CN116602966A - 13-甲基-巴马汀在制备抗心肌缺血损伤和心脏纤维化药物中的用途 - Google Patents

13-甲基-巴马汀在制备抗心肌缺血损伤和心脏纤维化药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了13‑甲基‑巴马汀在制备抗心肌缺血损伤和心脏纤维化药物中的用途，属于医药技术领域，所述的13‑甲基‑巴马汀具有式I所示的结构。通过对实验心肌梗死和心肌纤维化小鼠进行药理实验，证实本发明的13‑甲基‑巴马汀具有抗心肌梗死和纤维化作用显著、安全性好、用药简单方便、原料价格低廉易得、便于运输和保存的优点，本发明的13‑甲基‑巴马汀作为抗心肌梗死和纤维化药物将具有广阔的应用前景。

Description

13-甲基-巴马汀在制备抗心肌缺血损伤和心脏纤维化药物中 的用途
技术领域
本发明涉及一种新的抗心肌梗死和心肌纤维化化合物13-甲基-巴马汀及其用途。属于医药技术领域。
背景技术
心肌梗死(myocardial infarction，MI)主要由冠状动脉粥样硬化导致心肌缺血、缺氧，进而引起心脏收缩功能障碍、弥漫性心肌纤维化、随后伴随心室结构、功能、代谢及电传导的异常，最终发展为难治性心衰和各种心律失常，死亡风险极高。心肌纤维化亦见于多种常见的非心源性疾病(糖尿病、肥胖和衰老)，且危害巨大，一旦发生就难以逆转，是心脏病患者高死亡率的直接元凶，给社会和人民造成巨大的心理和经济负担，因此防治心肌梗死与心肌纤维化是目前延缓各种心血管疾病进一步进展的重要措施之一。
临床上心肌梗死的常用药物为抗血小板药、β受体阻滞剂、他汀类药物、钙拮抗剂、硝酸酯类药物及溶血栓等药物，且临床尚无有效治疗心肌纤维化的药物，目前心肌梗死与心肌纤维化治疗效果不理想，开发有效的、安全的抗心肌梗死与心肌纤维化药物具有重要的意义。
巴马汀是一种季胺盐异喹啉类生物碱，又名黄藤素，属植物型药物，是存在于黄连、黄藤中的主要有效单体。近年来，许多学者通过对巴马汀药理作用及其机制的深入研究，发现巴马汀具有抗菌抗炎、抗肿瘤、抗心肌缺血、降脂、降糖等广泛的药理作用。但由于巴马汀生物利用度较低，本发明公开的13-甲基-巴马汀是对巴马汀进行了结构改造，通过结扎小鼠冠状动脉左前降支，建立心肌梗死模型，旨在观察13-甲基-巴马汀对实验性心肌梗死小鼠的心肌保护作用，发现13-甲基-巴马汀具有抗心肌梗死与心肌纤维化的作用，且药效优于巴马汀。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种新的抗心肌梗死和心肌纤维化化合物及其用途。本发明所提供的化合物具有抗心肌梗死和心肌纤维化作用显著、安全性好、用药简单方便、原料价格低廉易得、便于运输和保存的优点。
本发明是通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提出的一种新的抗心肌梗死和心肌纤维化化合物为13-甲基-巴马汀，其具有式I所示的结构。
所述的新的抗心肌梗死和心肌纤维化化合物13-甲基-巴马汀利于生物体吸收，利于提高口服对药物的生物利用度。通过对心肌梗死小鼠进行药理实验，证实本发明的13-甲基-巴马汀利具有显著的抗心肌梗死和心肌纤维化作用。
因此，本发明提出了13-甲基-巴马汀在制备抗心肌梗死和心肌纤维化药物中的用途。其中，所述的药物具有改善梗死心脏的心功能，表现为增加梗死心脏的射血分数和短轴缩短率，此外所述的药物具有减轻梗死心脏的心肌细胞组织紊乱，降低心肌梗死动物心肌细胞凋亡的作用。所述的药物具有改善纤维化心脏的心功能，表现为提高纤维化心脏的射血分数和短轴缩短率，此外所述的药物具有抑制纤维化心脏组织中心肌成纤维细胞增殖与细胞外基质沉积，降低心肌纤维化动物心肌组织中胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化的作用。
其中，将所述的13-甲基-巴马汀加入制剂成型所需的辅料制备成胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、缓释剂、注射剂或其他制剂。
进一步的，本发明还提出了一种用于抗心肌梗死和心肌纤维化的药物，所述的药物的有效成分为13-甲基-巴马汀。
其中，所述的药物为胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、缓释剂、注射剂或其他制剂。
更进一步的，本发明还提出了一种制备所述的13-甲基-巴马汀的方法，包括以下步骤：
(1)将黄连药材粉碎后，用90％-98％乙醇溶液回流提取，收集提取液，将滤渣用65％-75％乙醇溶液提取，收集提取液，浓缩所得提取液至无醇味，合并浸膏，调节此浸膏pH至9.8-10.2，氯仿萃取，所得氯仿溶液经浓缩得到氯仿层，采用硅胶柱对所得氯仿层进行分离，其中，采用CH2Cl2-MeOH-1％氨水体系梯度洗脱(梯度体系中CH2Cl2-MeOH的体积配比依次为15:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1和1:1)，所得流分经Sephadex LH-20柱层析(以70％甲醇洗脱)分离得到盐酸巴马汀(9)。
(2)由盐酸巴马汀甲基化反应，合成得到13-甲基巴马汀，一步完成，收率为39％。
相对于现有技术，本发明的有益技术效果在于：
(1)抗心肌梗死作用显著：13-甲基-巴马汀能够显著改善梗死心脏的心功能，表现为增加梗死心脏的射血分数和短轴缩短率，减轻梗死心脏的心肌细胞组织紊乱，降低心肌梗死动物心肌细胞凋亡的作用；而且，所述药物抗心肌梗死作用优于巴马汀，可以作为安全有效的抗心肌梗死的药物。
(2)抗心肌纤维化作用显著：13-甲基-巴马汀能够显著改善纤维化心脏的心功能，表现为提高纤维化心脏的射血分数和短轴缩短率，抑制纤维化心脏组织中心肌成纤维细胞增殖与细胞外基质沉积，降低心肌纤维化动物心肌组织中胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化的作用；而且，所述药物抗心肌纤维化作用优于巴马汀，可以作为安全有效的抗心肌纤维化的药物。
(3)安全性好：本发明的新的抗心肌梗死和心肌纤维化化合物13-甲基-巴马汀耐受量大，无明显毒副作用。
(4)用药简单方便，人或动物口服易吸收。
(5)本发明的药物原料为黄连，成品成药性强，与其他进口抗心肌缺血药物相比，价格便宜，性价比高，易于患者接受。
(6)便于运输与保存，密封，置阴凉干燥处即可。
附图说明
图1为13-甲基-巴马汀分离提取及合成路线图；
图2为13-甲基-巴马汀对心肌梗死小鼠心脏功能学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，##P<0.01，###P＜0.001vs.心肌梗死组，n＝8；
图3为13-甲基-巴马汀对心肌梗死小鼠心脏形态学的影响；
数据以均值±标准差表示，**P<0.01vs.假手术组，#P<0.05，##P＜0.01vs.心肌梗死组，n＝3；
图4为13-甲基-巴马汀对心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，##P<0.01，###P＜0.001vs.心肌梗死组，n＝8；
图5为13-甲基-巴马汀与巴马汀对心肌梗死小鼠心脏功能学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，##P<0.01，###P＜0.001vs.心肌梗死组，&P＜0.05vs.巴马汀组。假手术组，n＝6；心肌梗死组，n＝10；13-甲基-巴马汀组(10mg/kg)，n＝10；巴马汀组(9.7mg/kg)，n＝9；
图6为13-甲基-巴马汀与巴马汀对心肌梗死小鼠心脏形态学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，#P<0.05vs.心肌梗死组，n＝3。
图7为13-甲基-巴马汀与巴马汀对心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡的影响；
数据以均值±标准差表示，**P<0.01，***P＜0.001vs.假手术组，#P<0.05，###P＜0.001vs.心肌梗死组，&P＜0.05vs.巴马汀组，BCL-2(n＝6)，BAX(n＝8)；
图8为13-甲基-巴马汀对心肌纤维化小鼠心脏功能学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，#P<0.05，###P＜0.001vs.心肌梗死组，n＝8；
图9为13-甲基-巴马汀对心肌纤维化小鼠心脏形态学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，###P＜0.001vs.心肌梗死组，n＝3；
图10为13-甲基-巴马汀对心肌纤维化小鼠心肌成纤维细胞胶原外基质沉积及增殖与分化的影响；
数据以均值±标准差表示，**P＜0.01，***P<0.001vs.假手术组，#P<0.05，##P＜0.01，###P＜0.001vs.心肌梗死组，n＝6；
图11为13-甲基-巴马汀与巴马汀对心肌纤维化小鼠心脏功能学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，###P<0.001vs.心肌梗死组，&&P＜0.01vs.巴马汀组。假手术组，n＝6；心肌梗死组，n＝11；13-甲基-巴马汀组(10mg/kg)，n＝6；巴马汀组(9.7mg/kg)，n＝8；
图12为13-甲基-巴马汀与巴马汀对心肌纤维化小鼠心脏形态学的影响；
数据以均值±标准差表示，***P<0.001vs.假手术组，##P<0.01，###P＜0.001vs.心肌梗死组，&P＜0.05vs.巴马汀组，n＝3；
图13为13-甲基-巴马汀与巴马汀对心肌纤维化小鼠心肌成纤维细胞增殖与分化及胶原外基质沉积的影响；
数据以均值±标准差表示，**P＜0.01，***P＜0.001vs.假手术组，##P<0.01vs.心肌梗死组，COL1(n＝4)，α-SMA(n＝6)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：13-甲基-巴马汀的制备
将黄连药材粉碎后，用90％-98％乙醇溶液回流提取，收集提取液，将滤渣用65％-75％乙醇溶液提取，收集提取液，浓缩所得提取液至无醇味，合并浸膏，调节此浸膏pH至9.8-10.2，氯仿萃取，所得氯仿溶液经浓缩得到氯仿层，采用硅胶柱对所得氯仿层进行分离，其中，采用CH2Cl2-MeOH-1％氨水体系梯度洗脱(梯度体系中CH2Cl2-MeOH的体积配比依次为15:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1和1:1)，所得流分经Sephadex LH-20柱层析(以70％甲醇洗脱)分离得到盐酸巴马汀。由盐酸巴马汀(9)甲基化反应，合成得到13-甲基巴马汀(10)，一步完成，收率为39％。该化合物的结构式如1所示。
实施例2：本发明产品的功效性试验1--抗心肌梗死的药效学研究1
1.实验材料
实验动物：50只体重均匀的小鼠
受试物：13-甲基-巴马汀
2.实验原理
通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死的小鼠模型，再给予小鼠受试药物，可检测受试物对心肌梗死的影响，并可判定受试物对心肌梗死小鼠的心脏功能的影响。
3.实验方法
3.1动物分组
随机分组：动物接收后，适应性喂养3天，适应期结束后，ICR小鼠称重，按照体重随机分为5组，即假手术组、心肌梗死模型组、13-甲基-巴马汀低剂量组(5mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀中剂量组(10mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀高剂量组(20mg/kg/d)。
3.2心肌梗死模型建立
小鼠心肌梗死模型是通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立的。健康的雄性ICR小鼠(30±2g)用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射进行麻醉，并将已麻醉的小鼠仰卧位固定于鼠操作台上，连接呼吸机。左胸部皮肤做左上到右下斜切口，约0.5～1.0cm，分离胸小肌及前锯肌，于第4、5肋间钝性分离肋间肌，轻轻推挤出心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘1～2mm处穿一根7/0结扎线，进行冠状动脉结扎，结扎后可见心尖处颜色出现苍白。
3.3给药及造模期：将适应性喂养后的SPF级别的小鼠随机称重，按照体重随机分为4组，即假手术组、心肌梗死模型组、13-甲基-巴马汀低剂量组(5mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀中剂量组(10mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀高剂量组(20mg/kg/d)，造模后通过灌胃(如表1所示)给予小鼠13-甲基-巴马汀以及空白溶剂，连续7天后检测各组小鼠心脏功能。
表1.各组动物给药及饮食情况
3.4观察期
实验过程中进行一般生命体征观察。
3.5主要检测指标
(1)灌胃7天后，小动物超声检测各组小鼠心脏功能变化。
(2)梗死心脏HE、Masson切片染色。
(3)测定心肌细胞凋亡蛋白水平。
3.6小鼠心脏功能检测
检测小鼠心脏血流动力学参数采用2100高分辨率小动物超声成像系统及MicroScan MS 250-0206探头，实验小鼠麻醉，仰卧位固定。胸前区脱毛，涂抹超声凝胶。探头置于小鼠左侧胸前，2D超声示左室短轴切面，二维(2D)引导下取M模式超声记录左心室运动情况，测量射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)，以此指标评价各组动物左心室功能。
3.7小鼠梗死心脏切片染色
将心脏切取成约1mm的横截薄片，迅速放入4％中性甲醛中固定24h。再依次经过50％、70％、85％、95％、100％酒精脱水，每次浸泡45min、再用酒精和二甲苯透明处理，石蜡包埋保存。切片机切片，进行HE和Masson染色，用Image J图像软件对各组大鼠Masson染色图片进行分析，心肌组织胶原容积分数CVF＝胶原面积/总面积。
HE染色具体步骤：二甲苯10min→二甲苯+无水酒精(1:1)5min→100％、95％、85％、70％、50％的酒精各5min→蒸馏水2min→苏木素精染色30min→流水冲洗5min→1％盐酸分化5s→流水冲洗3min→1％氨水蓝化5s→流水冲洗5min→伊红染液3min→50％酒精30s→70％、80％、95％、100％酒精各5min→二甲苯+纯酒精(1:1)5min→二甲苯10min→封藏。
Masson染色具体步骤：二甲苯10min→二甲苯+无水酒精(1:1)5min→100％、95％、85％、70％、50％的酒精各5min→蒸馏水2min→苏木素精染色30min→流水冲洗5min→丽春红酸性复红液10min→2％冰醋酸30s→1％磷钼酸分化5min→苯胺蓝5min→0.2％冰醋酸30s→50％酒精30s→70％、80％、95％、100％酒精各5min→二甲苯+纯酒精(1:1)5min→二甲苯10min→封藏。
3.8测定心肌细胞凋亡蛋白水平。
(1)上样：取出购买好的预制胶(Hepes，4-20％)，垂直拔去梳子，每孔上样10ul样品，即30ug蛋白，两端上样孔分别加入蛋白marker 5ul。
(2)电泳：电泳槽中倒入电泳液，外槽需没过电极，80V，电泳120min左右。
(3)转膜：切大小合适的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡PVDF膜30s，再放入转膜液中。取出电泳完成的梯度胶，切除四周多余的部分，将切好的梯度胶和滤纸放入转膜液中浸润，按照负极(夹子黑面)-海绵垫-3层滤纸-预制胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵垫-正极(夹子红面)的顺序放置，注意排出气泡，压紧夹板，放入转膜槽中。将转膜槽置于冰上，正确连接电极，转膜条件为150mA恒流，转膜时间55min。
(4)封闭：将膜取出，用TBST洗3次，每次5min，放置再摇床上。加入封闭液5ml，室温摇床上封闭1h。
(5)一抗孵育：用封闭液稀释一抗(1:1000)，4℃摇床孵育过夜。第二天，洗膜3次，每次10min。
(6)二抗孵育：用TBST稀释二抗(1:3000)，室温摇床孵育l h。用TBST洗膜3次，每次15min。
(7)显影分析：混合好的ECL显隐剂(A:B＝1:1)，取200ul覆盖于膜上，避光反应3min，放入凝胶成像系统，依次曝光并保存曝光图片。用软件Image J测量各蛋白条带灰度值，并统计分析。
4.实验数据与结果
4.1数据处理
定量数据以均值±标准差(mean±SEM)表示，数据采用Graphpad 8.0软件进行统计分析。2组间比较采用t检验；3组或3组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Turkey’s多重比较检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。
4.2实验结果
利用冠状动脉左前降支结扎术建立小鼠心肌梗死模型，结果如图2所示，小鼠冠状动脉左前降支结扎7天后，心肌梗死组与假手术组小鼠相比射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)明显降低，而13-甲基-巴马汀低、中、高剂量组与心肌梗死模型组相比，呈剂量依赖性升高。
如图3所示，心肌梗死模型组与假手术组相比，心肌细胞紊乱与心肌纤维化状况明显增加，而给予13-甲基-巴马汀低中高剂量后，则能显著改善心肌梗死小鼠心肌细胞紊乱与心肌纤维化，且13-甲基-巴马汀各剂量组与心肌梗死模型组比，心肌纤维化改善效果呈剂量依赖性。
如图4所示，心肌梗死模型组与假手术组相比，心肌细胞凋亡蛋白BAX水平表达明显升高，抗凋亡蛋白BCL-2水平表达明显降低，而给予13-甲基-巴马汀低中高剂量后，则能显著改善心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡蛋白水平表达，且13-甲基-巴马汀各剂量组与心肌梗死模型组比，心肌纤维化改善效果呈剂量依赖性。
以上结果表明13-甲基-巴马汀具有减轻小鼠心肌梗死损伤的所用，且呈剂量依赖性。
实施例3：本发明产品的功效性试验1--抗心肌梗死的药效学研究2
1.实验材料
实验动物：40只体重均匀的小鼠
受试物：13-甲基-巴马汀，巴马汀
2.实验原理
通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死的小鼠模型，再给予小鼠受试药物，可检测受试物对心肌梗死的影响，并可判定受试物对心肌梗死小鼠的心脏功能的影响。
3.实验方法
3.1动物分组
随机分组：动物接收后，适应性喂养3天，适应期结束后，ICR小鼠称重，按照体重随机分为4组，即假手术组、心肌梗死模型组、13-甲基-巴马汀组(10mg/kg/d)、巴马汀组(9.7mg/kg/d)。
3.2心肌梗死模型建立
小鼠心肌梗死模型是通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立的。健康的雄性ICR小鼠(30±2g)用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射进行麻醉,并将已麻醉的小鼠仰卧位固定于鼠操作台上，连接呼吸机。左胸部皮肤做左上到右下斜切口，约0.5～1.0cm，分离胸小肌及前锯肌，于第4、5肋间钝性分离肋间肌，轻轻推挤出心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘1～2mm处穿一根7/0结扎线，进行冠状动脉结扎，结扎后可见心尖处颜色出现苍白。
3.3给药及造模期：将适应性喂养后的SPF级别的小鼠随机称重，按照体重随机分为4组，即假手术组、心肌梗死模型组、13-甲基-巴马汀组(10mg/kg/d)、巴马汀组(9.7mg/kg/d)，造模后通过灌胃(如表2所示)给予小鼠13-甲基-巴马汀以及空白溶剂，连续7天后检测各组小鼠心脏功能。
表2.各组动物给药及饮食情况
3.4观察期
实验过程中进行一般生命体征观察。
3.5主要检测指标
(1)灌胃7天后，小动物超声检测各组小鼠心脏功能变化。
(2)梗死心脏HE、Masson切片染色
(3)测定心肌细胞凋亡蛋白水平。
3.6小鼠心脏功能检测
同实施例2的3.6。
3.7小鼠梗死心脏切片染色
同实施例2的3.7。
3.8测定心肌细胞凋亡蛋白水平。
同实施例2的3.8。
4.实验数据与结果
4.1数据处理
定量数据以均值±标准差(mean±SEM)表示，数据采用Graphpad 8.0软件进行统计分析。2组间比较采用t检验；3组或3组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Turkey’s多重比较检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。
4.2实验结果
如图5所示，心肌梗死组与假手术组小鼠相比射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)明显降低，而13-甲基-巴马汀组和巴马汀组可逆转此损伤，但13-甲基-巴马汀药效显著优于巴马汀。
如图6所示，心肌梗死模型组与假手术组相比，心肌细胞紊乱与心肌纤维化状况明显增加，而13-甲基-巴马汀组和巴马汀组可逆转此损伤，但13-甲基-巴马汀药效显著优于巴马汀。
如图7所示，心肌梗死模型组与假手术组相比，心肌细胞凋亡蛋白BAX水平表达明显升高，而13-甲基-巴马汀组和巴马汀组可逆转此损伤，但13-甲基-巴马汀药效显著优于巴马汀；心肌梗死模型组与假手术组相比，抗凋亡蛋白BCL-2水平表达明显降低，而13-甲基-巴马汀组可逆转此损伤，但巴马汀组未见逆转作用。
以上结果表明13-甲基-巴马汀减轻小鼠心肌梗死的作用显著优于巴马汀。
实施例4：本发明产品的功效性试验2--抗心肌纤维化的药效学研究1
1.实验材料
实验动物：50只体重均匀的小鼠
受试物：13-甲基-巴马汀
2.实验原理
通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌纤维化小鼠模型，再给予小鼠受试药物，可检测受试物对心肌纤维化的影响，并可判定受试物对心肌纤维化小鼠的心脏功能的影响。
3.实验方法
3.1动物分组
随机分组：动物接收后，适应性喂养3天，适应期结束后，ICR小鼠称重，按照体重随机分为5组，即假手术组、心肌梗死模型组、13-甲基-巴马汀低剂量组(5mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀中剂量组(10mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀高剂量组(20mg/kg/d)。
3.2心肌纤维化模型建立
小鼠心肌纤维化模型是通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立的。健康的雄性ICR小鼠(30±2g)用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射进行麻醉,并将已麻醉的小鼠仰卧位固定于鼠操作台上，连接呼吸机。左胸部皮肤做左上到右下斜切口，约0.5～1.0cm，分离胸小肌及前锯肌，于第4、5肋间钝性分离肋间肌，轻轻推挤出心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘1～2mm处穿一根7/0结扎线，进行冠状动脉结扎，结扎后可见心尖处颜色出现苍白。
3.3给药及造模期：将适应性喂养后的SPF级别的小鼠随机称重，按照体重随机分为4组，即假手术组、心肌梗死模型组、13-甲基-巴马汀低剂量组(5mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀中剂量组(10mg/kg/d)、13-甲基-巴马汀高剂量组(20mg/kg/d)，造模后通过灌胃(如表3所示)给予小鼠13-甲基-巴马汀以及空白溶剂，连续14天后检测各组小鼠心脏功能。
表3.各组动物给药及饮食情况
3.4观察期实验过程中进行一般生命体征观察。
3.5主要检测指标
(1)灌胃14天后，小动物超声检测各组小鼠心脏功能变化。
(2)心脏HE Masson切片染色
(3)测定心肌组织胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化。
3.6小鼠心脏功能检测
同实施例2的3.6。
3.7小鼠心肌纤维化心脏切片染色
同实施例2的3.7。
3.8测定心肌组织胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖分化。
同实施例2的3.8。
4.实验数据与结果
4.1数据处理
定量数据以均值±标准差(mean±SEM)表示，数据采用Graphpad 8.0软件进行统计分析。2组间比较采用t检验；3组或3组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Turkey’s多重比较检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。
4.2实验结果
如图8所示，小鼠冠状动脉左前降支结扎14天后，心肌纤维化模型组与假手术组小鼠相比射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)明显降低，而13-甲基-巴马汀低、中、高剂量组与心肌梗死模型组相比，呈剂量依赖性升高。
如图9所示，心肌纤维化模型组与假手术组相比，心肌细胞紊乱与心肌纤维化状况明显增加，而给予13-甲基-巴马汀低中高剂量后，则能显著改善心肌梗死小鼠心肌细胞紊乱与心肌纤维化，且13-甲基-巴马汀各组与心肌纤维化模型组比，心肌纤维化改善效果明显，呈剂量依赖性。
如图10所示，心肌纤维化模型组与假手术组相比，心肌组织胶原Ⅰ蛋白水平和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化相关蛋白水平表达明显升高，而给予13-甲基-巴马汀低中高剂量后，则能显著改善心肌组织胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化，且13-甲基-巴马汀各组与心肌梗死模型组比，心肌纤维化改善效果明显，呈剂量依赖性。
以上结果表明13-甲基-巴马汀具有减轻小鼠心肌纤维化的作用，且呈剂量依赖性。
实施例5：本发明产品的功效性试验2--抗心肌纤维化的药效学研究2
1.实验材料
实验动物：40只体重均匀的小鼠
受试物：13-甲基-巴马汀，巴马汀
2.实验原理
通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌纤维化的小鼠模型，再给予小鼠受试药物，可检测受试物对心肌纤维化的影响，并可判定受试物对心肌纤维化小鼠的心脏功能的影响。
3.实验方法
3.1动物分组
随机分组：动物接收后，适应性喂养3天，适应期结束后，ICR小鼠称重，按照体重随机分为4组，即假手术组、心肌纤维化模型组、13-甲基-巴马汀组(10mg/kg/d)、巴马汀组(9.7mg/kg/d)。
3.2心肌纤维化模型建立
小鼠心肌纤维化模型是通过结扎小鼠冠状动脉左前降支建立的。健康的雄性ICR小鼠(30±2g)用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射进行麻醉,并将已麻醉的小鼠仰卧位固定于鼠操作台上，连接呼吸机。左胸部皮肤做左上到右下斜切口，约0.5～1.0cm，分离胸小肌及前锯肌，于第4、5肋间钝性分离肋间肌，轻轻推挤出心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘1～2mm处穿一根7/0结扎线，进行冠状动脉结扎，结扎后可见心尖处颜色出现苍白。
3.3给药及造模期：将适应性喂养后的SPF级别的小鼠随机称重，按照体重随机分为4组，即假手术组、心肌纤维化模型组、13-甲基-巴马汀组(10mg/kg/d)、巴马汀组(9.7mg/kg/d)，造模后通过灌胃(如表4所示)给予小鼠13-甲基-巴马汀以及空白溶剂，连续14天后检测各组小鼠心脏功能。
表4.各组动物给药及饮食情况
3.4观察期
实验过程中进行一般生命体征观察。
3.5主要检测指标
(1)灌胃14天后，小动物超声检测各组小鼠心脏功能变化。
(2)梗死心脏HE、Masson切片染色
(3)测定心肌组织胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化。
3.6小鼠心脏功能检测
同实施例2的3.6。
3.7小鼠心肌纤维化心脏切片染色
同实施例2的3.7。
3.8测定心肌组织胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖分化。
同实施例2的3.8。
4.实验数据与结果
4.1数据处理
定量数据以均值±标准差(mean±SEM)表示，数据采用Graphpad 8.0软件进行统计分析。2组间比较采用t检验；3组或3组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Turkey’s多重比较检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。
4.2实验结果
如图11所示，小鼠冠状动脉左前降支结扎14天后，心肌纤维化组与假手术组小鼠相比射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)明显降低，而13-甲基-巴马汀组和巴马汀组可逆转此损伤，但13-甲基-巴马汀药效显著优于巴马汀。
如图12所示，心肌纤维化模型组与假手术组相比，心肌细胞紊乱与心肌纤维化状况明显增加，而13-甲基-巴马汀组和巴马汀组可逆转此损伤，但13-甲基-巴马汀药效显著优于巴马汀。
如图13所示，心肌纤维化模型组与假手术组相比，心肌组织胶原Ⅰ蛋白水平和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化相关蛋白水平表达明显升高，而13-甲基-巴马汀组可逆转此损伤，但巴马汀组未见逆转作用。
以上结果表明13-甲基-巴马汀减轻小鼠心肌纤维化的作用显著优于巴马汀。

Claims (10)

1.13-甲基-巴马汀在制备抗心肌梗死和心肌纤维化药物中的用途，其特征在于，所述的13-甲基-巴马汀具有式I所示的结构：
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物能够显著改善梗死心脏的心功能，表现为增加梗死心脏的射血分数和短轴缩短率。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物能够减轻梗死心脏的心肌细胞组织紊乱。
4.如权利要求1述的用途，其特征在于，所述的药物能够降低心肌梗死动物心肌细胞凋亡。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物能够显著改善纤维化心脏的心功能，表现为提高纤维化心脏的射血分数和短轴缩短率。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物能够抑制纤维化心脏组织中心肌成纤维细胞增殖与细胞外基质沉积。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物能够降低心肌纤维化动物心肌组织中胶原I的沉积和心肌成纤维细胞的异常增殖与分化。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为将13-甲基-巴马汀制备成胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、注射剂。
9.一种用于抗心肌梗死和心肌纤维化的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的有效成分为13-甲基-巴马汀。
10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物所述药物为将13-甲基-巴马汀制备成胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒剂、注射剂。
CN202310735507.0A 2023-05-11 2023-06-21 13-甲基-巴马汀在制备抗心肌缺血损伤和心脏纤维化药物中的用途 Pending CN116602966A (zh)

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