙二醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的一种或至少两种的组合;
所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、甲醇钾、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺中的一种或至少两种的组合;所述式2化合物与碱的摩尔比为1:2~4;
优选地,所述溶剂选四氢呋喃,所述碱选自三乙胺,所述式3化合物与碱的摩尔比为1:3;
所述光敏剂为蒽类光敏剂,具体可以是蒽、9-乙酰基蒽、2-乙酰基蒽、蒽-9-甲酸、9,10-二苯基蒽中的一种;
优选地,所述光敏剂为蒽,所述式3化合物与蒽的摩尔比是1:0.5~1。
8.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中光化学及热异构化反应是将式3化合物溶于四氢呋喃中,加入蒽和三乙胺,氮气保护下,于-5±5℃时,500W高压紫外汞灯进行光化学反应,保温反应5h,然后升温至65℃,保温反应4h,将反应液减压浓缩,柱层析纯化,得到含有杂质F的粗品。
9.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中采用DAC-50动态轴向压缩制备柱色谱系统对粗品进行制备分离和纯化,取粗品溶液进样,洗脱剂为乙腈和水的混合溶液,其中乙腈和水的体积比为:乙腈/水=55/45,流速:80ml/min,波长:265nm。
10.权利要求1所述的艾地骨化醇发酵杂质F在药物工艺研究中的应用,其可用于艾地骨化醇杂质研究。
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