CN116732031A - 梨miR482b-4及其在调控寄主抗轮纹病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了梨miR482b‑4及其在调控寄主抗轮纹病中的应用，所述miR482b‑4的序列如SEQ ID NO.2所示；实施例数据表明，轮纹病菌响应下梨miR482b‑4下调表达，PcRGA3上调表达，且miR482b‑4负调控基因PcRGA3的抗病功能。本发明为梨抗病育种提供了有价值的候选材料，为有效防治轮纹病害提供了理论依据，对果树病害防控具有重要意义。

Description

梨miR482b-4及其在调控寄主抗轮纹病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及梨miR482b-4及其在调控寄主抗轮纹病中的应用。

背景技术

梨(Pyrus spp.)属于蔷薇科(Rosaceae)植物，梨果营养价值较高，深受生产者和消费者欢迎。随着梨树栽培面积的扩大、配套管理技术不当等原因，梨真菌病害已成为影响梨果产量和品质的重要障碍。轮纹病是由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的一种真菌病害，该病害长期以来普遍发生，病害发生严重时导致毁园，给梨农带来巨大的经济损失，阻碍梨产业健康发展。近年来梨产业迅速发展，随着主栽品种的更迭，选育的抗病品种往往因为产量大幅下降而无法在生产上应用，致使质优感病品种的栽培面积不断扩大，梨轮纹病害的发生与危害也日趋严重，其常与梨干腐病和梨腐烂病复合侵染(国立耘等，2009)。因此，急需找到预防轮纹病害流行的有效方法。

轮纹病害的防治策略主要有提高树体抗性、加强栽培管理、清除菌源、药剂防治，在病原传播和侵入过程中掌握最佳时期喷药和套袋保护(陈金柱，2022)。目前对轮纹病害的防治以化学药剂为主，生物防治为辅，预防轮纹病流行的有效方法是栽植抗病高产品种(魏树伟等，2016)。随着基因芯片、高通量测序和生物信息学预测等技术的不断更新换代，越来越多响应生物胁迫miRNA被挖掘出来(Feng et al,2012；Diermann et al,2012)，它们的表达在植物响应生物胁迫中发挥了重要的作用。利用分子手段，挖掘新的梨抗病基因，开发依赖于miRNA的抗病改良方法，研究梨抗病机制，分离和鉴定梨的抗病基因，可以有效为梨轮纹病害防治提供理论依据。培育具抗病性的新品种是防治梨病害最有效的措施，为培育具有抗病性的梨新品种提供候选基因，已成为当前的一个研究热点。

miRNA是一类非编码性、内源调控基因表达的单链小分子RNA，其长度约为20-24个核苷酸，通过转录后调控靶基因的表达，参与调控植物生长发育及生物、非生物胁迫响应等过程(Bartel,2004)。2015年，miR482第一次在毛杨果中被报道(Lu et al,2005)，随后与之相关的研究陆续展开。在高山松中，pde-miR482a可以通过调控靶基因NBS-LRR抗性蛋白而参与高山松的生长发育；在番茄中，研究者验证了miR482b与晚疫病菌互作过程中的分子作用机制(Jing et al,2018)；在棉花和马铃薯中，研究鉴定miR482与黄萎病抗性相关(张玉娟等，2015)。NBS-LRR类基因家族的数量约占植物体内抗病基因(Resistance基因，R基因)总量的四分之三，是数量最大的抗病基因家族。NBS-LRR类基因编码的蛋白是一类包括细胞膜内的核酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)和细胞膜外富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat,LRR)结构域C端的跨膜受体蛋白，NBS-LRR类跨膜蛋白的N端各类结构域，TIR结构域、CC(coiled coil)结构域、LZ结构域与C端LRR结构域均可代表执行对病原体蛋白的识别功能。已有研究报道，miRNA介导的对NBS-LRR类基因的表达调控是植物平衡生长和防御之间的一种有效且通用的机制(陈坤，2022)。目前相比于拟南芥、番茄、玉米、水稻等模式植物和大田作物，果树miRNA的研究进展相对缓慢，对miRNA其在响应和抵御果树病原胁迫方面的研究报道甚少，目前对miR482家族成员在梨中相关反应的研究暂未报道。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在通过解析梨对轮纹病菌的抗病反应，为梨轮纹病害的抗病育种提供基因资源和靶标信息。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明第一方面提供了一个调控梨对轮纹病抗性的miRNA，具体为miR482b-4，其序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明研究发现，miR482b-4可以对梨PcRGA3基因进行靶向切割，进而抑制PcRGA3的表达，表明梨PcRGA3基因为一个调控梨对轮纹病抗性的基因。

本发明通过提取“康弗伦斯”梨组培苗(P.communis L.)的总RNA，并采用设计的特异性引物，扩增得到基因PcRGA3含NB-ARC与LRR的几乎近整个ORF序列2824nt，该序列如SEQID NO.1所示。可以理解的是，SEQ ID NO.1所示序列经一个或多个碱基的替换、缺失或插入得到的与SEQ ID NO.1所示序列具有相同功能的核苷酸序列同样属于本发明的保护范围。

本发明第二方面还提供了miR482b-4的前体，其序列如SEQ ID NO.3所示。

基于上述前体和成熟体序列，本发明第三方面构建了miR482b-4植物超表达载体(OE-miR482b-4)和沉默表达载体。

在本发明的一个具体实施例中，OE-miR482b-4的构建方法为：采用序列如SEQ IDNO.19～20所示引物扩增并回收目标片段，再采用SacI和XbaI通过双酶切反应将目标片段连接至pBI121载体。

在本发明的一个具体实施例中，沉默表达载体通过STTM法构建，故所得沉默载体记为STTM-miR482b-4，具体的，该载体中含有如SEQ ID NO.27所示的序列。

本发明还提供了PcRGA3基因的超表达载体(OE-PcRGA3)，在本发明的一个具体实施例中，OE-PcRGA3的构建方法为：采用序列如SEQ ID NO.21～22所示引物扩增并回收目标片段，再采用SacI和XbaI通过双酶切反应将目标片段连接至pBI121载体。

本发明第四方面提供了包含上述三种表达载体的基因工程菌，具体为将表达载体导入宿主细胞中。在本发明的某些实施例中，宿主细胞为农杆菌。

本发明第五方面提供了梨PcRGA3基因，miR482b-4或前体基因在植物育种中的应用，尤其是在获取梨抗轮纹病品种中的应用。在育种过程中，可选择PcRGA3基因表达量高，或miR482b-4和前体基因表达量低的品种用于辅助育种，可加快育种进程。

本发明第六方面提供了一种制备转基因植物的方法，具体为a)或b)：

a)在植物中过表达PcRGA3基因，得到抗病性提高的转基因植物，其中抗病性为对轮纹病的抗病性，植物优选为梨；

b)在植物中抑制或下调miR482b-4的表达，得到抗病性提高的转基因植物，其中抗病性为对轮纹病的抗病性，植物优选为梨。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明以轮纹病菌侵染“康弗伦斯”梨组培苗高通量测序中差异表达的miRNA为研究基因，通过Stem-loop RT-PCR检测确认梨中存在miR482b-4及NBS-LRR类基因PcRGA3，并明确了轮纹病菌响应下梨miR482b-4及其相关基因的表达模式；实施例数据明确了梨miR482b-4负调控基因PcRGA3的抗病功能，即梨miR482b-4的过表达会降低梨的抗病能力，反之则有利于梨对轮纹病菌的抗性，为梨轮纹病害的抗病育种提供基因资源和靶标等重要的参考信息。

附图说明

图1为实施例1中“康弗伦斯”梨基因PCR产物电泳检测图，A为Stem-loop RT-PCR扩增检测图，B、C分别为前体和PcRGA3基因的常规RT-PCR扩增检测。

图2为实施例1中提供的miR482b-4前体的二级结构示意图。

图3为实施例1中提供的“康弗伦斯”梨PcRGA3的基因组结构图。

图4为实施例2中轮纹病菌侵染“康弗伦斯”梨后不同时间的发病症状对比图。

图5为实施例3中构建的离体梨瞬时转化优化体系图。

图6为实施例3中miR482b-4沉默表达载体的结构设计策略图。

图7为实施例3梨瞬时转化中miR482b-4相关基因的相对表达量分析，A为miR482b-4超量、沉默表达转化“康弗伦斯”梨组培苗离体叶片miR482b-4基因相对表达量，B为“康弗伦斯”梨组培苗叶片中miR482b-4超量、沉默下PcRGA3的相对表达量，C为miR482b-4超量表达转化“中梨1号”梨幼果miR482b-4基因相对表达量，D为miR482b-4沉默表达转化“金水2号”梨幼果miR482b-4基因相对表达量。

图8为实施例3梨瞬时转化中PcRGA3基因的相对表达量分析，A为“康弗伦斯”梨组培苗离体叶片，B为“金水2号”梨幼果。

图9为实施例3中OE-miR482b-4与STTM-miR482b-4瞬时转化梨“康弗伦斯”叶片和幼果接种LW-P不同时间的发病情况。

图10为实施例3中OE-PcRGA3瞬时转化梨“康弗伦斯”叶片和“金水2号”幼果中接种LW-P不同时间的发病情况。

图11为实施例4中梨miR482b-4调控靶基因PcRGA3的切割位点分析结果图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中的轮纹病菌菌株LW-P为携带BdPV1真菌病毒的轮纹病菌，“SantaMaria”梨果实与“康弗伦斯”梨带休眠芽的枝条(P.communis L.)由湖北省农业科学院果树茶叶研究所国家砂梨种质资源圃(武汉)提供，“金水2号”梨幼果、“中梨1号”幼果采自湖北省华中农业大学果树实践教学基地。

以下实施例中的部分数据统计分析：委托测序的序列于DNAMAN软件进行数据比对分析，通过RNA Folding Form在线网站http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php对miRNA前体序列进行二级结构预测，通过ORF finder在线网站进行预测可能的开放阅读框https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder，蛋白保守结构域通过在线网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi预测。基因表达检测用2^-△△Ct相对定量法进行计算(Livak and Schmittgen 2001)，采用软件SPSS对测试数据进行相应的统计和显著性差异分析(P<0.05)，及GraphPad Prism软件作图分析。

实施例1梨miR482b-4、前体基因及PcRGA3基因的鉴定

本例通过以下操作流程鉴定梨miR482b-4、前体基因及PcRGA3基因：

(1)针刺法接种。

通过孢子液针刺接种法用于轮纹病菌侵染“康弗伦斯”梨组培苗中miR482b-4、前体基因及其PcRGA3基因的鉴定，具体方法如下：

①制取轮纹病菌孢子液：将-80℃保存的LW-P菌株于PDA平板上活化，置于25℃培养箱培养3d左右，用灼烧灭菌的打孔器(d＝5mm)在菌落边缘打取新鲜的菌丝块，转接于新的PDA平板中央二次活化，使菌丝面朝下，2d后在菌落边缘取新鲜的菌丝块，转接于MS平板中央，置于黑光灯诱导的25℃恒温培养箱中10d左右产孢(期间刮掉长出的菌丝，制造逆境，利于产孢)，用无菌水吸取轮纹病菌孢子制成孢子液(取5μl在血球计数板上计数，大约20～30个孢子/血球计数板格，孢子液浓度约为6×10⁶cfu/mL)。

②接种植物材料：将3周左右苗龄、长势均一健壮的梨“康弗伦斯”无菌组培苗用无菌1ml注射器针刺茎后每株接种1μl轮纹病菌孢子液，于组培室恒温培养。

(2)梨总RNA的提取。

采用2％ CTAB法提取0.1g左右LW-P侵染的“康弗伦斯”梨组培苗的总RNA。

(3)Stem-loop RT-PCR扩增。

对“康弗伦斯”梨接种轮纹病菌后组培苗样品进行高通量测序，以差异表达的miR482b-4与其预测的靶基因PcRGA3为研究基因。

通过高通量测序预测miR482b-4成熟体序列22nt(SEQ ID NO.2)，靶向抗病蛋白PbRGA3(基因号：XM_018650290.1)，NCBI显示PbRGA3的CDs全长3369nt，Conserved Domains及ORF finder对PbRGA3基因核苷酸序列进行预测分析，结果显示：PbRGA3含保守结构域核苷酸结合位点(NB-ARC)与亮氨酸重复序(LRR)的ORF全长2838nt，编码945aa。

设计特异性引物(所得引物如表1所示)，对高通量测序中选取的miR482b-4，前体基因及其预测的靶基因进行扩增。具体为：以提取的总RNA为模板加入茎环特异引物进行反转录，得到cDNA，而后进行Stem-loop RT-PCR扩增验证miR482b-4存在梨中，前体基因及PcRGA3由RT-PCR扩增。详细操作步骤如下：

①取无酶0.5ml EP管，分别加入1μl茎环特异RT引物、总RNA(所加量视浓度而定)，DEPC处理过的无菌去离子水补足至10μl，吸打混匀后，置于沸水浴10min，后冰浴5min。

②无酶0.5ml EP管中加入10μl反转录混合液：4μl 5×RT buffer，1μl 100mmol/LdNTPs，0.5μl 40U/μL RRI，0.5μl 200U/μL M-MLV，4μl DEPC处理的无菌去离子水，混匀后瞬时离心，37℃水浴1h，置于沸水浴中变性3min，迅速冰浴3min，获得cDNA模板。

③PCR管中加入PCR扩增反应体系：0.5μl的cDNA，7.5μl的PCR Mix，0.3μl的前后引物，6.4μl的ddH₂O(回收目标条带时按此体系比例对应的扩大体系)，混匀后瞬时离心，总体系于PCR仪中进行扩增，扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃完全延伸10min。

表1RT-PCR扩增miR482b-4、MIR484-2及靶基因PcRGA3基因所用引物信息

④PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中电压140V，约15min左右进行电泳检测，电泳时加入合适大小的Mark进行点样，电泳后将胶块置于0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色并成像观察。

(4)目标片段产物回收及连接。

将PCR产物电泳检测后，在紫外灯下从琼脂凝胶中切下含目标片段的胶块，放入1.5ml的离心管中，通过SanPrep柱式PCR产物回收试剂盒对目标片段进行回收。

在PCR管中将回收产物连接到pMD18-T载体上进行TA克隆，连接体系为：4.5μl PCR产物，0.5μl pMD18-T Vector，5.0μl Solution I，吸打混匀后离心，置于4℃连接过夜。

(5)热激转化及阳性克隆筛选。

将连接体系通过热激转化法转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中，电泳检测筛选阳性克隆后，选取至少3个阳性克隆菌液送往武汉天一华煜基因有限公司进行测序。

对高通量测序中选取的miR482b-4和前体及预测靶基因的扩增结果如图1所示。对获得的目标产物进行回收、克隆测序，扩增测序获得了miR482b-4预期大小的PCR产物片段，其测序序列与高通量测序miRNA序列一致率为100％，获得miR482b-4前体基因序列254nt(如SEQ ID NO.3所示)，与高通量测序中获得的前体基因核苷酸序列同源性为99％以上，通过RNAFolding Form在线网站对序列进行二级结构预测分析(如图2所示)。扩增得到靶基因PcRGA3含NB-ARC与LRR的序列2824nt(如SEQ ID NO.1所示)，其测序序列基于核苷酸序列与数据库中PbRGA3(XM-018650290.1)序列的ORF(2838nt)比对，结果显示同源性为79.94％。对其序列进行Blastp同源性比对，结果显示其与putative disease resistance proteinRGA4氨基酸序列覆盖率最高为99％，同源性为91.85％，通过IBS软件对序列进行基因组结构分析(如图3所示)。

实施例2轮纹病菌响应下梨中miR482b-4、前体基因及PcRGA3表达量分析

高通量测序显示miR482b-4在轮纹病菌侵染的梨中差异表达，为了明确其表达模式，本例通过针刺法将轮纹病菌孢子液注射到苗龄3周左右、长势均一健壮的“康弗伦斯”梨组培苗茎杆处(具体操作件实施例1)。分别在浸染的不同时间点进行取样：0h、24h、36h、48h、60h、72h，共进行3次生物学重复。取样时迅速用液氮冷冻，放于-80℃备用。期间可观察到随着侵染时间的推移，在接种处发生凹陷，产生黑色病斑，附着白色菌丝(图4)。

经CTAB法提取样品的总RNA(同实施例1)，以其为模板进行反转录，结合表2中的引物，对轮纹病菌孢子液侵染“康弗伦斯”梨组培苗后miR482b-4、前体基因及靶基因PcRGA3的表达量进行测定，分析miR482b-4相关基因在轮纹病菌的孢子液侵染不同时间后的表达模式。具体步骤如下：

以1μg CTAB法提取的总RNA为模板，加入1μl RT引物，通过HiScript Q RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录获得cDNA，依据ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix试剂盒进行qPCR扩增，梨Actin与U6作为内参基因，引物信息见表2；

PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性30s，55℃退火30s，40个循环；扩增完毕后从55℃开始采集荧光信号，每升高0.5℃停留10s采集荧光信号，至温度升高至95℃熔解曲线采集完成。每个样品设置3个技术重复，共进行3次生物学重复。

数据分析：基因表达水平用2^-△△Ct相对定量法进行计算(Livak and Schmittgen2001)，采用软件SPSS进行显著性差异分析(P<0.05)。

表2qPCR扩增引物信息

RT-qPCR检测结果显示：在0h梨苗中miR482b-4及其前体基因中表达量最高，在轮纹病菌侵染发病之后，随着时间的延长，miR482b-4及其前体的表达量均相对于0h逐渐下降，在24h达到最低，随后逐渐升高，于48h达到最高再稍有降低，miR482b-4及其前体的表达趋势整体呈下调模式，在轮纹病菌侵染发病之后，PcRGA3相对表达量在24h达到最高，随着接种时间逐渐下降，于48h达到最低再稍有升高，整体表达趋势呈上调模式，表明miR482b-4、MIR482b-4与PcRGA3在轮纹病菌侵染不同时间内整体呈相反的表达模式。

实施例3梨miR482b-4调控梨抗病作用分析

本例通过农杆菌介导的瞬时遗传转化方法，以离体“康弗伦斯”梨组培苗叶片、“金水2号”和“中梨1号”梨幼果进行瞬时转化，验证miR482b-4介导靶基因PcRGA3的抗病反应功能。本例构建的离体梨瞬时转化优化体系如图5所示。

(1)miR482b-4与靶基因PcRGA3超表达载体的构建。

根据测序鉴定为梨miR482b-4的前体序列(254bp，如SEQ ID NO.3所示)与PcRGA3含靶标序列的ORF1(2824bp，如SEQ ID NO.1所示)，利用引物设计软件Oligo 7设计引物，并分别在正反引物5’端加上保护碱基和酶切位点接头序列。设计的引物序列具体如下：

miR482b-4正向引物：5’-TGCTCTAGATTCCTATCCCTCCCATTCC-3’(SEQ ID NO.19)，

miR482b-4反向引物：5’-GGCGAGCTCAACCAAAAACAGAACAAGCAA-3’(SEQ ID NO.20)；

靶基因正向引物：5’-TGCTCTAGAATGGCCGATGTGCTTGTTTC-3’(SEQ ID NO.21)，

靶基因反向引物：5’-GGCGAGCTCCTGAATTTGGATGTTTGGGATGT-3’(SEQ ID NO.22)。

采用上述引物并分别以梨测序鉴定正确的miR482b-4与PcRGA3菌液质粒为模板进行PCR反应克隆，回收目标片段。在PCR管中加入双酶切反应体系：1μl SacI和1μl XbaI，1μlBuffer，5μl目标片段质粒，2μl ddH₂O混匀后在37℃水浴30min，沸水浴3min进行双酶切反应。

将植物表达pBI121载体用SacI和XbaI进行双酶切，在PCR管加入6μl带有酶切接头目标基因的PCR产物与2μl酶切好的pBI121载体，1μl T4 DNA连接酶与1μl T4 DNA连接缓冲液4℃过夜连接，克隆测序验证后得miIR482b-4与PcRGA3的超表达载体(即OE-miR482b-4与OE-PcRGA3)。

(2)miR482b-4沉默载体的构建。

通过短串联模拟靶标技术(STTM)构建miR482b-4的沉默载体，基因合成策略如图6，将合成基因(序列如SEQ ID NO.27所示)的菌液质粒通过双酶切法构建到植物表达pBI121载体上，克隆测序验证后得miR482b-4沉默表达载体(STTM-miR482b-4)。

(3)农杆菌转化。

将构建好的植物超表达与沉默载体以及pBI121空载体菌液活化，扩繁并提取质粒，取10μl质粒加入到30μl LBA4404(PcRGA3超表达载体加入GV3101)农杆菌细胞感受态中，经冻融法先冰浴40min后液氮速冻3min，再37℃水浴5min后加入500μL YEB液体培养基，150rpm在28℃恒温摇床中培养4-5h，待菌液摇浑后离心收集菌体，涂布于加卡那霉素(Kan)和利福平霉素(Rif)的LB平板上，通过PCR鉴定阳性克隆菌液。

(4)侵染。

取4μl菌液加入到4ml加Kan(100mg/L)和Rif(50mg/L)抗性的YEB液体中扩繁，后加入MES和乙酰丁香酮(AS)诱导进行二次扩繁，待菌液摇浑后离心收集菌体，用MMV渗透缓冲液使菌体重悬，最终OD₆₀₀为1.0。

①侵染组培苗叶片：在超净工作台中用灭菌的镊子取出继代培养30天左右、大小相当、长势良好的组培苗，切下顶端幼嫩叶片，放入菌液通过隔膜真空泵700PMa抽真空5min，待菌液渗入离体组培苗叶片中，将叶片取出放在无菌滤纸上去除多余菌液，叶面向上放置于MS培养基上，25℃条件下遮光培养2d，侵染空载的菌液及不作处理的野生型叶片作为对照；设三个独立重复实验，每个独立重复菌液侵染50片组培苗叶片为后续检测接种备用。

②侵染梨幼果：选取大小一致、同时段健康的离体梨“金水2号”，“中梨1号”幼果，摘除果柄后，流水下冲洗5～10min，用干净灭过菌的脱脂棉擦洗去除污垢尘埃后，75％酒精溶液浸泡消毒30s，无菌水清洗一遍，用无菌滤纸擦干果实表面水分，在梨果实表皮用无菌1mL注射器头刺3针刺伤，伤口深度一致，而后注射约0.5mL菌液至幼果体内，无菌滤纸擦拭幼果表面菌液，放置于保鲜膜封闭的白瓷盘中，于25℃保湿培养2d，空载菌液对照处理侵染点位于实验组背面；设三个独立重复实验，每个独立重复菌液侵染20个梨幼果为后续检测接种备用。

(5)RNA提取及RT-qPCR扩增。

抽样提取总RNA后进行qPCR检测(4)中菌液侵染在梨组织中的沉默与超表达，方法同实施例1和实施例2。

梨瞬时转化中miR482b-4相关基因的相对表达量的检测结果如图7，结果显示：

在OE-miR482b-4叶片中，miR482b-4的表达量显著高于WT及EV的表达量，增加约4倍，对应靶基因PcRGA3的表达量相比于对照减少约1/5；在ST-miR482b-4叶片中，miR482b-4表达量显著低于WT及EV的表达量，减少约1/2，对应的靶基因PcRGA3表达量上调约4倍。

在过表达miR482b-4幼果中，miR482b-4表达量相比于EV对照增加约5倍；在沉默表达miR482b-4幼果中，其表达量相比于EV对照减少约1/5。

以上结果表明，梨叶片和幼果瞬时转化体系可有效用于梨miR482b-4在梨中抗病作用研究。

梨瞬时转化中PcRGA3基因的相对表达量的检测结果见图8，结果显示：在OE-PcRGA3叶片中，PcRGA3的表达量显著高于WT及EV的表达量，增加约5倍，在OE-PcRGA3幼果中，PcRGA3表达量较于对照而言增加约7.5倍，显著上调表达，表明瞬时转化体系具有较好的表达效果。

(6)接种轮纹病菌及发病统计。

进一步对鉴定后剩余侵染状态良好的梨组培苗叶片和梨幼果进行接种轮纹病菌处理，在不同时间点观察其发病情况，具体如下：

将轮纹病菌孢子液通过一针针刺法在侵染菌液处接种qPCR鉴定后剩余侵染状态良好的梨组培苗叶片，于叶片正面接种，两个针刺点/片；用打孔器在活化的LW-P菌株菌落边缘打取新鲜、活性一致的菌丝块在侵染处接种梨幼果，菌丝面朝接种处，同时接种空载菌液与野生型作为对照，室温下培养后观察不同时间内的发病情况并统计病斑大小。

根据叶片发病情况，病级分为六个级别，分别为：0级，无叶片出现病症；1级，病斑占总叶面积≤5％；2级，5％＜病斑占总叶面积的≤10％；3级，10％＜病斑占总叶面积的≤20％；4级，20％＜病斑占总叶面积的≤50％；5级，病斑占总叶面积>50％。梨组培苗叶片病指统计的方法参照(Luan et al2015)，病情指数(disease index，DI％)的计算公式：病指＝(∑(相应病级×各病级病株数)×100)/(最大病级值×总株数)。梨幼果采用十字交叉法统计病斑的长度。

数据分析：试验共3个独立重复，每个重复接种35片苗龄30d左右、长势良好的组培苗叶片与15个表面光滑、生长状态良好的幼果，采用软件Graphpad t检验及SPSS进行显著性差异分析(P<0.05)。

梨miR482b-4的超表达载体和沉默载体瞬时转化下，组培苗离体叶片和幼果的发病情况见图9，结果显示：

在梨叶片中，接种24h开始发病，随时间推移，梨病斑变大，在接种36h与48h叶片病斑大小呈显著性差异；经计算，转化过表达miR482b-4的叶片DI％值相比于WT及EV对照显著增加，转化沉默表达miR482b-4叶片DI％值相比于WT及EV对照显著减小。

在梨幼果中，在接种1d时开始发病，接种3d、4d及5d时幼果病斑大小呈显著性差异，转化过表达miR482b-4的幼果，病斑直径较EV对照显著增大，转化沉默miR482b-4表达的幼果，病斑直径较EV对照显著减小。

以上结果表明沉默梨miR482b-4的表达，可增强寄主对轮纹病菌的抗性；过表达miR482b-4，梨更为感病。

梨PcRGA3的超表达载体瞬时转化下，组培苗离体叶片和幼果的发病情况如图10所示，结果显示：在叶片和幼果中，接种3d、4d及5d时病斑大小呈显著性差异，转化OE-PcRGA3病斑直径较EV对照显著减小；经计算，转化OE-PcRGA3的叶片DI％值相对于WT及EV对照显著降低。以上结果表明梨叶片和幼果中瞬时过表达PcRGA3抑制病斑的扩展，PcRGA3对轮纹病菌起抗病作用。

实施例4miR482b-4对靶基因PcRGA3切割作用位点分析

为进一步验证miR482b-4是否对靶基因PcRGA3进行切割，基于miR482b-4靶基因高通量测序预测靶基因靶标位点序列，设计靶基因序列扩增引物，对靶基因PcRGA3 mRNA剪切位点进行检测分析。

本例参照5’RLM-RACE(Zhang et al,2019)验证miR482b-4对靶基因PcRGA3的准确切割位点，具体操作步骤如下：

(1)取0.1g“Santa Maria”果实愈伤(培养25d左右)经CTAB法提取总RNA，在1.5mL无酶离心管中加入总RNA 200ng(约15μl)和1μl接头引物GeneRacerTM RNA Oligo(10mM)，吸打混匀，沸水浴10min，迅速置于冰上5min；

(2)加入以下体系：2μl RRI(40U/μL)，3μl 0.1％BSA，17μl 50％ PEG6000，5μl 10×T4RNA连接酶Buffer，2μl T4 RNA连接酶(40U/μL)，DEPC H₂O补足至50μl，吸打混匀，5-15℃反应16-18h；

(3)DEPC水补至200μL，加等体积氯仿颠倒混匀抽提12000rpm，4℃离心5min，取上清(155μl)加等体积预冷的异丙醇混匀，-20℃沉降30min，12000rpm 4℃离心15min，弃上清，加入75％乙醇，洗涤沉淀2-3次，空离1min，晾干管底残余乙醇，加入14μl DEPC水溶解沉淀，加1μl Oligo(dT)，沸水浴10min，迅速置于冰上5min；

(4)加入反转录体系：5μl 5×M-MLV Buffer，2μlL dNTP(10mM)，1μl M-MLV(40U/μL)，1μl RRI(40U/μL)，DEPC水补足至25μl混匀，42℃水浴90min，后沸水浴3min，终止反应，得到加接头的cDNA，-20℃保存备用；

(5)已加接头的cDNA为模板设置温度梯度(51℃、55℃和58℃)进行巢式PCR，二扩模板为一扩产物稀释20倍，引物见表3，2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行切胶分离，回收目的片段，对回收片段进行克隆测序，利用DNAMAN软件进行序列比对，分析miR482b-4切割位点。

表3 5’RLM-RACE引物信息

miR482b-4对靶基因PcRGA3切割作用位点如见图11所示，结果显示：从西洋梨‘Santa Maria’果实组织培养愈伤中扩增获得预期大小300nt的目标条带，随机选取12个阳性克隆进行测序，序列分析显示，4个克隆序列验证miR482b-4切割作用位点为PcRGA3靶标位置第18和第19个碱基之间，对应于PcRGA3基因NB-RAC保守结构域区域。

综上所述，本发明首次明确了梨中miR482b-4及其前体基因序列，以及miR482b-4负调控基因PcRGA3的抗病功能，为梨抗病育种提供了基因资源和靶标等有价值的候选材料，为有效防治梨轮纹病害提供了理论依据，对果树病害防控具有重要意义。

以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种miRNA在调控寄主抗轮纹病中的应用，其特征在于，所述miRNA为miR482b-4，所述miR482b-4的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述寄主为梨。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR482b-4靶向切割梨PcRGA3基因，所述PcRGA3基因序列如SEQ ID NO.1所示，或为SEQ ID NO.1所示序列经一个或多个碱基的替换、缺失或插入得到的与SEQ ID NO.1所示序列具有相同功能的核苷酸序列。

4.权利要求1所述miR482b-4的前体，其特征在于，所述前体的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有如SEQ ID NO.27所示的序列。

6.含有权利要求5所述重组载体的基因工程菌。

7.权利要求1所述的miR482b-4或权利要求4所述的前体在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述育种的目的为获得抗病性强的植物，所述抗病性为对轮纹病的抗病性，所述植物为梨。

9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，在植物中抑制或下调miR482b-4的表达，得到抗病性提高的转基因植物；所述miR482b-4核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗病性为对轮纹病的抗病性，所述植物为梨。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，根据miR482b-4的成熟体设计沉默表达载体，将沉默表达载体转化至农杆菌，再侵染植物；所述前体的序列如SEQ ID NO.3所示。