CN116712538A - 一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶及其在制备流感疫苗黏膜佐剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疫苗技术领域，涉及一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶及其在制备流感病毒疫苗黏膜佐剂中的应用，通过磁力搅拌将三氯化铁彻底溶解于乙二醇中，缓慢加入三水醋酸钠，搅拌并超声助溶直至形成均匀的褐色悬浊液；加入四水氯化锰磁力搅拌并伴随超声至充分溶解，然后再加入支化聚乙烯亚胺，充分搅拌均匀形成悬浊液后，将悬浊液转移至聚四氟乙烯反应釜中进行水热合成，收集悬浊液离心弃上清并洗涤，干燥后得到基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶，该纳米酶类过氧化物酶催化活性显著增强。本发明作为免疫佐剂能够显著增强流感黏膜疫苗的黏膜免疫和系统免疫应答水平，本发明为流感黏膜疫苗的设计提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，涉及一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶及其在制备流感疫苗黏膜佐剂中的应用。
背景技术
流行性感冒是一种由流感病毒引起的急性病毒性的人兽共患传染病，给人类和动物的生命健康带来严重威胁。自1918年爆发H1N1西班牙大流感，造成全球数千万人死亡以来，全球流感疫情时有暴发。疫苗仍然是防控流感的主要方式，包括肌肉注射疫苗和黏膜疫苗，这两种疫苗均能诱导特异性IgG的产生，但肌肉注射方式会产生一定的应激反应，并且其诱导的IgG抗体，往往在病毒大量进入宿主后才可发挥作用。相比之下，黏膜疫苗不仅可以避免肌肉注射产生的应激反应还可以诱导机体在黏膜部位产生特异性SIgA，直接在黏膜表面建立免疫防线，可有效切断病毒的入侵和进一步的散播，同时可以通过“共同黏膜免疫系统”诱导其它黏膜部位建立黏膜免疫应答。因此，黏膜疫苗是克服现有肌注疫苗不足的重要策略。但黏膜疫苗仍存在挑战，鼻腔黏膜是由上皮细胞及覆盖在其表面的纤毛和黏液组成，构成了强大的黏膜屏障。灭活流感病毒由于丧失了在上皮细胞中的复制能力，无法主动地跨越鼻腔黏膜上皮屏障被黏膜下的树突状细胞(Dendritic cells，DCs)所摄取。所以单独的灭活流感疫苗的免疫效果往往不理想。佐剂配合灭活流感疫苗滴鼻免疫后显著提高了宿主的黏膜免疫水平。现有的黏膜疫苗佐剂存在成本高、毒性大以及功能较单一等问题，限制了进一步的临床应用。因此，亟需发明一种成本低、安全性高、能同时具有增强抗原的黏膜黏附力、抗原的跨细胞转运能力及刺激DCs天然免疫能力的新型黏膜佐剂。
纳米酶是一类具有类酶特性的纳米材料，其结合了化学催化剂和天然酶的优点，在生物医学领域中应用广泛。由于Fe3O4纳米酶具有多种类酶的活性，如过氧化物酶和过氧化氢酶等，又被称为氧化铁纳米酶(Iron oxide nanozyme，IONzyme)，前期发现其具有黏膜佐剂特性，但效果仍需提高。锰(Manganese，Mn)是机体必需的微量元素，参与机体多种生理过程，且是多种重要生物酶的催化核心组分，在生命活动中发挥重要作用，其在免疫方面的功能也逐渐被挖掘。支化聚乙烯亚胺(Polyethylenimine branched，PEI)因具有良好的安全性、带有正电荷并且可以递送抗原等优点，已成为有前途的抗原递送载体。因此，在水热条件下将Mn和PEI掺杂到IONzyme表面，从而设计一种新型黏膜免疫佐剂(Mn-PEI-IONzyme)，有望实现粒子表面分布正电荷，过氧化物酶活性增强进而诱导免疫特性增强从而达到作为流感疫苗黏膜佐剂的目的。迄今，尚未有锰和聚乙烯亚胺修饰氧化铁纳米酶佐剂黏膜靶向疫苗的研究报道。
发明内容
本发明的目的是设计新型黏膜免疫佐剂，以显著增强流感黏膜疫苗的黏膜免疫和系统免疫应答水平，本发明为流感黏膜疫苗的设计提供新思路。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶的制备方法，包括以下步骤：通过磁力搅拌将三氯化铁彻底溶解于乙二醇中，缓慢加入三水醋酸钠，搅拌并超声助溶直至形成均匀的褐色悬浊液；加入四水氯化锰磁力搅拌并伴随超声至充分溶解，然后再加入支化聚乙烯亚胺，充分搅拌均匀形成悬浊液后，将悬浊液转移至聚四氟乙烯反应釜中进行水热合成，收集悬浊液离心弃上清并洗涤，干燥后得到基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶Mn-PEI-IONzyme。
进一步的，所述水热合成为200℃条件下加热12h。
进一步的，三氯化铁、三水醋酸钠、四水氯化锰和支化聚乙烯亚胺的质量比为5～10∶30～40∶1～10∶1～10。
合成步骤如下：通过磁力搅拌将0.5-1.0g三氯化铁彻底溶解于30-50mL的乙二醇中；然后，缓慢加入3.0-4.0g的三水醋酸钠，600-900rpm搅拌20-40min，在功率为600-900W条件下超声助溶5-10min，直至形成均匀的褐色悬浊液；分别加入0.1-1.0g四水氯化锰磁力搅拌并伴随超声至充分溶解，然后再分别加入0.1-1.0g PEI，充分搅拌均匀形成悬浊液后，将悬浊液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，200℃加热12h。收集悬浊液8000-10000rpm离心8-12min，弃上清，并用无水乙醇进行6-10次洗涤，放入60℃干燥箱中干燥3-4h后即可得到Mn-PEI-IONzyme，将其放入干燥锅中保存待用。
本发明还提供一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶，由上述方法制备而成。
本发明还提供上述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶在制备流感疫苗黏膜佐剂中的应用。
进一步的，将纯化后的流感病毒与甲醛稀释液混合，充分混匀灭活，得到流感灭活病毒，PBS调整流感灭活病毒和Mn-PEI-IONzyme的浓度分别为1.5mg/mL和10mg/mL，将流感灭活病毒与Mn-PEI-IONzyme按照体积1︰1混匀，室温连接30min，得到Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感疫苗复合体。
进一步的，Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感疫苗复合体的电势大于或等于7.0mV。
进一步的，所述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶用于提高动物呼吸道黏膜H1N1 WIV特异性IgA抗体水平。
进一步的，所述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶用于提高动物血清中H1N1 WIV特异性IgG抗体水平和HI抗体水平。
进一步的，所述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶用于动物在流感病毒感染后降低肺脏中的病毒载量。
本发明采用水热合成法能够调控多种酶的活性且具有免疫特性的锰(Manganese，Mn)和带有正电荷且安全性和稳定性良好的支化聚乙烯亚胺(Polyethyleniminebranched，PEI)掺杂到IONzyme表面，从而设计一种新型黏膜免疫佐剂(Mn-PEI-IONzyme)，并对其安全性和免疫效力进行评价。
有益效果
本发明将Mn和PEI均修饰到IONzyme表面，得到的Mn-PEI-IONzyme类过氧化物酶活性显著提高，该活性的提高能刺激DCs的免疫应答水平增强，进而小鼠免疫水平上升。Mn-PEI-IONzyme还具有较好的安全性和生物相容性，与灭活病毒颗粒形成的复合体带正电荷，电势为正有助于抗原对黏膜组织的粘附，有利于抗原的递送，突破黏膜屏障对抗原的阻碍。
Mn-PEI-IONzyme作为鼻腔黏膜佐剂，可以有效地提高小鼠呼吸道黏膜H1N1 WIV特异性IgA抗体水平，也可以有效地提高小鼠全身系统性的H1N1WIV特异性IgG抗体水平，同时可以显著提高小鼠血清HI抗体水平，并降低肺脏中的病毒载量，保护小鼠免受H1N1流感病毒的致死性攻击。
本发明作为免疫佐剂能够显著增强流感黏膜疫苗的黏膜免疫和系统免疫应答水平，为流感黏膜疫苗的设计提供新思路。
附图说明
图1为Mn-PEI-IONzyme的透射电镜(A)和扫描电镜(B)图；
图2为EDS能谱分析；
图3为XRD元素分析；
图4为XPS谱图；
图5为Mn-PEI-IONzyme的Zeta电势；
图6为Mn-PEI-IONzyme催化H2O2的酶促动力学曲线；
图7为小鼠的体重变化曲线；
图8为小鼠的脏器组织切片观察；
图9为小鼠的生化和血液学分析；
图10为Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体透射电镜图；
图11为Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体Zeta电势；
图12为Mn-PEI-IONzyme作用后DCs表型标志的表达；
图13为Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体滴鼻免疫小鼠后抗体水平检测；
图14为Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体滴鼻免疫小鼠后，血清中特异性IgG及其亚型(IgG1和IgG2a/c)抗体水平检测；
图15为Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体滴鼻免疫小鼠后，血清中HI抗体水平检测；
图16为小鼠攻毒后体重变化、存活率和肺脏中病毒载量；
图17为小鼠攻毒后肺组织病理学变化及肺损伤评分；
图18为小鼠攻毒后肺脏中的病毒载量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶的制备和表征
试验材料：Mn-PEI-IONzyme由本实验室合成；三氯化铁、乙二醇、醋酸钠、PEI、四水氯化锰和3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)购自美国Sigma公司；二甲基亚砜购自上海生物工程有限公司；过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)购自上海阿拉丁试剂公司；无水乙醇购自国药集团。
方法：
1.1Mn-PEI-IONzyme的制备
合成步骤如下：通过磁力搅拌将0.82g三氯化铁彻底溶解于40mL的乙二醇中；然后，缓慢加入3.6g的三水醋酸钠，800rpm搅拌30min，在功率为800W条件下超声助溶8min，直至形成均匀的褐色悬浊液；分别加入0.5g四水氯化锰磁力搅拌并伴随超声至充分溶解，然后再分别加入0.1g PEI，充分搅拌均匀形成悬浊液后，将悬浊液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，200℃加热12h。收集悬浊液9000rpm离心10min，弃上清，并用无水乙醇进行6-10次洗涤，放入60℃干燥箱中干燥4h后即可得到Mn-PEI-IONzyme，将其放入干燥锅中保存待用。
1.2Mn-PEI-IONzyme的形态观察
称取适量Mn-PEI-IONzyme粉末，适当处理后通过透射电子显微镜(Transmissionelectron microscopy，TEM)和扫描电子显微镜(Scanning electron microscope，SEM)进行形态观察。
如图1所示，通过水热合成法合成IONzyme、PEI-IONzyme、Mn-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme，其中Mn和PEI的修饰剂量分别为0.5g和0.1g。通过TEM和SEM观察，如图1所示，IONzyme、PEI-IONzyme、Mn-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme均呈球形，粒径分别为：270nm、190nm、190nm和160nm左右，其中Mn-PEI-IONzyme粒径最小。
1.3Mn-PEI-IONzyme的EDS元素分析
运用能量色散谱(Energy Dispersive Spectroscopy，EDS)，检测碳元素、氧元素、铁元素、氮元素和锰元素，确定样品中各个元素的分布及含量。
如图2A和B所示，与IONzyme对比，PEI-IONzyme表面元素新增加N元素(质量占比为3.49％，原子数量占比7.04％)，表明PEI修饰到IONzyme表面；如图2A和C所示，与IONzyme对比，Mn-IONzyme表面元素新增加Mn元素(质量占比为5.99％，原子数量占比2.11％)，表明Mn修饰到IONzyme表面；如图2A和D所示，与IONzyme对比，Mn-PEI-IONzyme表面元素新增加Mn元素(质量占比为5.78％，原子数量占比2.09％)和N元素(质量占比为5.06％，原子数量占比7.19％)，表明Mn和PEI均修饰到IONzyme表面。
1.4Mn-PEI-IONzyme的XRD元素分析
通过X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)测试，根据结晶峰确定样品中化学物质，从而确定其成分结构。
由于Fe3O4和Mn3O4的衍射峰位置重合，如图3所示，可以清楚的看到在IONzyme和PEI-IONzyme中35.4°、43.1°、56.8°和62.4°出现衍射峰，分别对应于Fe3O4(PDF#19-0629)的(311)、(400)、(511)和(440)的面。而Mn-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme中35.4°、43.1°、56.8°和62.4°出现偏移与Mn3O4(PDF#13-0162)相接近，可以推测成功地制备了Mn-PEI-IONzyme。
1.5Mn-PEI-IONzyme的XPS元素分析
运用X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)检测碳元素、氧元素、铁元素、氮元素和锰元素，分析Mn和Fe元素的价态及成键。
如图4A所示，与IONzyme对比，掺杂PEI的PEI-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme的C1s峰增高，信号增强，说明碳增多，证明PEI成功掺杂至IONzyme和Mn-IONzyme。如图4D所示，Mn的2p 3/2和2p 1/2峰位置可确定其价态并证明Mn成功掺杂到IONzyme的表面。
1.6Mn-PEI-IONzyme的Zeta电势的测定
运用马尔文Zeta电位仪测定Mn-PEI-IONzyme的Zeta电势。
如图5所示，IONzyme、PEI-IONzyme、Mn-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme的电势分别为-6.9mV、24.8mV、24.7mV和26.1mV。
1.7Mn-PEI-IONzyme的类过氧化物酶活性的测定
催化底物H2O2的酶促动力学参数测定，检测方法是将纳米材料超声溶解于双蒸水中，配制成浓度为0.5mg/mL的溶液。取20μL配制的纳米材料溶于不同量的0.1M醋酸钠缓冲液(pH＝4.55)，加入4μL的TMB溶液(10mg/mL，溶于DMSO)，再加入不同量的H2O2，总反应体积为200μL。酶标仪检测在652nm处的吸光度值，时间扫描120s，反应温度37℃。通过调节醋酸钠缓冲液和H2O2的量使H2O2终浓度梯度是0、18.75、37.5、75、150、300、600、1200mM。
如图6所示，与IONzyme对比，PEI-IONzyme、Mn-IONzyme、Mn-PEI-IONzyme的类过氧化物酶活性显著提高，且Mn-PEI-IONzyme的类过氧化物酶活性最高。
1.8Mn-PEI-IONzyme的安全性试验
将30只6周龄C57BL/6J雌鼠随机分成3组，每组10只，常规饲养。A组为对照组，用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)进行滴鼻；B组为Mn-PEI-IONzyme(5mg/kg)组；C组为Mn-PEI-IONzyme(10mg/kg)组，小鼠适应饲养3d后进行滴鼻，0.02mL/只。滴鼻14d后随机选取5只小鼠进行安乐死，取血液和组织脏器用于血常规和血液生化指标检测以及组织病理切片观察，剩余5只小鼠继续饲养至第60d，每天记录小鼠体重变化。
如图7所示，小鼠滴鼻60d后，与PBS组对比，Mn-PEI-IONzyme(5mg/kg)组和Mn-PEI-IONzyme(10mg/kg)组小鼠体重无变化，且均有增加，表明Mn-PEI-IONzyme滴鼻小鼠后对小鼠体重无影响。如图8所示，与PBS组对比，滴鼻14d后，小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑组织并未出现病变。如图9所示，与PBS组相比，Mn-PEI-IONzyme(5mg/kg)组和Mn-PEI-IONzyme(10mg/kg)组小鼠血液生化指标谷丙转氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase，AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(Creatinine，CREA)以及血液学指标红细胞数量(Red blood count，RBC)、血红蛋白(Hemoglobin，HGB)、红细胞比容(Red blood cellspecific volume，HCT)、平均红细胞体积(Mean corpusular volume，MCV)和平均红细胞血红蛋白含量(Mean corpusular hemoglobinm，MCH)等均无显著性差异。
1.9Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体的配制及Zeta电势测定
流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1，PR8)，通过蔗糖梯度密度离心法进行纯化。用无菌PBS按照1∶50稀释37％的甲醛，甲醛稀释液与病毒按照体积比为7∶43混匀，灭活24h，得到H1N1全病毒灭活(Whole inactivated virus，WIV)疫苗。PBS调整H1N1 WIV和Mn-PEI-IONzyme的浓度分别为1.5mg/mL和10mg/mL，将H1N1 WIV与Mn-PEI-IONzyme按照体积1︰1混匀，室温连接30min，制备Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体，对其进行透射电镜观察及Zeta电势测定。
如图10所示，流感病毒为囊膜病毒(图10A)，当与Mn-PEI-IONzyme连接后，病毒粒子围绕并结合在黑色的球形的Mn-PEI-IONzyme周围，表明H1N1WIV能够连接到Mn-PEI-IONzyme表面。如图11所示，H1N1 WIV电势为-21.1mV，与PEI-IONzyme、Mn-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme连接后，电势转正分别为6.1mV、2.9mV、7.0mV。电势为正有助于抗原对黏膜组织的粘附，有利于抗原的递送。
试验结果：研究发现该佐剂具有较高的类过氧化物酶活性和良好的生物相容性且与灭活病毒颗粒形成的复合体带正电荷。
实施例2：Mn-PEI-IONzyme对树突状细胞成熟的影响
试验材料：FITC-CD86、PE-CD80、FITC-MHCII、PE-CD40购自BD Pharmingen(美国)公司；1640细胞培养液购自Thermo Fisher(美国)公司；青链双抗购自鼎国(中国)生物技术公司；胎牛血清购自Hyclone(澳洲)生物公司。
方法：
MHCII、CD40、CD80和CD86是DCs的表型标志，通过流式检测DCs的表型标志探究Mn-PEI-IONzyme对DCs成熟的影响。IONzyme(50μg/mL)、PEI-IONzyme(50μg/mL)、Mn-IONzyme(50μg/mL)和Mn-PEI-IONzyme(50μg/mL)分别与DCs共孵育24h后，收集DCs，离心弃上清，PBS清洗后，将细胞重悬，分别加入流式抗体FITC-MHCII、PE-CD40、PE-CD80、FITC-CD86，4℃避光孵育30min，PBS清洗后，流式检测。
如图12A-H所示，与空白对照组相比，IONzyme、PEI-IONzyme、Mn-IONzyme和Mn-PEI-IONzyme组，DCs表型标志MHCII、CD40、CD80和CD86的表达显著上调(**P<0.01)，且Mn-PEI-IONzyme组表型标志表达最高。结果表明Mn-PEI-IONzyme能够显著诱导DCs的成熟，说明其免疫应答水平较强。
实施例3：Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体在流感黏膜免疫中的应用
试验材料：6周龄雌性C57BL/6J小鼠由扬州大学比较医学中心提供；SPF鸡胚购自浙江立华农业科技有限公司；H1N1(A/Puerto Rico/8/34)亚型流感病毒株由农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存；BCA蛋白浓度测定试剂盒、HRP-抗鼠IgG1、HRP-抗鼠IgG2a/c购自Thermo Fisher(美国)公司；HRP-抗鼠IgG购自Bioworld Technology(美国)公司；HRP-抗鼠IgA购自Southern Biotech公司；TMB显色液购自碧云天(中国)生物公司；霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin subunit B，CTB)购自Sigma(美国)公司；HiscriptⅡQ Select RTSuper Mix、ChamQ SYBR qPCR Master Mix和RNA isolater Total RNA ExtractionReagent购自Vazyme公司；三氯甲烷，异丙醇和无水乙醇购自国药集团；DEPC水和多聚甲醛购自Sangon公司。
方法：
3.1Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体滴鼻免疫小鼠后的黏膜和系统性免疫应答水平
将6周龄的C57BL/6J小鼠，随机分为7组，每组25只，分别为PBS、H1N1WIV(5μg HA)、H1N1 WIV(5μg HA)+IONzyme(100μg)、H1N1 WIV(5μg HA)+PEI-IONzyme(100μg)、H1N1 WIV(5μg HA)+Mn-IONzyme(100μg)、H1N1 WIV(5μg HA)+Mn-PEI-IONzyme(100μg)、H1N1 WIV(5μg HA)+霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin subunit B，CTB，10μg)进行滴鼻免疫，初次免疫后14d加强免疫。初次免疫后28d，每组取5只小鼠安乐死，分离脾脏和血清，收集鼻腔、气管和肺脏涮洗液等样本。采用间接ELISA的方法对鼻腔、气管和肺脏涮洗液中特异性IgA抗体水平、血清中特异性IgG及其亚型(IgG1和IgG2a/c)抗体水平进行检测。通过血凝抑制试验对HI抗体水平进行检测。
如图13A-C所示，与H1N1 WIV疫苗组相比，Mn-PEI-IONzyme和CTB佐剂配合H1N1WIV疫苗组，鼻腔、气管和肺脏涮洗液中特异性IgA抗体水平显著提高(*P<0.05)，且Mn-PEI-IONzyme佐剂配合H1N1 WIV疫苗组抗体水平最高。以上结果表明，Mn-PEI-IONzyme作为鼻腔黏膜佐剂，可以有效地提高小鼠呼吸道黏膜H1N1 WIV特异性IgA抗体水平。
如图14所示，与H1N1 WIV疫苗组相比，Mn-PEI-IONzyme和CTB佐剂配合H1N1 WIV疫苗组中血清中特异性IgG及其亚型(IgG1和IgG2a/c)抗体水平均显著提高(*P<0.05)。以上结果表明，Mn-PEI-IONzyme作为鼻腔黏膜佐剂，可以有效地提高小鼠全身系统性的H1N1WIV特异性IgG抗体水平。
如图15所示，与H1N1 WIV疫苗组相比，IONzyme、PEI-IONzyme、Mn-IONzyme、Mn-PEI-IONzyme和CTB佐剂配合H1N1 WIV疫苗组的血清HI滴度均显著提高(*P<0.05)，且Mn-PEI-IONzyme配合H1N1 WIV疫苗组的血清HI滴度最高。以上结果表明，Mn-PEI-IONzyme配合H1N1 WIV滴鼻免疫小鼠后，可以显著提高小鼠血清HI抗体水平。
综上结果表明，Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体滴鼻免疫小鼠后，可以显著提高小鼠呼吸道局部黏膜和全身系统性免疫应答水平。
3.2Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体滴鼻免疫小鼠后攻毒保护情况
初次免疫28d后，每组10只小鼠以106EID50的H1N1流感病毒滴鼻攻毒，每只小鼠滴鼻50μL，监测小鼠14d内的体重变化和生存情况，小鼠体重减轻超过25％被判定为死亡，并实施安乐死。每组10只小鼠以106EID50的H1N1流感病毒滴鼻攻毒，每只小鼠滴鼻50μL，在攻毒后的第5d小鼠实施安乐死，无菌摘取肺脏，5只小鼠肺脏用于组织病理学检查，5只小鼠肺脏用于检测肺脏病毒载量。
如图16A所示，与单独H1N1 WIV疫苗组相比，H1N1WIV+Mn-PEI-IONzyme疫苗组和H1N1 WIV+CTB疫苗组，攻毒后小鼠体重没有下降，但H1N1 WIV疫苗组，攻毒后小鼠体重下降较多。此外，对攻毒后小鼠的存活率进行监测，如图16B所示，H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme疫苗组和H1N1 WIV+CTB疫苗组中小鼠的存活率为100％，但H1N1 WIV组小鼠出现部分死亡，存活率为40％。以上结果表明H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme疫苗滴鼻免疫小鼠后，可以完全抵抗H1N1流感病毒的致死性攻击。
如图17A所示，PBS组和H1N1 WIV疫苗组肺组织表现出严重的病变，伴有炎性细胞浸润和肺泡壁水肿。然而，H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme组和H1N1WIV+CTB组中，小鼠肺脏表现出轻微的病理学变化。此外，对肺脏病理指数进行统计，如图17B所示，与单独H1N1 WIV疫苗组相比，H1N1 WIV+IONzyme、H1N1 WIV+PEI-IONzyme、H1N1 WIV+Mn-IONzyme、H1N1WIV+Mn-PEI-IONzyme和H1N1 WIV+CTB组肺脏病理指数均显著下降(**P<0.01)，且H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme和H1N1 WIV+CTB组肺脏病理指数最低。
如图18所示，与PBS组相比，IONzyme、PEI-IONzyme、Mn-IONzyme、Mn-PEI-IONzyme和CTB佐剂配合H1N1 WIV疫苗配合组中肺脏中的病毒载量显著降低(**P<0.01)。且H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme和H1N1 WIV+CTB组肺脏中的病毒载量最低。以上结果表明，H1N1 WIV+Mn-PEI-IONzyme鼻腔免疫小鼠后，可以保护小鼠免受H1N1流感病毒的致死性攻击。
试验结果：Mn-PEI-IONzyme佐剂配合灭活流感病毒鼻腔免疫小鼠后可以显著提高局部黏膜免疫和系统免疫应答水平，能够完全抵抗流感病毒的致死性攻击。
Claims (10)
1.一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过磁力搅拌将三氯化铁彻底溶解于乙二醇中，缓慢加入三水醋酸钠，搅拌并超声助溶直至形成均匀的褐色悬浊液；加入四水氯化锰磁力搅拌并伴随超声至充分溶解，然后再加入支化聚乙烯亚胺，充分搅拌均匀形成悬浊液后，将悬浊液转移至聚四氟乙烯反应釜中进行水热合成，收集悬浊液离心弃上清并洗涤，干燥后得到基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶Mn-PEI-IONzyme。
2.根据权利要求1所述的基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶的制备方法，其特征在于，所述水热合成为200℃条件下加热12h。
3.根据权利要求1所述的基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶的制备方法，其特征在于，三氯化铁、三水醋酸钠、四水氯化锰和支化聚乙烯亚胺的质量比为5～10∶30～40∶1～10∶1～10。
4.一种基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶，其特征在于，由权利要求1～3任一项所述方法制备而成。
5.权利要求4所述的基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶在制备流感病毒疫苗黏膜佐剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将纯化后的流感病毒与甲醛稀释液混合，充分混匀灭活，得到流感灭活病毒，PBS调整流感灭活病毒和Mn-PEI-IONzyme的浓度分别为1.5mg/mL和10mg/mL，将流感灭活病毒与Mn-PEI-IONzyme按照体积1︰1混匀，室温连接30min，得到Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，Mn-PEI-IONzyme联合灭活流感病毒疫苗复合体的电势大于或等于7.0mV。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶用于提高动物呼吸道黏膜H1N1 WIV特异性IgA抗体水平。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶用于提高动物血清中H1N1 WIV特异性IgG抗体水平和HI抗体水平。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基于锰和聚乙烯亚胺修饰的氧化铁纳米酶用于动物在流感病毒感染后降低肺脏中的病毒载量。
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