CN116716192A - 一株拟康氏木霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株拟康氏木霉TZ2107RHs2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCCNo.40332。本发明还公开了其在预防苍术根腐病中的应用及在促进苍术根茎发育及地下部分生物量累积中的应用。本发明拟康氏木霉TZ2107RHs2处理不仅可以高效降低根腐病导致的植株死亡率，而且有保障药材生物量提升后品质不劣化的巨大的潜力，克服中药材种植过程中施用化肥导致生物量提升但药效成分产量大幅降低、品质劣化的困难。

Description

一株拟康氏木霉及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株拟康氏木霉TZ2107RHs2及其应用。

背景技术

苍术(Atractylodes lancea)是菊科苍术属多年生植物，其根茎部位入药，是我国传统大宗中药材。当今苍术的市场需求量大，有巨大经济价值，其来源极大依赖于种植，种植区域在我国分布广泛，北至内蒙古北部、南至长江流域均可种植。但是我国苍术种植实践中大范围存在根腐病导致苍术减产、品质下降的难题，主要表现为生长期内根茎局部腐烂，严重时大部分腐烂、乃至植株死亡，尤其是苍术多年生的特征以及需连续栽培2年以上方可采收的特征，所导致的连作障碍常使大田中根腐病发病及其所造成的损失率逐年上升，一些种植区域的根腐病发病率可高达约50％。

《中华人民共和国中医药法》第二十二条规定严格管理农药、肥料等农业投入品在中药材种植中的使用，第二十三条并建议加强道地中药材生产基地生态环境保护。基于此，本发明提供一株拟康氏木霉，使用该拟康氏木霉对栽培前的苍术幼苗进行诱导处理后再栽培入土，从而使苍术植株在幼苗期即提升对土壤中根腐病原菌的抵御能力，可在不使用任何农药及肥料的条件下，大幅提升苍术植株种植于含根腐病原菌土壤中的存活率；另外，可提升种植于不含大量根腐病原菌的正常土壤中后苍术根茎发育及地下部分生物量累积。

发明内容

本发明的目的是提供一株拟康氏木霉TZ2107RHs2及其应用，以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一株拟康氏木霉TZ2107RHs2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCC No.40332。

本发明第二方面提供了上述拟康氏木霉TZ2107RHs2在预防苍术根腐病中的应用。

本发明第三方面提供了上述拟康氏木霉TZ2107RHs2在促进苍术根茎发育及地下部分生物量累积中的应用。

本发明的有益效果：

1.拟康氏木霉TZ2107RHs2对环境友好，采用其对栽培入土前的苍术幼苗进行诱导处理，无需任何其他药剂施用，即可使苍术从苗期即提升根腐病抵御力。

2.拟康氏木霉TZ2107RHs2能定植在苍术苗根表面，仅经一次种植前的诱导处理，其防根腐病效果明显，诱导后的苍术苗发病率降为0。

3.经拟康氏木霉TZ2107RHs2诱导的苍术苗根茎发育较快，根茎膨大速率提升，且地下部分生物量(鲜重和干重)累积量提升。

4.拟康氏木霉TZ2107RHs2诱导同时保障了地下部分干物质中的苍术酮浓度，使苍术酮产量提升，保障了地下部分干物质中的苍术素的产量。本发明拟康氏木霉TZ2107RHs2诱导不仅有提升苍术药材产量的潜力，且能保障药材中药效成分含量，即保障药材品质。

5.本发明获得的拟康氏木霉TZ2107RHs2为江苏省分离所得的木霉菌株，适合应用到江苏省及附近的苍术栽培区域，而此区域正包含苍术的道地产区茅山，本土木霉菌用于道地产区的苍术幼苗，可保障木霉与宿主植物匹配潜力高，且木霉对本土气候的适应力强，更容易发挥作用。

6.本发明拟康氏木霉TZ2107RHs2发酵液的制备及诱导处理方法简单，无需生物专业实验室设备，便于在农村田间等开展诱导处理操作，不具备生物学专业知识的药农及工人等也可完成便捷的诱导处理。

7.本发明拟康氏木霉TZ2107RHs2处理不仅可以高效降低根腐病导致的植株死亡率，而且有保障药材生物量提升后品质不劣化的巨大的潜力，克服中药材种植过程中施用化肥导致生物量提升但药效成分产量大幅降低、品质劣化的困难。

附图说明

图1为TZ2107RHs2菌株对苍术根腐病原菌的抑菌率(Fo＝Fusarium oxysporum，Fs＝Fusarium solani)。

图2为TZ2107RHs2菌株的图片。

图3为TZ2107RHs2菌株的显微特征(从上之下依次展示厚壁孢子、分生孢子、瓶梗)。

图4为基于ITS序列构建的进化树。

图5为苍术幼苗用木霉菌剂浸根24h后的图片。

图6为不同处理下生长15天和50天后的苍术幼苗(地上部)。

图7为不同处理下生长50天后的苍术幼苗(整株及根茎)。

图8为不同处理下生长50天后苍术幼苗的生物量测定(其中，相对含水率＝(地下部分鲜重-地下部分干重)/地下部分鲜重)。

图9为不同处理下生长50天后苍术幼苗地下部分干物质中的苍术酮含量和苍术素含量(右图星号表示与CK相比有显著差异(P<0.05)；ns表示无显著差异)。

生物材料保藏信息

拟康氏木霉TZ2107RHs2，分类命名，Trichoderma koningiopsis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCC No.40332。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

实施例1菌株的筛选及鉴定

在2021年夏季从江苏省镇江市郊林区采集了野生苍术根茎的根际土壤，从中分离得到TZ2107RHs2菌株，具体如下：戴崭新无菌手套，将苍术样品根部泥土移出，留下紧贴根部的根际土；使用崭新无菌手术刀片将须根切除，剩余的根茎装入灭菌塑料瓶并加入刚好没过材料的无菌水，封口，25℃、200rpm摇48小时。在无菌超净台内取10μL液体，使用无菌水稀释至200μL，均匀涂布在孟加拉红平板上，静置于30℃黑暗温箱培养48小时。观察平板，在超净台中将形态类似木霉的菌落小心挑到PDA平板上，从菌落边缘挑起，以确保所得的是单一菌株。静置于30℃恒温箱培养。培养5天后，从挑取的菌株中挑选菌落像木霉、生长快速、产孢快速的菌株进行ITS测序鉴定。把鉴定为木霉的菌种分别与2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum，腐皮镰刀菌Fusarium solani)进行对峙培养，最终筛选得到抑菌率高的木霉菌株TZ2107RHs2。

TZ2107RHs2菌株与2株苍术根腐病原菌(尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani)对峙培养，操作如下：在PDA平板的一条直径线上相距9cm且各自与平皿边缘等距的两点处分别接种(摆放)木霉PDA菌饼与病原菌PDA菌饼(木霉PDA菌饼与病原菌PDA菌饼都是由打孔器取自培养至菌丝密布全皿的PDA培养物边缘，直径5mm)，倒置于30℃恒温箱，在黑暗中静置培养9天后观察结果，测量病原菌菌落直径。对照组不接种木霉PDA菌饼。抑菌率＝(对照组直径-实验组直径)÷对照组直径×100％。结果如图1所示，验证TZ2107RHs2菌株具有直接抑制苍术根腐病原菌生长的作用。

TZ2107RHs2菌株经形态鉴定(图2、图3)及基于ITS序列构建的进化树(如图4所示，其是通过NCBI blast查到score前5的序列，使用https://www.phylogeny.fr工具生成的进化树(bootstrap＝100))鉴定，其为拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)，并已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40332。

实施例2菌株的功能验证

本实验是在位于北京市东城区的中国中医科学院中药资源中心实验室条件下完成的。本实验使用的苍术幼苗(苍术组培苗)是中国中医科学院中药资源中心培育的，是将2019年采集于江苏省常州市金坛区金牛洞山(31°46′37″N，119°18′52″W)的野生苍术种子经一系列处理最终培育并建立的的苍术苗无性繁殖体系(https://doi.org/10.1007/s11104-022-05369-6)。

2.1制备拟康氏木霉TZ2107RHs2的发酵液，作为用于诱导的木霉菌剂

(1)制备PDA平板，将拟康氏木霉TZ2107RHs2接种于PDA平板中心。

(2)在20至30℃下培养至菌丝铺满PDA平板。

(3)将马铃薯浸粉培养基(3g马铃薯浸粉/L，20g工业级蔗糖/L)煮沸灭菌后灌入干净的桶中。

(4)将PDA平板中的木霉切碎后投入桶中，在25至35℃下使用带有除菌过滤器的空气泵通气(以2L/分钟以上的速率通气)培养至液体肉眼可见混浊后，继续培养2天以上，当所得的发酵液呈绿色，即可作为木霉菌剂用于诱导处理苍术幼苗。

2.2对苍术幼苗进行诱导(接种)处理

(1)取根长约2cm、苗高(不含根部)约4cm的苍术幼苗，去除苍术幼苗根部的固体培养基，随机分成5组，每组8株苗，将苗用吸水软纸擦干，称量每组内每株苗的鲜重，确保每组间苗的平均鲜重无显著差异(P<0.05)，将苗装入容器(透明杯)使其根部浸泡在无菌水(家用净水机制的水即可)中并给容器加盖防止幼苗干枯，在20至30℃的环境温度下静置炼苗48小时。

(2)将无菌水置换成2.1制备的木霉菌剂，继续在20至30℃的环境温度下静置24小时，即完成了诱导处理。

(3)判断最适接种时长的方法：诱导处理超过18小时后，每隔4小时观察一次，观察方法：将诱导中的幼苗移至透明容器内使其根部浸入清澈的水(无菌水)中，轻轻摇动；若肉眼可见定植于幼苗根部的絮状或丝状物，最长的长度可达约1cm，此时即可停止诱导，将幼苗栽培入土。本发明诱导时间优选24小时，过久的诱导处理反而可能对苍术幼苗的生长产生不良作用。如图5所示，木霉菌剂浸根24小时后，肉眼可见苍术幼苗根部有菌丝附着，轻摇水体可见菌丝锚定在苍术幼苗根部，说明24小时拟康氏木霉TZ2107RHs2即可在苍术幼苗根表面定植成功。

2.3对接种后的苍术幼苗进行生长、抗病能力的观察

(1)取具有活力的尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、腐皮镰刀菌Fusarium solani菌种，各取等量，分别接种入1L经过了高温灭菌的液体土豆培养基(PDB培养基)中，在28℃的恒温下(对光照条件无要求)以200rpm转速持续震荡培养5天。

(2)取混匀后的发酵液在光学显微镜下观察，使用血细胞计数板统计两种菌液浓度(cfu/L)，将两种菌液浓度使用无菌水调节至基本一致后，等体积混合，作为染根腐病处理所使用的病原菌液(浓度为1×10⁹cfu/L)。

(3)取180ml的塑料杯，在杯底部中心灼烧一个直径约5mm的洞，作为育苗容器，在其中填塞手感微湿的灭菌土与蛭石混合物(体积比约2.5:1)至杯与内部的土共重约65g，保障育苗容器内土对苗根部产生的机械压力基本一致。

(4)CK组：将仅经过清水(无菌水)炼苗的苍术幼苗直接栽培入杯土，一杯一苗；Fo+Fs组：在杯土中插入拇指形成浅洞，使用量勺盛取，缓慢向洞中注入约22ml的Fo、Fs混合菌液，稍候几分钟待病原菌液渗入后再将仅经过清水(无菌水)炼苗的苍术幼苗直接栽培入杯土，一杯一苗；Tk_Fo+Fs组：在杯土中插入拇指形成浅洞，使用量勺盛取，缓慢向洞中注入约22ml的Fo、Fs混合菌液，稍候几分钟待病原菌液渗入后再将经木霉菌剂诱导24小时的苍术幼苗栽培入杯土，一杯一苗；Tk(诱导24小时)组：将经木霉菌剂诱导24小时的苍术幼苗栽培入杯土，一杯一苗，再将诱导苍术幼苗使用后的木霉菌剂收集起来，使用量勺盛取，缓慢向苗根部注入约22ml的诱导使用后剩余的木霉菌剂；Tk(诱导60小时)组：将经木霉菌剂诱导60小时的苍术幼苗栽培入杯土，一杯一苗，再将诱导苍术幼苗使用后的木霉菌剂收集起来，使用量勺盛取，缓慢向苗根部注入约22ml的诱导使用后剩余的木霉菌剂。

(5)将不同组的育苗杯分别放入不同托盘，避免通过杯底部漏孔产生的木霉或病原菌交叉污染，给杯土中浇无菌水至饱和，置入人工气候箱，在25℃、70％湿度条件下，给幼苗罩杯保持早期幼苗不受干旱胁迫，保持充分浇水(无菌水)，培养50天，期间观察苍术苗长势及染根腐病处理所导致的死亡率，50天后取样，进行生物量及苍术的四种主要药效成分即苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮、苍术素含量的测定。由于本实验所使用的苍术幼苗种质化学型的原因及实验栽培时长短的原因，培养50天后的幼苗地下部分中测定所得的苍术醇、β-桉叶醇含量过低，故不讨论。

图6生长15天后的苍术幼苗显示，Fo+Fs组苍术幼苗存活率为75％，其余组苍术幼苗存活率均为100％，可见拟康氏木霉TZ2107RHs2可使苍术幼苗进行染根腐病处理后导致的死亡率降低25％，即从25％将至0％，表明拟康氏木霉TZ2107RHs2能提升苍术对土壤中根腐病原菌的抵御能力。图6生长50天后的苍术幼苗和图8植株鲜重、地上部分鲜重显示，Tk(诱导24小时)组苍术幼苗地上部分最茂盛。图7和图8地下部分鲜重、地下部分干重显示，Tk(诱导24小时)组苍术幼苗地下部分生物量(干重和鲜重)最大，且根茎膨大开始最早、最明显，表明拟康氏木霉TZ2107RHs2能提升苍术根茎的发育及地下部分生物量累积。

图9表明，拟康氏木霉TZ2107RHs2诱导同时保障了地下部分干物质中的苍术酮浓度，使苍术酮产量提升，保障了地下部分干物质中的苍术素的产量，说明拟康氏木霉TZ2107RHs2诱导不仅有提升苍术药材产量的潜力，且能保障药材中药效成分含量，即保障药材品质。

Claims (3)

1.一株拟康氏木霉TZ2107RHs2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年10月17日，保藏编号为CGMCC No.40332。

2.权利要求1所述的拟康氏木霉TZ2107RHs2在预防苍术根腐病中的应用。

3.权利要求1所述的拟康氏木霉TZ2107RHs2在促进苍术根茎发育及地下部分生物量累积中的应用。