CN116574188A - 抗敌草快的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗敌草快的抗体及其应用。本发明客服技术壁垒，应用一种新的半抗原分子，制备与敌草快具有高亲和力的抗体，且能够避免与敌草快结构类似的百草枯、草铵膦、草甘膦等非选择性除草剂的交叉干扰，对于敌草快的免疫检测具有重大意义。

Description

抗敌草快的抗体及其应用
发明名称
抗敌草快的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗敌草快的抗体及其应用。
背景技术
随着农业和畜牧业的发展，由于防治病虫害的需要，人们扩大了各种农药、兽药的使用范围及其用量，从而提高了农、牧业的产量，但同时也带来了一些药物残留对农产品和饲料的污染问题，造成了对人类健康的威胁，成为全球范围内的共性问题。
敌草快（diquat，DQ）化学名称为化学名称为1,1'-亚乙基-2,2'-联吡啶二溴盐，是无色至淡黄色结晶，蒸气压<0.01 MPa，在水中溶解度（20℃）为700 g/L，微溶于乙醇和羰基溶剂，不溶于非极性有机溶剂。在酸性和中性溶液中稳定，但在碱性条件下不稳定。1957年由英国首次在世界上开发应用，因其成本低、起效快、污染少，在世界各国得到广泛利用。近年来随着百草枯水剂在国内市场的禁售，敌草快在国内除草剂市场销售量随之剧增，敌草快一般用于传导性触杀灭生性除草剂，可迅速被绿色植物组织吸收，与土壤接触后很快失去活性·用于大田、果园、非耕地、收割前等除草，也可以用作马铃薯和地瓜的茎叶催枯。
农药残留是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、气降解物和杂质的总称。施用于作物上的农药，其中一部分附着于作物上，一部分散落在土壤、大和水等环境中，环境残存的农药中的一部分又会被植物吸收。残留农药直接通过植物果实或水、大气到达人、畜体内，或通过环境、食物链最终传递给人、畜，并对人、环境、市场经济等造成危害。
随敌草快用量增加，敌草快中毒的病例报告亦明显增多。敌草快中毒多见于发展中国家的农村，目前国内尚缺乏其发病率的统计数据。尽管敌草快相较百草枯毒性弱，但仍具有较高的病死率。研究发现，敌草快对肾脏、肺脏、心脏等均可产生损害，尤其早期便可引起急性严重肾衰竭，严重中毒者可导致多脏器功能衰竭。敌草快为中毒除草剂，大鼠急性经口LD50为231 mg/kg，小鼠急性经口LD50为125 mg/kg。通过循环式的氧化还原反应使体内氧化与抗氧化作用失衡，平衡向氧化方向倾斜，诱导中性粒细胞炎性浸润，分泌出大量溶酶体酶，产生大量活性氧、活性氮类物质，引发氧化应激。过量的活性氧、活性氮物等氧化还原产物破坏细胞DNA、生物膜脂质、蛋白质和其他大分子，引发以脂质过氧化为代表的一系列损伤，使细胞的膜结构的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能改变，细胞损伤、死亡。其中胃肠道和肾脏的损害最为严重，其次还包括肝脏、肺脏、心脏等。因此，建立敌草快的快速检测方法具有重要临床意义。
世界各国，特别是发达国家对农药残留问题高度重视，对各种农副产品中农药残留都规定了越来越严格的限量标准。许多国家以农药残留限量为技术壁垒，限制农副产品进口，保护农业生产。敌草快单克隆抗体应用市场包括但不仅限于：①用于检测农产品、水质中残余敌草快，保障食品安全，减少农药中毒事件，有利于农业的发展。②检测土壤、环境中敌草快残留，指导敌草快的合理使用，维护生态环境。③检测敌草快中毒，指导治疗。
目前对于敌草快的检测方法有化学分析法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳质谱联用法和液相色谱质谱联用法。化学分析法通过化学反应检测敌草快含量，但其灵敏度较低，无法进行痕量分析；紫外分光光度法通过测量敌草快的吸收光谱，确定其浓度，但同样无法进行痕量分析；质谱法检测敌草快灵敏度可达20 ng/mL以下，但仪器价格昂贵，耗时较长，且操作方法繁琐、需专业人员进行操作，较难推广。而免疫学检测技术具有经济、快速、技术要点低、操作简便且可实现现场检测等优点，该方法关键在于制备特异性识别敌草快的单克隆抗体，但由于小分子单克隆抗体（分子量小于10000）无免疫原性，需偶联载体蛋白后方可免疫制备抗体，因此抗体制备难度较高；同时百草枯、草铵膦、草甘膦等非选择性除草剂与敌草快结构近似，容易导致抗体产生交叉干扰，所以目前尚无可特异性识别敌草快的抗体。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种新的抗敌草快抗体，能够高特异性的结合敌草快分子，且不会产生交叉干扰。
具体如下：
特异性结合式I化合物的抗体
式I
其特征在于，所述抗体还与敌草快结合。
优选的，所述抗体为单克隆抗体。
优选的，如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有如下互补决定区：
a)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；和
f)如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3。
优选的，所述抗体具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。
优选的，所述抗体不与百草枯、草铵膦或草甘膦结合。
本发明另一方面提供了抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）用所述式I化合物制备完全抗原；
（2）用所述完全抗原免疫实验动物，从而诱导产生与所述完全抗原结合的抗体的B-细胞；
（3）或者通过杂交瘤技术或者通过B-细胞PCR技术，获得由B-细胞产生的结合所述完全抗原的单克隆抗体；
（4）选择步骤（3）的抗体与敌草快的结合和选择那些不与百草枯、草铵膦、或草甘膦结合的抗体。
本发明式I化合物为半抗原，不能直接免疫动物，需要处理为完全抗原才能免疫实验动物。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包所述的抗体。
另一方面，本发明提供了一种结合物，所述结合物包含与化学标记或生物标记共价连接的所述的抗体。
另一方面，本发明提供了一种偶联物，由所述的抗体、或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
另一方面，本发明提供了根据所述的抗体或所述的结合物或所述的偶联物在制备检测敌草快表达的产品中的应用。
另一方面，本发明提供了所述的式I化合物在制备抗敌草快抗体中的应用。
术语解释：
本发明所述“抗体”：包括各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。根据本发明的抗体优选是山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠抗体，嵌合抗体或进一步的基因工程抗体，只要保留根据本发明的特征性质。根据本发明的特性可以是单克隆抗体也可以是多克隆抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；单链抗体分子；scFv、sc(Fv)2；双抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一氨基酸组成的抗体分子的制剂。是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能突变（例如天然存在的突变）之外，构成群体的个别抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体不是离散抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，这种单克隆抗体一般包括包含结合靶的多肽序列的抗体，其中所述靶结合性多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合性多肽序列的方法获得。例如，选择方法可以是从多个克隆中选择独特的克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库。应当理解，可以进一步改变选择的靶结合性序列，例如，以提高对靶的亲和力、以使靶结合性序列人源化、以改善其在细胞培养物中的产生、以降低其在体内的免疫原性、以产生多特异性抗体等，且包含改变的靶结合性序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与一般包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制剂由于它们一般不被其他免疫球蛋白污染而是有利的。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们表现出所期望的生物活性
在抗体的上下文中使用的术语“分析物特异性结合”是指抗体与其在分析物上的靶表位的免疫专一相互作用，即，抗体与分析物上的表位的结合。抗体通过其在分析物上的表位的分析物特异性结合的概念对于本领域技术人员来说是完全清楚的。
“半抗原”是小分子（例如，杀虫剂、杀真菌剂、药物、激素、毒素、合成肽等），其不直接诱导免疫应答，例如抗体的形成。已经确立了通过将半抗原与免疫原性载体（例如抗原性大分子）缀合来产生针对其的抗体的技术。对本公开内容来说，式I为半抗原，其直到并且除非与免疫原性载体如蛋白质缀合，否则不引起免疫应答。一旦形成抗体，它就可以与半抗原结合。由此产生的抗体可用于许多领域，特别是在免疫诊断试剂盒或生物传感器的开发中。在根据式I的化合物的公开内容上下文中的半抗原，作为化合物的部分的半抗原被理解为与化合物的剩余部分共价偶联，其中半抗原部分仅当附着于免疫原性载体如时才能够引起免疫应答。
术语“实验动物”表示非人动物。在一个实施方案中，实验动物选自大鼠、小鼠、仓鼠、兔、骆驼、美洲驼、非人灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、鲨鱼和爬行动物。在一个实施方案中，实验动物是小鼠。
有益效果：利用一种新的半抗原制备高特异性的抗敌草快单克隆抗体，本发明所述抗体特异性的结合半抗原和敌草快，且能够避免与敌草快结构类似的百草枯、草铵膦、草甘膦等非选择性除草剂的交叉干扰。
具体实施方式
具体为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”及其变体旨在是开放式的不排除附加行为或结构的可能性的过渡性短语、术语或词语。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1 免疫原制备
（1）半抗原的制备
由于敌草快小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将敌草快偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活性基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于敌草快分子结构式中不含有此类活性基团，因此需要衍生；我们设计并合成了化合物5作为敌草快的半抗原，具体合成路线如下。
化合物2的合成
将干燥过的二异丙胺(1 mL, 7.1 mmol)溶解在超干的四氢呋喃(50 mL)中，氮气置换三次后保持氮气氛围；用干冰丙酮浴将上述混合物冷却至-78℃；将正丁基锂(1.6 M正己烷溶液， 3.8 mL, 6.1 mmol)缓慢滴加到上述反应混合物中，保持内温低于-70℃；滴加完毕后保持-70℃下搅拌30分钟；将化合物1(681 mg, 4 mmol)溶于超干四氢呋喃(15 mL)中，缓慢滴加到上述反应混合物中，保持内温低于-70℃；滴加完毕后保持-70℃下搅拌60分钟；将1,3-二溴丙烷(4 g, 20 mmol)溶于超干四氢呋喃(15 mL)中，缓慢滴加到上述反应混合物中，保持内温低于-70℃；滴加完毕后不撤冷浴，自然升温至室温后搅拌过夜；向反应混合物中小心加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取2次；合并有机相后用饱和食盐水洗一次后用无水硫酸钠干燥；将有机相于45℃减压真空浓缩；所得残余物用柱层析纯化，得到约926 mg白色固体。MS Found：[M+1]+=292.19；1H NMR (300MHz, CDCl3): 8.67 (d, 1H), 8.51 (d, 1 H), 8.36 (d, 1 H), 8.31 (d, 1 H), 7.81 (d, 1 H), 7.64 (dd, 1H), 7.31-7.29 (m, 1 H), 3.41 (t, 2 H), 2.70 (t, 2 H), 1.91 (m, 2 H), 1.70 (m,2 H)
化合物3的合成
将丙二酸二乙酯(0.72 g, 4.5 mmol) 溶解在超干的四氢呋喃(20 mL)中，氮气置换三次后保持氮气氛围；用冰水浴将上述混合物冷却至0℃；将氢化钠(60%, 0.18 g, 4.5mmol)一次性加入到上述反应混合物中，保持0-20℃下搅拌30分钟；将化合物2(926 mg, 3mmol)溶于超干四氢呋喃(10 mL)中，缓慢滴加到上述反应混合物中，滴加完毕后将反应混合物升温至60℃， 并在60℃下搅拌3小时；将反应混合物冷却至室温后倒入饱和食盐水中，乙酸乙酯萃取2次后合并有机相，再用饱和食盐水洗一次后用无水硫酸钠干燥；将有机相于45℃减压真空浓缩；所得残余物用柱层析纯化，得到约1 g白色固体。MS Found：[M+1]+=371.45
化合物4的合成
将化合物3(1 g,2.7 mmol)溶于乙醇(20 mL)中，加入6N盐酸水溶液(20 mL)；将反应混合物升温至80℃，并在80℃下搅拌6小时；将反应液冷却至室温后于45℃减压真空浓缩；所得残余物用丙酮打浆后得到约700 mg白色固体。MS Found：[M+1]+=257.31
化合物5的合成
将上一步所得化合物4(700 mg, 2.1 mmol)，分散在二溴乙烷(10 mL)中；氮气置换三次后保持氮气氛围；将反应混合物升温至125℃，并在125℃下搅拌6小时；将反应液冷却至室温后过滤，少量二氯甲烷洗滤饼；将滤饼用丙酮打浆后过滤，于45℃减压真空干燥；将所得残余物用Pre-HPLC纯化，得到326 mg白色固体。MS Found：[M+1]+=284.36
（2）完全抗原的制备
完全抗原DQ-BSA的制备：称取1.5 mg 敌草快半抗原（化合物5）溶于300 μl 20 mM磷酸盐缓冲溶液中（PBS，pH为7.2的PBS中），0.87 mg N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，溶解于87μL 20 mM PBS中（pH为7.2），再称取 1.92 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）溶于192 μL 20 mM PBS中（pH为7.2），将以上三者混合，室温搅拌反应30min，得到A液；取2.25 mg BSA，加450 μL 20 mM PBS溶解 (称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应4小时；然后用20 mM PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原DQ-BSA，并通过紫外全波长扫描方法进行鉴定。
实施例2 抗体制备
（1）小鼠免疫及抗体检测
将弗氏完全佐剂与浓度为2 mg/mL的DQ-BSA蛋白按等体积混合并乳化，挑选6只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用背部皮下注射的免疫方式，免疫剂量为0.1 mg/只。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射50 μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并通过ELISA检测血清效价。筛选血清效价106以上的小鼠，取脾脏分离B淋巴细胞用于细胞融合。
（2）杂交瘤细胞融合
取上述尾血效价达标小鼠脾脏，研磨，裂红，制备B细胞。将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按1：1混合，然后进行电融合，得到杂交瘤细胞。随后将杂交瘤细胞加入1.2%甲基纤维素半固体培养基中，再添加HAT、抗支原体药物、饲养层细胞充分混匀，铺板。置培养箱培养3-4天后补加DMEM完全培养基，连续培养13天后，取细胞上清进行ELISA抗体筛选。
（3）抗体筛选
本发明目标是筛选与敌草快高亲和力、且与其他除草剂无交叉的抗体。所以我们设计筛选方案如下：
①用包被液（0 .05 M pH 9 .5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液）将全抗原DQ-BSA稀释至1 μg/mL，按照100 μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0 .05％Tween -20的PBS缓冲液（洗板液）洗板3次。
②将用稀释液（1％BSA，0 .1％PBST）按照1∶1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照50 μL/孔加入酶标板；同时用稀释液稀释不同浓度的敌草快或百草枯，敌草快浓度为1 μg/mL，百草枯浓度为100 μg/mL，使用不添加百草枯和敌草快的稀释液作为对照，按照50 μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。
③用洗板液3次洗板后每孔加入100 μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟（视反应强弱而定）之后加入2 M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。
结果如下：细胞株C显色信号值明显偏弱，说明其不识别全抗原DQ-BSA，不符合筛选标准；细胞株A、B、D（对照孔）显色强度值高，细胞株A加入敌草快后，其信号值明显降低（信号值减少89%），说明敌草快与全抗原DQ-BSA竞争性结合细胞上清中抗体，细胞株A上清抗体对敌草快亲和力强，同时加入高浓度百草枯、草铵膦、草甘膦后，其信号值未明显降低（信号值分别减少11%、减少3%、增加6%），说明百草枯、草铵膦、草甘膦未与全抗原DQ-BSA竞争性结合细胞上清中抗体，抗体特异性良好，符合筛选标准；细胞株B加入敌草快后，其信号值未明显降低（信号值减少37%），说明敌草快与全抗原DQ-BSA未竞争性结合细胞上清中抗体，该抗体对敌草快亲和力低，因此不符合筛选标准；细胞株D加入百草枯后，其信号值明显降低（信号值减少73%），说明百草枯与全抗原DQ-BSA竞争性结合细胞上清中抗体，此抗体特异性较差，不符合筛选标准。
综上，选择细胞株A。
表1 细胞株筛选
（4）单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System -HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为：
①用包被液（0 .05 M pH 9 .5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液）将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100 μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0 .05％Tween -20的PBS缓冲液（洗板液）洗板3次。
②用稀释液（1％BSA，0 .1％PBST）按照1∶1稀释待检杂交瘤细胞（细胞株A）的培养上清，按照 100 μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。
③用稀释液将对应的酶标抗体（Ig A-HRP，IgG1 -HRP，IgG2a -HRP，IgG2b-HRP，IgG3 -HRP，IgM -HRP，kappa -HRP，lamda -HRP）1∶3000稀释。用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟（视反应强弱而定）之后加入2M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。经过鉴定，抗体A的重链亚型均为IgG1，轻链为Kappa（IgG1及Kappa对应的酶标板上的孔显色）。
根据抗体亚型结果，采用基于RACE技术路线的方法克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，使用总RNA提取试剂盒获得杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的SMARTer RACE说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，并扩增目的抗体全长序列。
（5）单克隆抗体的生产纯化
选择两组6 -8周BALB/c小鼠，腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向一组小鼠腹腔内注入0 .5mL的杂交瘤细胞（细胞株A），细胞数量约1×106数量。两周之后开始腹水搜集。搜集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体A。
实施例3 抗体性能实验
①用包被液（0 .05 M pH 9 .5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液）将全抗原DQ-BSA稀释至1 μg/mL，按照100 μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0 .05％Tween -20的PBS缓冲液（洗板液）洗板3次。
②将纯化后抗体A用稀释液稀释至0.1ug/ml，按照50μL/孔加入酶标板，同时用稀释液稀释不同浓度的敌草快、百草枯、草铵膦、草甘膦（非选择性除草剂），稀释终浓度分别为500 ng/ml、167 ng/ml、56 ng/ml、19 ng/ml、6 ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml，同时不添加非选择性除草剂作为对照，按照50 μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。
③用洗板液3次洗板后每孔加入100 μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟（视反应强弱而定）之后加入2 M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。
表2抗体性能验证
结果如表2所示，经鉴定，抗体A对全抗原DQ-BSA具有较高亲和力（除草剂浓度为0时，显色值为1.7作用）；在反应体系中添加敌草快后，显色值随添加敌草快浓度升高而降低，说明敌草快与全抗原DQ-BSA竞争性结合抗体A的位点，导致反应显色降低；而反应体系中添加百草枯、草铵膦、草甘膦等其他非选择性除草剂后，显色值并未随之改变，说明百草枯、草铵膦、草甘膦等除草剂不会影响抗体A与全抗原DQ-BSA的结合，抗体A不识别百草枯、草铵膦、草甘膦；所以，抗体A可特异性识别非选择性除草剂敌草快，不受百草枯等其他非选择性除草剂的干扰。
实施例4 抗体稳定性验证
①取抗体A 1 mL分别于4℃存放14天、37℃加速14天。
②用包被液（0 .05 M pH 9 .5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液）将全抗原DQ-BSA稀释至1 μg/mL，按照100 μ L/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0 .05％Tween -20的PBS缓冲液（洗板液）洗板3次。
③将4℃存放14天的抗体A与37℃加速14天后的抗体A分别用稀释液稀释至1000ng/ml、333 ng/ml、111 ng/ml、37 ng/ml、12 ng/ml、4 ng/ml、1 ng/ml，按照100 μL/孔加入酶标板，以加入100 μl稀释液作为空白对照，于37℃孵育30分钟。
③用洗板液3次洗板后每孔加入100 μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟（视反应强弱而定）之后加入2 M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。
表3抗体稳定性验证
结果如表3所示，经鉴定，37℃加速14天后，抗体A的ELISA效价与4℃存放14天的抗体A效价一致，说明抗体A较稳定。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.特异性结合式I化合物的抗体，
其特征在于，所述抗体还与敌草快结合。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有如下互补决定区：
a)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；和
f)如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3。
4.如权利要求1-3任意一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体不与百草枯、草铵膦或草甘膦结合。
5.权利要求4所述的抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用根据权利要求1的式I化合物制备完全抗原；
（2）用所述完全抗原免疫实验动物，从而诱导产生与所述完全抗原结合的抗体的B-细胞；
（3）或者通过杂交瘤技术或者通过B-细胞PCR技术，获得由B-细胞产生的结合所述完全抗原的单克隆抗体；
（4）选择步骤（3）的抗体与敌草快的结合和选择那些不与百草枯、草铵膦、或草甘膦结合的抗体。
6.一种敌草快检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-4中任意一项所述的抗体。
7.一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1-4中任意一项所述的抗体。
8.一种偶联物，由第一物质与固体介质或半固体介质偶联形成，
其特征在于，所述第一物质选自权利要求1-4任意一项所述的抗体、权利要求7所述的结合物中的至少一种。
9.根据权利要求1-4任意一项所述的抗体或权利要求7所述的结合物或权利要求8所述的偶联物在制备检测敌草快表达的产品中的应用。
10.如权利要求1中所述的式I化合物在制备抗敌草快抗体中的应用。
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