CN116726097A - 一种用于减肥的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于减肥的中药组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种用于减肥的中药组合物及其制备方法和应用。所述中药组合物包括泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的原料药材或其提取物，其中所述原料药材的配比按重量份计为：泽泻100～500重量份、灵芝500～1000重量份、荷叶1000～2000重量份、山楂100～500重量份、金银花500～1000重量份。本发明的中药组合物经试验表明在减肥方面具有显著的效果。本发明提供的中药组合物可开发成为预防治疗肥胖的药物。

Description

一种用于减肥的中药组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及一种中药复方及其制备方法，尤其涉及一种用于减肥的中药组合物及其制备方法和应用。
背景技术
世界卫生组织将肥胖定义为损害身体健康的不正常的脂肪积累。肥胖不仅会影响人们的生活质量，还会导致其他并发症，例如心血管疾病、代谢综合征、2型糖尿病、癌症等。值得注意的是，研究发现肥胖是胰岛素抵抗的主要原因之一。根据2019年国家发布的数据与标准，成年人身体质量指数(BMI)超过28.0kg/m2即为肥胖；BMI在24-27.9kg/m2之间为超重。
人体会将摄取的多余能量转化为脂肪储存起来，并在机体能量不足时燃烧脂肪，而这种机体能量代谢平衡的失调就可能导致不正常的脂肪积累。高糖高脂高热量的饮食诱使人体摄入过多的热量，当能量摄入速度快于代谢速度时，人体内脂肪含量增多，长期代谢失衡便会进一步导致超重和肥胖。
肥胖已成为全球性问题，开发疗效更好安全性更高的减肥药物一直是国内外学者关注的问题。目前市场上的减肥药物琳琅满目，但大多数药物都存在一定的不足，如胰脂肪酶抑制剂可以分解人体摄入的食物中的甘油三酯，以减少人体对脂肪的消化与吸收，但具有大便失禁、胀气等胃肠道副作用和肝损伤副作用；泻药类减肥药品，通过间歇性腹泻，并使胃酸减少、食欲减退，达到减肥的目的，但停药后，体重易回升，如经常服用还会发生贫血及肠胃疾病。中药减肥类产品相对毒副作用少，但一般减肥效果较弱，物质基础不清晰，减肥机理不明确。
因此，本领域需要一种功效优异、质量稳定、剂量较小、服用方便、机理清晰的用于减肥的中药组合物。
发明内容
本发明的目的提供一种功效优异、质量稳定、剂量较小、服用方便、机理清晰的用于减肥的中药组合物及其制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种中药组合物，包括原料药材或其提取物，其中所述原料药材包括：
泽泻100～500重量份；
灵芝500～1000重量份；
荷叶1000～2000重量份；
山楂100～500重量份；
金银花500～1000重量份；
其中，上述五种原料药材或其提取物的总重量占所述中药组合物的60wt％以上。
在另一优选例中，所述原料药材包括：
泽泻100～300重量份，
灵芝500～1000重量份，
荷叶1000～2000重量份，
山楂100～500重量份，
金银花500～1000重量份。
在另一优选例中，所述原料药材包括：
泽泻100～300重量份，
灵芝600～800重量份，
荷叶1500～2000重量份，
山楂300～500重量份，
金银花600～800重量份。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述泽泻的配比为150～450重量份，例如150重量份、200重量份、250重量份、300重量份、350重量份、400重量份。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述灵芝的配比为600～1000重量份，例如650重量份、700重量份、750重量份、800重量份、850重量份、900重量份、950重量份、1000重量份。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述荷叶的配比为1200～1800重量份，例如1200重量份、1300重量份、1400重量份、1500重量份、1600重量份、1700重量份、1800重量份、1900重量份。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述山楂的配比为150～500重量份，例如200重量份、250重量份、300重量份、350重量份、400重量份、450重量份。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述金银花的配比为，例如550重量份、600重量份、650重量份、700重量份、750重量份、800重量份、850重量份、900重量份、950重量份。
在另一优选例中，上述五种原料药材或其提取物的总重量占所述中药组合物的70wt％以上，更优选80wt％以上，例如85wt％、90wt％、95wt％、98wt％、99wt％。
在另一优选例中，所述中药组合物为原料药材或其提取物。
在另一优选例中，所述原料药材包括按照原料药材的总重量计的以下成分：
泽泻1wt％～10wt％，优选2wt％～9wt％，例如3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、8wt％；
灵芝15wt％～30wt％，优选17wt％～28wt％，例如20wt％、22wt％、24wt％、26wt％、28wt％；
荷叶30wt％～55wt％，优选32wt％～50wt％，例如35wt％、40wt％、45wt％、48wt％、50wt％；
山楂3wt％～20wt％，优选5wt％～18wt％，例如7wt％、9wt％、10wt％、12wt％、15wt％；
金银花10wt％～30wt％，优选12wt％～30wt％，例如15wt％、18wt％、20wt％、25wt％、28wt％。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述泽泻的含量为2wt％～9wt％，例如3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、8wt％。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述灵芝的含量为17wt％～28wt％，例如20wt％、22wt％、24wt％、26wt％、28wt％。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述荷叶的含量为32wt％～50wt％，例如35wt％、40wt％、45wt％、48wt％、50wt％。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述山楂的含量为5wt％～18wt％，例如7wt％、9wt％、10wt％、12wt％、15wt％。
在另一优选例中，在所述原料药材中，所述金银花的含量为12wt％～30wt％，例如15wt％、18wt％、20wt％、25wt％、28wt％。
在另一优选例中，所述的提取物包括：水提取物、醇提取物、水性溶剂提取物，或其组合。
在另一优选例中，所述的醇包括：C1-C6醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、或其组合。
在另一优选例中，所述的有效成分包括单一成分或混合成分。
在另一优选例中，以所述原料药材的总干重量计算，每克或每毫升所述的组合物对应5-50克，较佳地10-20克总药材。
在另一优选例中，当所述的组合物含有某一提取物时，则所述提取物的含量按所对应的原料药材的重量计算。
在另一优选例中，所述原料药材提取物包括泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的提取物。
在另一优选例中，所述原料药材提取物由泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的提取物构成。
在另一优选例中，所述原料药材提取物包括(a)泽泻的提取物，以及(b)灵芝、荷叶、山楂和金银花的提取物。
在另一优选例中，所述原料药材提取物包括(a)灵芝的水提取物，以及(b)泽泻、荷叶、山楂和金银花的醇提取物。
在另一优选例中，所述灵芝的提取物为清膏。
在另一优选例中，所述灵芝的提取物为相对密度为1.15-1.35(优选1.2～1.3)的清膏。
在另一优选例中，所述灵芝的提取物为50-60℃时相对密度为1.15-1.35(优选1.2～1.3)的清膏。
在另一优选例中，所述灵芝的提取物的分子量在5kDa～50kDa之间。
在另一优选例中，所述灵芝的提取物是用水提醇沉法制备的提取物。
在另一优选例中，所述泽泻、荷叶、山楂和金银花的提取物为清膏。
在另一优选例中，所述泽泻、荷叶、山楂和金银花的提取物为相对密度为1.15-1.35(优选1.1～1.3)的清膏。
在另一优选例中，所述泽泻、荷叶、山楂和金银花的提取物为50-60℃时相对密度为1.15-1.35(优选1.1～1.3)的清膏。
在另一优选例中，所述泽泻、荷叶、山楂和金银花的提取物是用醇提，然后经大孔吸附树脂吸附、醇解吸附制备的。
在另一优选例中，所述中药组合物包括泽泻的提取物、灵芝的提取物、荷叶的提取物、山楂的提取物，和金银花的提取物。
在另一优选例中，所述中药组合物包括泽泻的醇提取物、灵芝的水提取物、荷叶的醇提取物、山楂的醇提取物，和金银花的醇提取物。
在另一优选例中，所述原料药材提取物通过以下方法制备，所述方法包括步骤：
(1)提供一定质量配比的泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的原料药材；
(2)取灵芝用水提取得水提液，加乙醇醇沉，分离得到沉淀，加水复溶，超滤，收集超滤液，浓缩得到灵芝清膏；
(3)取泽泻、荷叶、山楂和金银花经醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附，醇解吸附，将解吸液浓缩成清膏；
(4)合并步骤(2)得到的灵芝清膏和步骤(3)得到的清膏得到所述提取物。
在另一优选例中，所述方法中的步骤(1)、(2)、(3)各自独立地如本发明第二方面所述。
在另一优选例中，所述中药组合物为药物组合物、食品组合物或保健品组合物。
在另一优选例中，所述的组合物包括口服制剂。
在另一优选例中，所述的组合物包括液态制剂、或固态制剂。
在另一优选例中，所述的中药组合物还包含药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体为药物赋形剂。所述的药物赋形剂包括但不限于溶剂、崩解剂、助悬剂、矫味剂、防腐剂、着色剂中的一种或几种。优选地，所述的药物赋形剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、糊精、纯化水、乙醇。
在另一优选例中，所述的中药组合物的剂型为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、膏剂、口服液等。
在本发明的第二方面，提供了一种原料药材提取物的制备方法，其中所述原料药材包括：
泽泻100～500重量份；
灵芝500～1000重量份；
荷叶1000～2000重量份；
山楂100～500重量份；
金银花500～1000重量份；
所述方法包括以下步骤：
(1)提供一定质量配比的泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的原料药材；
(2)取灵芝用水提取得水提液，加乙醇醇沉，分离得到沉淀，加水复溶，超滤，收集超滤液，浓缩得到灵芝清膏；
(3)取泽泻、荷叶、山楂和金银花经醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附，醇解吸附，将解吸液浓缩成清膏；
(4)合并步骤(2)得到的灵芝清膏和步骤(3)得到的清膏得到所述提取物。
在另一优选例中，所述原料药材、所述原料药材提取物各自独立地如本发明第一方面所述。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述原料药材为经过粉碎的原料药材。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，水提的加水量为灵芝药材质量的8-10倍。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述提取任选地为一次或多次(例如2、3次)提取。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述提取的提取时间为1-2小时。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，乙醇醇沉时，乙醇体积终浓度为混合醇沉液的75-95％。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述乙醇醇沉的时间为12-24h。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述超滤是指用超滤膜超滤分级纯化。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述超滤膜的元件结构采用卷式、管式、中空式或平板式。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述超滤膜中的超滤膜片材质采用聚丙烯腈、聚砜、醋酸纤维、聚醚砜、磺化聚砜、聚酰亚胺、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚砜、三氧化二铝或氧化锆。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述超滤膜中的超滤膜片的截留分子量范围为5kDa～50kDa。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，醇提步骤中使用的醇为乙醇。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，醇提步骤中使用的醇为体积浓度为60-80％的乙醇。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，醇提步骤中使用的醇的加入量为泽泻、荷叶、山楂和金银花药材的总质量的15-20倍。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述提取任选地为一次或多次(例如2、3次)提取。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述提取的提取时间为1-2小时。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，将醇提液浓缩至无醇味。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述大孔吸附树脂为HP-20型大孔吸附树脂。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的柱径高比为1：8。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，对于大孔吸附树脂，先上样，之后用纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后醇水溶液解吸，收集解吸液。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的上样体积为6-8BV。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，使用3-5BV的纯化水洗脱。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，使用5-10BV的80％乙醇水溶液解吸。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，解吸附步骤中醇的流速为1.5BV/h。
在另一优选例中，所述步骤(3)包括：泽泻、荷叶、山楂和金银花醇提液经浓缩至无醇味后，进行柱层析分离，选用HP-20型大孔吸附树脂，柱径高比为1：8，上样体积6BV，先用3-5BV的纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后采用5-10BV的80％乙醇水溶液解吸，流速为1.5BV/h，收集解吸液。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(1)如本发明第一方面所述的中药组合物；和
(2)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括口服制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括液态制剂、或固态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体为药物赋形剂。所述的药物赋形剂包括但不限于溶剂、崩解剂、助悬剂、矫味剂、防腐剂、着色剂中的一种或几种。优选地，所述的药物赋形剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、糊精、纯化水、乙醇。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、膏剂、口服液等。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第三方面所述的药物组合物的制备方法，所述方法包括：将如本发明第一方面所述的中药组合物和与药学上可接受的载体混合，制备药物制剂，得到相应药物剂型。
在本发明的第五方面，提供了一种如本发明的第一方面所述的中药组合物的应用，用于制备一药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗肥胖。
在另一优选例中，所述肥胖包括单纯性肥胖和肥胖症。
在另一优选例中，所述肥胖包括代谢性不健康肥胖。
在另一优选例中，所述肥胖的对象患有代谢性疾病。
在另一优选例中，所述代谢性疾病选自下组：高脂血症、高尿酸血症、糖尿病、冠心病、高血压、卒中、肿瘤，或其组合。
在另一优选例中，所述预防和/或治疗肥胖包括选自下组的一个或多个特征：
(1)体重降低或体重增速减缓；
(2)增加棕色脂肪细胞比例或增加单位面积的棕色脂肪细胞数量；
(3)抑制脂肪细胞内甘油三酯的积累；
(4)降低成熟脂肪细胞的脂质积累；
(5)促进脂质分解。
在另一优选例中，所述体重增速减缓是指相比未预防和/或治疗情况下的体重减轻。
在另一优选例中，所述促进脂质分解包括选自下组的一个或多个特征：
(1)激活细胞AMPKα信号通路；
(2)提高ATGL的mRNA和/或蛋白的表达水平；
(3)提高LGL的mRNA和/或蛋白的表达水平；
(4)提高HSL的蛋白表达水平。
在本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗肥胖的方法，所述方法包括：将如本发明第一方面所述的中药组合物或本发明第三方面所述的药物组合物施用于有此需要的对象。
在另一优选例中，所述对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述施用的浓度为0.5～5g/kg。
在本发明的第七方面，提供了一种食品组合物，所述食品组合物包括：
(1)如本发明第一方面所述的中药组合物；和
(2)食品学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，提供了一种保健品组合物，所述保健品组合物包括：
(1)如本发明第一方面所述的中药组合物；和
(2)保健品学上可接受的载体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了中药组合物对db/db小鼠褐色脂肪组织的影响。图1a为褐色脂肪细胞的显微镜观察结果；图1b为单位面积的褐色脂肪细胞数量的计数结果。
图2显示了中药组合物对脂肪细胞甘油三酯含量的影响。
图3显示了中药组合物对脂肪组织内脂滴积累的影响。图3a为3T3-L1细胞与脂肪细胞经过油红O染色后在偏光相差显微镜500倍镜下所拍摄的照片；图3b为将脂肪细胞内的油红O染料溶出后使用酶标仪检测各组吸光度，定量分析脂滴含量的结果。
图4显示了中药组合物对脂肪细胞脂肪分解基因转录水平的影响。图4a显示了中药组合物对脂肪甘油三酯脂肪酶ATGL mRNA的相对表达水平的影响；图4b显示了中药组合物对脂蛋白脂肪LGL mRNA的相对表达水平的影响。
图5显示了中药组合物对成熟脂肪细胞脂解蛋白与AMPKα信号通路的影响。图5a显示了中药组合物对AMPKα信号通路相关蛋白的影响；图5b显示了中药组合物对ATGL蛋白相对表达水平的影响；图5c显示了中药组合物对LGL蛋白相对表达水平的影响；图5d显示了中药组合物对HSL蛋白相对表达水平的影响；图5e显示了中药组合物对p-AMPKα/AMPKα蛋白相对表达水平的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种具有优异预防和/或治疗肥胖效果的中药组合物，本发明的组合物配方来源于中药复方，利用现代分离纯化技术将有效成分进行富集，制成质量稳定、剂量小、服用方便的制剂，克服了传统中药使用剂量大、减肥效果局限的缺点，提高了产品的技术含量。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“任选地”指的是可选或可不选。
如本文所用，术语“相对密度”指的是物质的密度与参考物质的密度在各自规定的条件下之比，本发明中，所述的参考物质为水在50-60℃条件下的密度(当作1来使用)，相对密度为另一种物质(如灵芝提取物、或其他原料提取物)的密度与水在50-60℃条件下的密度的比值。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“有效量”可随着药物组合物的形式、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
本发明所述的“预防”、“治疗”或“改善”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述组合物或药物组合物时观察到的水平相比，本发明所述组合物或药物组合物能够防止肥胖和/或肥胖并发症的产生，或将已有的肥胖和/或肥胖并发症减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
如本文所用，术语“重量份”和“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克表示重量(如1mg、1g、2g或1kg等等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述的组合物中，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％，因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b的含量为90％。
如本文所用，术语“原料药材”指在本发明的组合物中作为活性药材的中药材，所述的药材可包括多种形式，例如，所述的药材包括(但不限于)干药材、鲜药材、生药材、熟药材、炮制药材，或其组合。此外，当本发明的组合物含有某种原药材提取物时，该术语还包括原药材提取物所对应的原料药材或用于制备所述提取物的相应原料药材。
中药组合物
本发明提供了一种具有优异预防和/或治疗肥胖效果的中药组合物。其包括泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的原料药材或其提取物。
在本发明中，应当理解的是，所述的提取物不仅包含原料药材混合后，经提取得到的浓缩液(如浸膏)或有效成分(如粉末)，也包含原料药材中，单个药材提取得到的浓缩液(如浸膏)或有效成分的混合(包括浓缩液与浓缩液之间、有效成分与有效成分，或浓缩液与有效成分之间的混合)所得。原料药材的有效成分包含单一成分或混合成分。
相比现有的含有这五种原料药材提取物的瘦身膏、减肥茶等产品，本发明意外地发现在显著提高荷叶的配比，并且使用特定的水提灵芝、醇提和大孔吸附树脂吸附其他原料的提取方法之后所得到的特定的提取物具有非常优异的治疗肥胖的效果，尤其对于代谢性疾病导致的肥胖具有非常优异的治疗效果。
制备方法
本发明提供了一种原料药材提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)药材粉碎：
分别将泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花五味药材粉碎；
(2)灵芝的提取浓缩：
采用水提法，即按组份配比用量，将粉碎后的灵芝用水煎煮提取得水提液，水提液依次经过加乙醇醇沉、过滤或离心，沉淀物用水复溶，水溶液用超滤膜超滤分级纯化，将超滤所得组分浓缩成清膏；
(3)泽泻、荷叶、山楂和金银花的提取浓缩：
采用醇提法，即按组份配比用量，将粉碎后的荷叶、山楂和金银花经乙醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附、乙醇解吸附，将解吸液浓缩成清膏；
(4)配制剂型：
按照药物剂型制备要求，取上述步骤(2)和步骤(3)得到的清膏与药学上可接受的载体制备药物制剂，得到相应药物剂型。
优选地，所述步骤(2)水提的加水量为灵芝质量的8-10倍，提取2-3次，每次提取1-2小时。
优选地，所述步骤(2)乙醇醇沉时，乙醇体积终浓度为混合醇沉液的75-95％。
优选地，步骤(3)所述的乙醇提取所用乙醇体积浓度为60-80％，每次乙醇加入量为泽泻、荷叶、山楂和金银花总质量的15-20倍，提取2-3次，每次提取1-2小时。
优选地，步骤(3)所述的泽泻、荷叶、山楂和金银花醇提液经浓缩至无醇味后，进行柱层析分离，选用HP-20型大孔吸附树脂，柱径高比为1：8，上样体积6BV，先用3-5BV的纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后采用5-10BV的80％乙醇水溶液解吸，流速为1.5BV/h，收集解吸液。
优选地，步骤(2)中所述超滤膜元件结构采用卷式、管式、中空式或平板式；超滤膜片材质采用聚丙烯腈、聚砜、醋酸纤维、聚醚砜、磺化聚砜、聚酰亚胺、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚砜、三氧化二铝或氧化锆；超滤膜片截留分子量范围为5kDa～50kDa。
优选地，所述步骤(2)和(3)中的清膏在50-60℃时的相对密度为1.15-1.35。
药物组合物及施用方法
本发明还提供了一种药物组合物。所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
对于本发明所述的药物组合物的剂型并没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物的剂型。优选地，所述的剂型可包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、口含片、或气雾剂。从易于制备，给药或服用的立场上看，优选的组合物是固态组合物。口服给药是优选的。
本发明的药物组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体和/或辅料，如填充剂(如淀粉、纤维素、糊精)、崩解剂(羧甲基淀粉钠)、润滑剂(硬脂酸镁)、溶剂(纯化水)、助溶剂(乙醇)、包衣材料。可采用常规的中药制剂的方法制备成任何一种常用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、散剂。
药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
此外，在一个优选方式中，以所述原料药材的总干重量计算，每克或每毫升所述的组合物对应5-50克，较佳地10-20克总药材。
与现有技术相比，该中药组合物的优势在于：
(1)来源于中药复方，利用现代分离纯化技术将有效成分进行富集，易于制成质量稳定、剂量小、服用方便的制剂，克服了传统中药使用剂量大、减肥效果局限的缺点，提高了产品的技术含量。
(2)动物体内和细胞水平证明本发明中药组合物有显著减肥功效，机理清晰。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：散剂的制备
A、药材粉碎
以重量计，取泽泻200份、灵芝800份、荷叶1600份、山楂300份和金银花600份，经净选、水洗、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。
B、提取浓缩和干燥
灵芝加水煎煮提取，加水量为灵芝质量的8倍，提取2次，每次提取2小时，水提液加乙醇醇沉，乙醇终浓度为95％，静置过夜后过滤，沉淀用水复溶，水溶液用超滤膜超滤分级纯化，收集5kDa～50kDa组分，浓缩成50-60℃时相对密度1.25的清膏；
泽泻、荷叶、山楂和金银花用80％乙醇提取，每次加入量为泽泻、荷叶、山楂和金银花总质量的15倍，提取2次，每次提取2小时；醇提液经浓缩至无醇味再用HP-20型大孔吸附树脂吸附，柱径高比为1：8，上样液体积6BV，先用3BV的纯化水洗脱，弃去洗脱液，然后采用5BV的80％乙醇水溶液解吸附，流速为1BV/h，收集解吸液，解吸液浓缩成50-60℃时相对密度1.20的清膏。
C、制剂
合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成散剂。
实施例2：颗粒剂的制备
A、药材粉碎
以重量计，取泽泻200份、灵芝1000份、荷叶1800份、山楂500份和金银花800份，经净选、水洗、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。
B、提取浓缩和干燥
参照实施例1
C、制剂
合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成颗粒剂。
实施例3：片剂的制备
A、药材粉碎
以重量计，取泽泻100份、灵芝600份、荷叶1200份、山楂200份和金银花600份，经净选、水洗、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。
B、提取浓缩和干燥工艺
参照实施例1
C、制剂
合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成片剂。
实施例4：胶囊剂的制备
A、药材粉碎
以重量计，取泽泻300份、灵芝900份、荷叶1800份、山楂200份和金银花500份，经净选、水洗、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。
B、提取浓缩和干燥
参照实施例1
C、制剂
合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成胶囊剂。
实施例5：丸剂的制备
A、药材粉碎
以重量计，取泽泻100份、灵芝600份、荷叶1200份、山楂500份和金银花1000份，经净选、水洗、干燥处理后，经粉碎机进行粉碎。
B、提取浓缩和干燥
参照实施例1
C、制剂
合并步骤B中的两种清膏加入适量赋形剂制备成丸剂。
实施例6：本发明中药组合物对小鼠体重和脂肪组织形态学影响
1.材料与方法
1.1材料
db/db小鼠采购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司、苏木素染色液和伊红染色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其它试剂来自国药集团化学试剂有限公司。
中药组合物采用实施例1制备的未加辅料前的提取物。
1.2方法
4周龄雄性C57BL/6J正常小鼠和C57BLKS-db(db/db)糖尿病小鼠饲养于复旦大学药学院动物房，第一周使用正常饲料饲养以使其适应环境。饲养的温度保持在20-26℃，湿度维持在20-70％之间，小鼠饮水与进食不受限制，辅以日光灯模拟12h昼夜循环规律。每间隔一周，采取尾尖取血的方式从小鼠尾部静脉取出血液以监测小鼠空腹血糖(FastingBlood Glucose,FBG)。持续监测四周，挑选出FBG浓度大于11.1mM的db/db小鼠继续后续试验。试验及动物护理遵复旦大学实验动物伦理委员会的指南进行。
将空腹血糖大于11.1mM的db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、中药组合物低剂量组(ZHW-L)、中药组合物中剂量组(ZHW-M)和中药组合物高剂量组(ZHW-H)，并随机选取C57BL/6J正常小鼠作为正常组。各组均为非高脂饲料常规饮食，分组与药量对应如下：
组一，正常对照组(Normal)：C57BL/6J小鼠，5.0mL/kg生理盐水，n＝15；
组二，模型对照组(Control)：db/db小鼠，5.0mL/kg生理盐水，n＝15；
组三，二甲双胍组(Metformin)：db/db小鼠，225mg/kg二甲双胍，n＝15；
组四，中药组合物低剂量组(ZHW-L)：db/db小鼠，0.5g/kg，n＝15；
组五，中药组合物中剂量组(ZHW-M)：db/db小鼠，1g/kg，n＝15；
组六，中药组合物高剂量组(ZHW-H)：db/db小鼠，2g/kg，n＝15。
分组完成后分笼，各组均为每笼2或3只小鼠。此后每天对小鼠灌胃给药，并在每周固定时间对小鼠的体重、血糖等指标进行检测。试验周期9周。
试验结束后，将小鼠断颈处死，解剖后迅速取出肩胛处的褐色脂肪组织(BAT)。对BAT进行苏木精-伊红(Hematoxylin&eosin H&E)染色。从上述试验动物皮下周围与肩胛处取出的BAT由生理盐水清洗后迅速用4％多聚甲醛固定，24小时后用乙醇及二甲苯分别浸泡2小时，随后用石蜡包埋处理。将包埋处理后的组织切成4μm厚度的切片，晾干后烘干备用。
苏木精为碱性染料，易与细胞内的脱氧核糖核酸结合，使细胞核呈现出蓝紫色，故通过此染料可观察动物组织内细胞核。伊红为酸性染料，易与细胞质内的蛋白质结合，使得细胞质呈现出粉色，通常用此染料观察组织内细胞轮廓。H&E染色步骤如下：
二甲苯浸泡3次，每次10min；
分别用无水乙醇、95％与80％乙醇以及去离子水浸泡2次，每次5min；
0.5％的苏木素溶液染色5min；
去离子水(DDH2O)清洗5min，1％盐酸酒精溶液清洗5s，再用DDH2O清洗15min。
1％伊红溶液染色1min；
依次使用80％乙醇、95％乙醇、二甲苯浸泡2次，每次5min；
用中性树胶封片，并在显微镜下观察。
组织切片通过NanoZoomer 2.0-HT数字切片扫描仪扫描，并用image J半定量处理以观察组织病理学变化。随机选取面积为0.01mm2的圆，对该区域内的细胞进行计数，以该区域细胞数与面积的比值作半定量结果。
2.结果
在整个试验过程中，小鼠体重前期呈现缓慢上升趋势，db/db小鼠体重显著高于正常对照组。给药前期中药组合物各剂量组小鼠体重与模型组差异不大，但试验后期中药组合物中、高剂量组小鼠体重显著低于模型对照组(表1)，最终在9周后，模型对照组的小鼠增加了10.7g体重，而中、高剂量组的小鼠分别仅增加了6g和5.6g体重，使得体重增长速率降低了约44.0％和47.6％，表明本发明中药组合物具有显著减肥效果。
表1动物体重变化(g:Mean+SD)
(ZHW-L：中药组合物低剂量组；ZHW-M：中药组合物中剂量组；ZHW-H：中药组合物高剂量组。n＝15。模型组与空白组比较###p<0.001，给药组与模型组比较*p<0.05。)
小鼠的褐色脂肪组织是体内非颤抖性产热组织，其主要作用是将脂肪组织动员起来转化为能量而被机体利用，其产热效果与脂肪细胞的数量与形态密切相关，即脂肪细胞数量越多，产热效果越好，越有利于减轻体重。
通过组织形态学分析探究本发明中药组合物对db/db小鼠脂肪组织产热的影响，如图1a所示，正常组小鼠褐色脂肪细胞形状规则，排列密集；对照组褐色脂肪细胞相比于正常组面积明显增大，单位面积内的细胞数量变少。在中药组合物的影响下，褐色脂肪细胞面积相比于对照组显著降低，单位面积内细胞数增多，细胞形态恢复。半定量结果表明(图1b)，中药组合物增加糖尿病小鼠褐色脂肪细胞数量的作用与阳性药二甲双胍相当，甚至比阳性药二甲双胍的效果更好一些，并通过该作用恢复褐色脂肪组织的产热功能。
实施例7：本发明中药组合物对成熟脂肪细胞脂质积累的影响
1.材料与方法
1.1材料
3T3-L1前脂肪细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。改良油红O染色试剂盒购自碧云天生物技术公司。甘油三酯(TG)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
中药组合物采用实施例3制备的未加辅料的提取物。
1.2方法
(1)脂肪细胞内甘油三酯检测
种6孔板并诱导完成细胞分化，在DMⅠ、DMⅡ和BMⅡ内加入不同浓度的中药组合物(0-1000μg/mL)，培养至第6天时收集细胞。取适量的1％TritonX-100裂解液悬浮细胞沉淀，冰上裂解30min。BCA(二喹啉甲酸)试剂盒的原理为双缩脲反应，蛋白质在碱性条件下将二价铜离子还原为一价铜离子，而BCA能够螯合一价铜离子生成蓝紫色物质并在562nm处产生吸收峰。取部分裂解好的液体，4℃下离心10min，离心速度为12000rpm，离心后吸取上清液通过BCA试剂盒测定样品的蛋白浓度。甘油三酯在脂蛋白酶作用下分解为甘油与脂肪酸，甘油在甘油激酶催化下转变为甘油磷酸，甘油磷酸进一步在甘油磷酸酶作用下生成H2O2，最后在过氧化物酶作用下与4-氨基安替比林(4-AA)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(ESPAS)反应生成红色醌化物。取未离心的裂解体系，采用TG试剂盒，用酶标仪测定体系在510nm波长处的吸光度，按照下式计算各组甘油三酯(TG)的相对含量。
其中，OD为吸光度，C标准为标准品蛋白质浓度，Cpr为待测样品蛋白浓度，单位gprot/L。
(2)脂肪细胞中脂滴的油红O染色分析
油红O是一种脂溶性偶氮染料，能特异性地使细胞或组织内甘油三脂等中性脂质染色，而对磷脂和类固醇等脂质的染色效果较弱。当细胞或组织切片浸入油红O染色液时，油红O可溶于细胞或组织内的脂肪(如脂滴)中，使其呈红色或橙红色。可通过显微镜观察组织或细胞内的染色情况，比较各组甘油三酯积累的差异。在染色后可用40％-60％异丙醇提取脂质，测定染料在510nm处的吸光度进行定量比较。
利用改良油红O试剂盒测定脂肪细胞内的脂质积累。种48孔板并完成细胞分化，在DMⅠ、DMⅡ和BMⅡ内加入不同浓度的中药组合物(0-1000μg/mL)，在培养至第6天时，吸出BMⅡ并弃去，用PBS润洗两遍。加入4％的多聚甲醛在37℃培养箱中固定10min，吸除多聚甲醛，用PBS漂洗两次。加入试剂盒中的染色洗涤液覆盖细胞20s以避免干扰，然后吸除染色洗涤液并加入改良油红O染液，在培养箱中染色20-30min。染色完毕后，吸除染液并加入染色洗涤液静置30s，取出洗涤液并用PBS润洗两次。用适量PBS溶液均匀覆盖细胞，在偏光相差显微镜下拍照。拍照完毕后，吸除PBS并加入60％的异丙醇溶液，将细胞内的油红O染液溶出细胞，用酶标仪检测溶液在510nm波长处的吸光度。
2.结果
3T3-L1前脂肪细胞在分化为成熟脂肪细胞后会积累脂滴。脂滴是脂肪细胞内细胞器，主要功能是调节中性脂类(包括甘油三酯和胆固醇酯)的储存和水解。由于脂滴主要是由甘油三酯(TG)构成的，通过测定细胞内的TG可研究中药组合物对脂质积累的影响。3T3-L1成熟脂肪细胞与含不同浓度的中药组合物分化培养基共孵育6天后，测定各组甘油三酯含量。
如图2所示，分化后细胞内TG含量相比于未分化组显著增加，说明成熟脂肪细胞模型成功构建。相比于对照组，加入中药组合物后，细胞内TG含量均显著降低，说明本发明中药组合物可以显著抑制脂肪细胞内甘油三酯的积累。
此外，改良油红O染料可对脂滴进行染色，因此可在显微镜下观察中药组合物对脂肪细胞内的脂滴数量的影响。图3(a)为3T3-L1细胞与脂肪细胞经过油红O染色后在偏光相差显微镜500倍镜下所拍摄的照片。未加分化培养基DM的细胞呈明显的纤维长条状，而分化后细胞呈不规则形状，多呈椭圆状，并可观察到红色的小脂滴。对于成熟脂肪细胞，随着中药组合物浓度的增加，视野中红色逐渐消失，说明细胞内脂滴数目逐渐减少。进一步，将脂肪细胞内的油红O染料溶出后使用酶标仪检测各组吸光度，定量分析脂滴含量。如图3(b)所示，随中药组合物浓度增大，相关吸光度下降，说明脂肪细胞内的脂滴含量减少，这与甘油三酯含量的结果相印证。因此，定性定量结果均表明本发明中药组合物可以显著降低成熟脂肪细胞的脂质积累。
实施例8：本发明中药组合物对脂肪细胞脂质代谢的调控作用。
1.材料与方法
1.1材料
3T3-L1前脂肪细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司。RNAprep Pure培养细胞总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR试剂盒和Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。一抗和二抗购自Abcam plc.和武汉爱博泰克生物科技有限公司。
中药组合物采用实施例5制备的未加辅料的提取物。
1.2方法
采用天根RNAprep Pure培养细胞总RNA提取试剂盒提取RNA，检测RNA浓度并进行逆转录。按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒提供的方法配制实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)的体系。对细胞内蛋白进行提取并采用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测细胞内蛋白的表达情况。
2.结果
研究表明，AMPKα信号通路在脂肪水解过程中起着关键作用。激活AMPKα信号通路可以增加脂肪细胞内脂肪酶的分泌，其中包含脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)和脂蛋白脂肪酶(LPL)，从而促进细胞对脂质存储的利用。ATGL和HSL分解脂肪细胞脂滴内的甘油三酯，生成脂肪酸，同时脂肪细胞分泌的LPL分解血管内极低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯，降低血脂。
在本发明中药组合物的作用下，磷酸化的AMPKα蛋白含量增多(图5a,e)，说明中药组合物激活了细胞AMPKα信号通路。同时，如图所示，中药组合物显著提高了ATGL的mRNA(图4a)与蛋白(图5b)表达水平、LPL的mRNA(图4b)与蛋白(图5c)表达水平和HSL的蛋白(图5d)表达水平。
此外，中药组合物对ATGL、HSL与LPL蛋白表达水平的上调作用比对FAS表达水平的上调作用更加显著，说明中药组合物对脂质分解过程的促进作用强于对脂肪酸生物合成过程的促进作用，有效抑制脂肪细胞内的脂质积累，与动物试验褐色脂肪组学的结果相佐证。综上所述，本发明中药组合物可通过激活AMPKα信号通路加速脂肪细胞内与血液中的脂肪分解过程，平衡脂肪细胞的新陈代谢，由此治疗代谢性不健康肥胖(MUO)。
本发明已经通过上述实施例进行了说明。但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。本领域技术人员根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。

Claims (10)

1.一种中药组合物，其特征在于，包括原料药材或其提取物，其中所述原料药材包括：
泽泻100～500重量份；
灵芝500～1000重量份；
荷叶1000～2000重量份；
山楂100～500重量份；
金银花500～1000重量份；
其中，上述五种原料药材或其提取物的总重量占所述中药组合物的60wt％以上。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述原料药材包括：
泽泻150～450重量份；
灵芝600～1000重量份；
荷叶1200～1800重量份；
山楂150～500重量份；
金银花500～1000重量份。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述原料药材包括按照原料药材的总重量计的以下成分：
泽泻1wt％～10wt％；
灵芝15wt％～30wt％；
荷叶30wt％～55wt％；
山楂3wt％～20wt％；
金银花10wt％～30wt％。
4.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述原料药材包括按照原料药材的总重量计的以下成分：
泽泻2wt％～9wt％；
灵芝17wt％～28wt％；
荷叶32wt％～50wt％；
山楂5wt％～18wt％；
金银花12wt％～30wt％。
5.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述原料药材提取物包括(a)灵芝的水提取物，以及(b)泽泻、荷叶、山楂和金银花的醇提取物。
6.如权利要求5所述的中药组合物，其特征在于，所述灵芝的水提取物是用水提醇沉法制备的提取物；所述泽泻、荷叶、山楂和金银花的醇提取物是用醇提，然后经大孔吸附树脂吸附，醇解吸附制备的。
7.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述原料药材提取物通过以下方法制备，所述方法包括步骤：
(1)提供一定质量配比的泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的原料药材；
(2)取灵芝用水提取得水提液，加乙醇醇沉，分离得到沉淀，加水复溶，超滤，收集超滤液，浓缩得到灵芝清膏；
(3)取泽泻、荷叶、山楂和金银花经醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附，醇解吸附，将解吸液浓缩成清膏；
(4)合并步骤(2)得到的灵芝清膏和步骤(3)得到的清膏得到所述提取物。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
(1)如权利要求1所述的中药组合物；和
(2)药学上可接受的载体。
9.一种如权利要求1所述的中药组合物的应用，其特征在于，用于制备一药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗肥胖。
10.一种原料药材提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提供一定质量配比的泽泻、灵芝、荷叶、山楂和金银花的原料药材；
(2)取灵芝用水提取得水提液，加乙醇醇沉，分离得到沉淀，加水复溶，超滤，收集超滤液，浓缩得到灵芝清膏；
(3)取泽泻、荷叶、山楂和金银花经醇提取得醇提液并浓缩，然后经大孔吸附树脂吸附，醇解吸附，将解吸液浓缩成清膏；
(4)合并步骤(2)得到的灵芝清膏和步骤(3)得到的清膏得到所述提取物；
其中，所述原料药材包括：
泽泻100～500重量份；
灵芝500～1000重量份；
荷叶1000～2000重量份；
山楂100～500重量份；
金银花500～1000重量份。
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