CN116718781A - 重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法，包括以下步骤：步骤1、细胞培养；步骤2、孔板包被、封闭：对rhVTN进行浓度梯度稀释，包被未做过组织培养处理的12孔板，包被至少2个小时后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；步骤3、消化步骤1中的细胞，将其接种到步骤2中的12孔板；步骤4、接种22~24小时后，弃培养基，清洗一遍后加入培养基用克隆选择成像仪扫描孔板检测细胞汇合度，导出汇合度数据计算rhVTN的半数有效浓度值确定促细胞贴壁活性。本发明所使用的方法具有检测背景低、重复性好，检测方法简单、快速等优点，尤其适用于rhVTN的生物学活性检测及质量标准的建立。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品质量检测分析领域，具体为重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法。
背景技术
玻连蛋白（Vitronectin，缩写为VN或者VTN）是一种存在于血液循环和不同组织中的多功能黏附糖蛋白。玻连蛋白在血液、羊水、尿液中的浓度约为0.25~0.45mg/mL。与纤连蛋白不同，玻连蛋白在血清中的浓度与血浆中的浓度没有显著差异。
玻连蛋白由两条单链的糖蛋白（65kD和75kD）组成，通过Arg-Gly-Asp（RGD）序列介导与特异性的细胞表面受体如整联素αVβ3和αVβ5等结合，可促进细胞贴附，在组织重塑中发挥关键作用。玻连蛋白对于多种正常细胞及癌细胞的分化有调节作用，可用于细胞迁移实验的研究。
由于玻连蛋白能够协助贴壁细胞粘附在培养表面上，因而被广泛应用于干细胞的传代培养以及3D类器官的培养。多能干细胞的无饲养层培养常用的包被基质是富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取的基底膜基质（Matrigel），然而动物来源、成分不明确导致基底膜基质不能应用于临床级别的多能干细胞培养。研究发现，重组玻连蛋白可替代基底膜基质用于多能干细胞的连续传代培养，同时不会影响细胞的分化潜能。
综上，重组玻连蛋白在干细胞治疗和3D类器官领域具有广泛的应用前景。不过，重组蛋白的生物学活性容易受到批间生产工艺、运输条件、保存条件等因素的影响，使用前需要定量检测生物学活性。目前《中国药典》等法规中尚未收录重组玻连蛋白的生物学活性检测方法，需要企业自行开发。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种重组人玻连蛋白（rhVTN）的促细胞贴壁活性检测方法，以弥补现有技术的不足。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法，包括以下步骤，
步骤1、将小鼠胚胎成纤维细胞培养至对数生长期；
步骤2、使用DPBS对重组人玻连蛋白进行浓度梯度稀释，共10个浓度梯度，分别是0μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，包被未做过组织培养处理的12孔板，包被至少2个小时后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、消化所述步骤1中的小鼠胚胎成纤维细胞，用含有终浓度为0.25g/L泊洛沙姆188的CE01培养基重悬后接种到所述步骤2中的12孔板，接种密度为5×105细胞数/mL，每孔接种1mL，培养22~24小时；
步骤4、弃所述步骤3中12孔板的培养基，清洗一遍后加入含有终浓度为0.25g/L泊洛沙姆188的CE01培养基，用克隆选择成像仪扫描孔板检测细胞汇合度，导出汇合度数据计算重组人玻连蛋白的EC50值，根据EC50值判断重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性；
具体计算过程为：以重组人玻连蛋白浓度值为横坐标，对应的汇合度为纵坐标，使用GraphPad Prism 8绘制图表，使用四参数计算EC50值；
其中：Y=基线响应值+（最大响应值-基线响应值）/（1+10（（LogEC50-X）×曲线斜率）），
Y代表汇合度，
X代表重组人玻连蛋白浓度值。
优选的，其特征在于，所述步骤1中使用的培养基为：含有10%FBS的DMEM培养基。
优选的，其特征在于，所述步骤1和所述步骤3中的培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
本发明的有益效果：本发明所使用的方法具有检测背景低、重复性好，检测方法简单、快速等优点，尤其适用于rhVTN的生物学活性检测及质量标准的建立。
本发明的关键创新点是使用高内涵设备克隆选择成像仪检测细胞汇合度，根据汇合度拟合四参数曲线来检测rhVTN的生物学活性；该方法检测时间短，仅需要2天，使用高内涵设备扫描细胞汇合度时间短，五分钟内即可完成扫描，相比细胞计数可节约大量的时间和人力。
采集的数据为细胞汇合度，比细胞计数更直接的反应细胞的贴壁状态，同时节省时间和人力；将细胞接种到非组织培养处理的12孔板中，排除了培养介质表面的亲水性差异对实验结果的影响；检测体系中加入泊洛沙姆188，阻止了细胞表面的细胞外基质导致的细胞贴壁，使细胞贴壁完全依赖包被在孔板上的rhVTN，从而获得拟合效果好的、本底值低的rhVTN剂量依赖汇合度增加曲线。
本发明的作用机理：本发明提供了重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法，包括以下步骤：步骤1：细胞培养；步骤2：孔板包被、封闭：对rhVTN进行浓度梯度稀释，包被未做过组织培养处理的12孔板，包被至少2个小时后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；步骤3：消化步骤1中的细胞，将其接种到步骤2中的12孔板；步骤4：接种22~24小时后，弃培养基，清洗一遍后加入培养基用克隆选择成像仪扫描孔板检测细胞汇合度，导出汇合度数据计算rhVTN的半数有效浓度( concentration for 50％ of maximal effect，EC50)值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明实施例1的汇合度曲线；
图2是本发明实施例2的汇合度曲线；
图3是本发明实施例3的汇合度曲线；
图4是本发明实施例4的汇合度曲线；
图5是本发明实施例5的汇合度曲线；
图6是本发明实施例6的汇合度曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、实验试剂和实验设备：
胎牛血清（FBS）（厂家：依科赛生物，货号：FND500）；
DMEM培养基（厂家：西格玛Sigma货号：D5648）；
BALB/3T3 clone A31细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，厂家：普诺赛，货号：CL-0477）；
CE01培养基（厂家：依科赛生物，货号：CE000-N032）；
实施例3对照品（厂家：依科赛生物，货号：CB00H-4037，批号：32K316）；
实施例3供试品1（厂家：依科赛生物，货号：CB00H-4037，批号：32K418）；
实施例3供试品2（厂家：依科赛生物，货号：CB00H-4037，批号：32K424）；
实施例3供试品3（厂家：依科赛生物，货号：CB00H-4037，批号：32K428）；
未做组织培养处理的12孔板（厂家：洁特，货号：TCP001012）；
克隆选择成像仪（CloneSelect Imager）（厂家：美谷分子仪器（上海）有限公司）。
二、实验方法：
本发明提供的rhVTN的促细胞贴壁活性检测方法，包括以下步骤：
步骤1、细胞培养：在含有10%FBS的DMEM培养基中将ALB/3T3 clone A31细胞培养至对数生长期，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度；
步骤2、孔板包被、封闭：使用DPBS对rhVTN进行浓度梯度稀释，共10个浓度梯度，分别是0μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，包被未做过组织培养处理的12孔板，包被至少2个小时后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；该浓度梯度保证rhVTN生物学活性的检测曲线符合典型的S型曲线，具有良好的信噪比；
步骤3、消化步骤1中的细胞：用CE01培养基重悬后接种到步骤2中的12孔板，接种密度为5×105细胞数/mL，每孔接种1mL，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度；
步骤4、接种22~24小时后，弃培养基，清洗一遍后加入CE01培养基用克隆选择成像仪扫描孔板检测细胞汇合度，导出汇合度数据计算rhVTN的EC50；计算rhVTN生物学活性的方法为：以rhVTN浓度值为横坐标，对应的汇合度为纵坐标，使用GraphPad Prism 8绘制图表，使用四参数计算计算EC50值；对rhVTN浓度值做以10为底的对数变换，Y=基线响应值+（最大响应值-基线响应值）/（1+10（（LogEC50-X）×曲线斜率））。
三、实施例和实验结果：
下面结合具体实施例对本发明进行具体说明。
实施例1、rhVTN浓度筛选：
步骤1、BALB/3T3 clone A31细胞培养：
使用含有10％FBS的DMEM培养基，于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养BALB/3T3 clone A31细胞，每周传代2-3次；
步骤2、包被孔板：
将rhVTN样品用DPBS稀释至终浓度为40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.001μg/mL、0μg/mL，分别加入1mL到未做过组织培养处理的12孔板的1孔中，每个浓度做2个复孔，放入到37℃、5％CO2的培养箱中孵育2个小时，然后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、BALB/3T3 clone A31细胞接种：
取步骤1中处于对数生长期的BALB/3T3 clone A31细胞，吸弃培养基，用DPBS清洗1次，加入胰蛋白酶消化细胞，将培养瓶置于显微镜下观察，待细胞全部变圆后，加入含有10％FBS的DMEM培养基终止消化，并收集细胞；
步骤4、将步骤3中收集的细胞，300g离心3分钟，用含有终浓度为0.25g/L的泊洛沙姆188的CE01培养基重悬细胞沉淀，计数，细胞活率应≥95％，将细胞稀释到浓度为5×105细胞数/mL，弃掉步骤2的12孔板中的0.1%BSA，每孔接种1mL细胞悬液，置于37℃，5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养22~24小时。
检测与分析：
将步骤4中的细胞弃培养基，清洗一遍后加入CE01培养基用克隆选择成像仪扫描孔板检测细胞汇合度，模式为图形微孔板（Image Microplate），孔板类型为洁特12孔板（JET 12 well plate），选择细胞检测方法2（Cell Detection method 2），焦距约为1680，导出检测得到的汇合度；以rhVTN浓度值为横坐标，对应的汇合度为纵坐标，绘制图表。
结果分析：
检测结果如图1所示，当rhVTN的浓度在0.1μg/mL~10μg/mL时，rhVTN浓度与细胞的汇合度呈线性递增关系，当rhVTN≥40μg/mL时，细胞的汇合度不再增加，因而检测rhVTN的生物学活性的上样起始浓度为10μg/mL。
实施例2、检测方法的重复性验证：
步骤1、参照实施例1；
步骤2、将rhVTN样品用DPBS稀释至终浓度为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.001μg/mL、0μg/mL，分别加入1mL到未做过组织培养处理的12孔板的1孔中，每个浓度做2个复孔，放入到37℃、5％CO2的培养箱中孵育2个小时，然后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、参照实施例1；
步骤4、参照实施例1。
检测与分析：
将步骤4中的细胞放置于克隆选择成像仪中检测，模式为图形微孔板（ImageMicroplate），孔板类型为洁特12孔板（JET 12 well plate），选择细胞检测方法2（CellDetection method 2），焦距约为1680，导出检测得到的汇合度；按照以上步骤重复3次实验（实验1、实验2、实验3）。以rhVTN浓度值为横坐标，对应的汇合度为纵坐标，绘制图表。
结果分析：
表1
检测结果见表1和图2，EC50平均值为（0.458±0.034）μg/mL，变异系数CV为7.41%，＜30％，在常规要求范围内；以上结果表明，本发明的检测方法具有良好的重复性。
实施例3、检测方法的重现性验证：
步骤1、参照实施例1；
步骤2、选取3个不同批次的rhVTN样品(分别标示为：供试品1、供试品2和供试品3)，以对照品为标准品，分别用DPBS稀释至终浓度为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.001μg/mL、0μg/mL，分别加入1mL到未做过组织培养处理的12孔板的1孔中，每个浓度做2个复孔，放入到37℃、5％CO2的培养箱中孵育2个小时，然后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、参照实施例1；
步骤4、参照实施例1。
检测与分析：参照实施例1。
结果分析：
表2
测定rhVTN样品的相对生物学活性，实验得到对照品的EC50值为0.674μg/mL，按以下计算公式计算待测样品的相对生物学活性：待测样品的相对生物学活性（％）＝标准EC50（μg/mL）÷待测品的EC50（μg/mL）×100％，结果见表2和图3，其中供试品1的相对活性为91.83%、供试品2的相对活性为115.41%、供试品3的相对活性为90.71%，均在75%~125%的范围内。以上结果表明，本发明检测方法的重现性高。
实施例4、包被组织培养处理的孔板和未做组织培养处理的孔板比较：
步骤1、参照实施例1；
步骤2、包被组织培养处理的孔板和未做组织培养处理的孔板：
将rhVTN样品用DPBS稀释至终浓度为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.001μg/mL、0μg/mL，分别加入1mL到包被组织培养处理的12孔板和未做组织培养处理的12孔板的1孔中，每个浓度做2个复孔，放入到37℃、5％CO2的培养箱中孵育2个小时，然后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、参照实施例1；
步骤4、参照实施例1。
检测与分析：参照实施例1。
结果分析：
表3
检测结果见表3和图4，当将细胞接种到组织培养处理的12孔板时本底值升高，降低了检测的信噪比；组织培养处理的12孔板由于存在表面亲水处理后亲水角的板内差，检测数据的误差线高于非处理的12孔板，因而未做组织培养处理的孔板更适于检测rhVTN的促细胞贴壁活性。
实施例5、泊洛沙姆188的浓度选择：
步骤1、参照实施例1；
步骤2、参照实施例2；
步骤3、BALB/3T3 clone A31细胞接种：
取步骤1中处于对数生长期的BALB/3T3 clone A31细胞，吸弃培养基，用DPBS清洗1次，加入胰蛋白酶消化细胞，将培养瓶置于显微镜下观察，待细胞全部变圆后，加入含有10％FBS的DMEM培养基终止消化，并收集细胞；
将步骤3中收集的细胞，300g离心3分钟，分别用含有终浓度为0g/L、0.25 g/L、0.5g/L的泊洛沙姆188的CE01培养基重悬细胞沉淀，计数，细胞活率应≥95％，将细胞稀释到浓度为5×105细胞数/mL，弃掉步骤2的12孔板中的0.1%BSA，每孔接种1mL细胞悬液，置于37℃，5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养22~24小时。
检测与分析：参照实施例1。
结果分析：
表4
检测结果见表4和图5，当泊洛沙姆188的浓度为0g/L时，不包被rhVTN的孔中会有少量细胞贴壁，本底值升高，降低了检测的信噪比；当泊洛沙姆188的浓度为0.5g/L时对细胞的贴壁产生了干扰，汇合度峰值降低，导致信噪比降低。
实施例6、rhVTN不同浓度值的比较：
步骤1、参照实施例1；
步骤2、将rhVTN样品用DPBS稀释至终浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.078μg/mL、0.039μg/mL、0μg/mL，分别加入1mL到未做过组织培养处理的12孔板的1孔中，每个浓度做2个复孔，放入到37℃、5％CO2的培养箱中孵育2个小时，然后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、参照实施例1；
步骤4、参照实施例1。
检测与分析：参照实施例2。
结果分析：
表5
检测结果见表5和图6，变异系数CV为34.27%，＞30％，超过了常规接受的范围；以上结果表明，本实施例选择的10个浓度梯度值，不能满足本方法对重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性的检测。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程方法物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程方法物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤1、将小鼠胚胎成纤维细胞培养至对数生长期；
步骤2、使用DPBS对重组人玻连蛋白进行浓度梯度稀释，共10个浓度梯度，分别是0μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，包被未做过组织培养处理的12孔板，包被至少2个小时后弃掉液体，加入0.1%BSA封闭至少30分钟；
步骤3、消化所述步骤1中的小鼠胚胎成纤维细胞，用含有终浓度为0.25g/L泊洛沙姆188的CE01培养基重悬后接种到所述步骤2中的12孔板，接种密度为5×105细胞数/mL，每孔接种1mL，培养22~24小时；
步骤4、弃所述步骤3中12孔板的培养基，清洗一遍后加入含有终浓度为0.25g/L泊洛沙姆188的CE01培养基，用克隆选择成像仪扫描孔板检测细胞汇合度，导出汇合度数据计算重组人玻连蛋白的EC50值，根据EC50值判断重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性；
具体计算过程为：以重组人玻连蛋白浓度值为横坐标，对应的汇合度为纵坐标，使用GraphPad Prism 8绘制图表，使用四参数计算EC50值；
其中：Y=基线响应值+（最大响应值-基线响应值）/（1+10（（LogEC50-X）×曲线斜率）），
Y代表汇合度，
X代表重组人玻连蛋白浓度值。
2.根据权利要求1所述的重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法，其特征在于，所述步骤1中使用的培养基为：含有10%FBS的DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的重组人玻连蛋白的促细胞贴壁活性检测方法，其特征在于，所述步骤1和所述步骤3中的培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
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