CN103788208A - 一种抗除草剂伏草隆的特异性抗体 - Google Patents

一种抗除草剂伏草隆的特异性抗体 Download PDF

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Abstract

除草剂伏草隆的半抗原、人工抗原和抗体的制备涉及具有除草剂伏草隆基本结构的半抗原、人工抗原和抗体的制备。本发明以简便的方法制备了特异性良好的除草剂伏草隆的抗体。该方法是以N-甲基已酸或N-甲基已酸与3-(三氟甲基)异氰酸苯酯合成半抗原，然后分别与牛血清白蛋白(BSA)和辣根过氧化酶(HRP)连接合成人工抗原和酶标抗原。人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗血清，纯化制得抗体。该抗体稳定，具有良好的特异性和灵敏度，且合成方法简单，可用于环境、农产品和食品中除草剂伏草隆残留的快速免疫检测，具有良好的应用前景。

Description

一种抗除草剂伏草隆的特异性抗体
技术领域
本发明涉及选择一种最大可能包含伏草隆征结构的化合物作为伏草隆半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
除草剂是近20年来逐渐发展起来的一种农药类型，随着化学工业的发展，除草剂的品种也逐渐增多。在我国研制和投产的除草剂也已达数十种。有些除草剂具有致畸作用，除草剂的安全性已经引起人们的关注，应注意除草剂对环境的污染和人畜毒性作用问题。使用除草剂能在粮食等中残留，通过食物链而使人畜发生慢性危害作用。我国国家标准《食品中伏草隆最大残留限量标准》(GB16323-1996)规定伏草隆最大残留限量为：玉米≤0.05mg/kg、甘蔗≤0.05mg/kg，是食品必须检测的安全指标，一般传统上采用气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或气相色谱质谱法联用等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难于满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。免疫分析技术是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术，开发伏草隆的免疫分析方法是满足当前食品安全检测的需求的重要技术途径。
发明内容
本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量测定伏草隆的量。伏草隆由于其分子量小于1000dolton(道尔顿)，不具备免疫原性，不能直接免疫动物获得抗体，因此本发明为达到以上目的所设计的技术方案是。
需要解决的问题：
针对上述情况，当前急需一种简易快速有效地检测伏草隆的方法。本发明的目的是通过制备伏草隆的人工抗原，免疫动物诱导产生亲合性很高的特异性抗体；并以此为基础建立了ELISA方法即快速免疫分析方法，准确检测杏仁伏草隆。
技术方案
1.使用分子式为
Figure BSA00000797445300021
的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大耳兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体；
2.除草剂伏草隆人工抗原的制备步骤
(1)N-甲基丁酸、N-甲基已酸的合成
在100mL烧瓶中加入27.5mL双蒸水，4mL(4.064g)N-甲基吡咯烷酮和5.7gBa(OH)2·8H2O，在电热套上加热回流状态下反应3h。反应完成后在4℃静置12h后用滤纸过滤除去析出的白色Ba(OH)2，在旋转蒸发仪上蒸干滤液，得到粗品N-甲基丁酸。粗品在热水浴中用无水乙醇-乙醚(V无水乙醇∶V乙醚＝1∶1)溶解后，过滤，冷却结晶得到白色针状结晶物为N-甲基丁酸。
在100mL烧瓶中加入46.8mL双蒸水，5.416mL(1.340g)N-甲基己内酰胺和2.884mL浓H2SO4，在加热回流10h后于搅拌状态下趁热加入Ba(OH)2固体，调节pH值达到10，在冰箱静置24h后过滤除去白色BaSO4沉淀，并用少量蒸馏水清洗，洗液并入滤液中，在旋转蒸发仪上蒸干滤液，得到粗品N-甲基己酸(二水合物)。粗品在热水浴中无水乙醇/乙醚(V无 水乙醇∶V乙醚＝1∶1)溶解，过滤，重结晶两次，得到白色针状结晶物为N-甲基已酸。
(2)半抗原的合成
取2.0mmoLN-甲基丁酸(N-甲基已酸)和2.0mmoL3-(三氟甲基)异氰酸苯酯溶解于4.2mL1mol/LNaOH溶液中，搅拌反应2h后过滤，弃沉淀物。用浓盐酸调滤液的pH至2，此时溶液呈乳白色，静置过夜，待固体粗品析出后弃去上层水溶液。粗品先经薄层色谱(TLC)鉴定(其中展开剂为：正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸＝49∶49∶2)有无新点出现，若有新物质产生再经质谱鉴定产物分子量。用乙醇/水(V无水乙醇∶V水＝1∶2)对粗品重结晶两次。
(3)称取4.307mg半抗原于一棕色小瓶中，加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，半抗原溶解后再分别称取8.711mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、6.242mg N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；
(4)人工抗原的合成
将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml pH＝7.4的PBS缓冲液中所配置的溶液中，4℃反应过夜，反应产物于4℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存；
3.伏草隆酶标抗原的制备步骤
准确称取1mg半抗原于4mL的小棕瓶中，加入100μLDMF，使半抗原完全溶解，然后加入1mgDCC，1mgNHS，室温搅拌4h，得到白色浑浊物。1600r/min离心取上清液记得到活化酯溶液。准确称取5mgHRP溶于1mL磷酸氢二钾中，将活化酯溶液缓慢滴加到蛋白溶液中，直到滴加完毕。得到的溶液4℃搅拌过夜后取出用1倍PBS透析3天得到酶标抗原加入等体积甘油置于-20℃保存备用；
4.除草剂伏草隆抗体的制备方法：
免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周，6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：
初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；
加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；
抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗伏草隆的特异性抗体。
本发明的优点和积极效果
1.本发明最大程度地保留了伏草隆的化学结构，为国内外首创的新化合物，用此半抗原制备的免疫抗原去免疫动物最大可能保留了原来伏草隆的分子结构，这为获得对伏草隆有高度特异性的抗体提供了保证。
2.在合成伏草隆半抗原的基础上，合成其活化酯能大大提高半抗原与大分子蛋白的联结率。
3.本发明，具有特异、灵敏、准确、快速、廉价等特点，所设计、合成的半抗原为制备特异性良好的抗体奠定了基础。
4.经试验验证，上述半抗原，其合成方法较简单，且所用主要原料价格低廉、容易获得，在一般化学试剂公司均可购得。
5.本发明经试验验证上述半抗原，其合成方法简便，合成效率高，反应步骤少，提高了反应的可控性；另外，合成产物的提取、纯化方法简便，易于推广普及。
具体实施方式
下面对本发明实施例做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：
1.使用分子式为
Figure BSA00000797445300041
的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大耳兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体；
2.除草剂伏草隆人工抗原的制备步骤
(1)N-甲基丁酸、N-甲基已酸的合成
在100mL烧瓶中加入27.5mL双蒸水，4mL(4.064g)N-甲基吡咯烷酮和5.7gBa(OH)2·8H2O，在电热套上加热回流状态下反应3h。反应完成后在4℃静置12h后用滤纸过滤除去析出的白色Ba(OH)2，在旋转蒸发仪上蒸干滤液，得到粗品N-甲基丁酸。粗品在热水浴中用无水乙醇-乙醚(V无水乙醇∶V乙醚＝1∶1)溶解后，过滤，冷却结晶得到白色针状结晶物为N-甲基丁酸。
在100mL烧瓶中加入46.8mL双蒸水，5.416mL(1.340g)N-甲基己内酰胺和2.884mL浓H2SO4，在加热回流10h后于搅拌状态下趁热加入Ba(OH)2固体，调节pH值达到10，在冰箱静置24h后过滤除去白色BaSO4沉淀，并用少量蒸馏水清洗，洗液并入滤液中，在旋转蒸发仪上蒸干滤液，得到粗品N-甲基己酸(二水合物)。粗品在热水浴中无水乙醇/乙醚(V无 水乙醇∶V乙醚＝1∶1)溶解，过滤，重结晶两次，得到白色针状结晶物为N-甲基已酸。
(2)半抗原的合成
取2.0mmoLN-甲基丁酸(N-甲基已酸)和2.0mmoL3-(三氟甲基)异氰酸苯酯溶解于4.2mL1mol/LNaOH溶液中，搅拌反应2h后过滤，弃沉淀物。用浓盐酸调滤液的pH至2，此时溶液呈乳白色，静置过夜，待固体粗品析出后弃去上层水溶液。粗品先经薄层色谱(TLC)鉴定(其中展开剂为：正己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸＝49∶49∶2)有无新点出现，若有新物质产生再经质谱鉴定产物分子量。用乙醇/水(V无水乙醇∶V水＝1∶2)对粗品重结晶两次。
(3)称取4.307mg半抗原于一棕色小瓶中，加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，半抗原溶解后再分别称取8.711mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、6.242mg N，N-二环已基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；
(4)人工抗原的合成
将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml pH＝7.4的PBS缓冲液中所配置的溶液中，4℃反应过夜，反应产物于4℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存；
3.伏草隆酶标抗原的制备步骤
准确称取1mg半抗原于4mL的小棕瓶中，加入100μLDMF，使半抗原完全溶解，然后加入1mgDCC，1mgNHS，室温搅拌4h，得到白色浑浊物。1600r/min离心取上清液记得到活化酯溶液。准确称取5mgHRP溶于1mL磷酸氢二钾中，将活化酯溶液缓慢滴加到蛋白溶液中，直到滴加完毕。得到的溶液4℃搅拌过夜后取出用1倍PBS透析3天得到酶标抗原加入等体积甘油置于-20℃保存备用；
4.除草剂伏草隆抗体的制备方法：
免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周，6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：
初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；
加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；
抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗伏草隆的特异性抗体。

Claims (4)

1.除草剂伏草隆的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为
的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大耳兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体。
2.权利要求1所述的除草剂伏草隆人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：
(1)N-甲基丁酸、N-甲基已酸的合成
在100mL烧瓶中加入27.5mL双蒸水，4mLN-甲基吡咯烷酮和5.7g Ba(OH)2·8H2O，在电热套上加热回流状态下反应3h，反应完成后在4℃静置12h后用滤纸过滤除去析出的白色Ba(OH)2，在旋转蒸发仪上蒸干滤液，得到粗品N-甲基丁酸。粗品在热水浴中用1∶1无水乙醇-乙醚溶解后，过滤，冷却结晶得到白色针状结晶物为N-甲基丁酸；
在100mL烧瓶中加入46.8mL双蒸水，5.416mLN-甲基己内酰胺和2.884mL浓H2SO4，在加热回流10h后于搅拌状态下趁热加入Ba(OH)2固体，调节pH值达到10，在冰箱静置24h后过滤除去白色BaSO4沉淀，并用少量蒸馏水清洗，洗液并入滤液中，在旋转蒸发仪上蒸干滤液，得到粗品N-甲基己酸(二水合物)，粗品在热水浴中以1∶1无水乙醇/乙醚溶解，过滤，重结晶两次，得到白色针状结晶物为N-甲基已酸；
(2)半抗原的合成
取2.0mmoLN-甲基丁酸(N-甲基已酸)和2.0mmoL3-(三氟甲基)异氰酸苯酯溶解于4.2mL1mol/LNaOH溶液中，搅拌反应2h后过滤，弃沉淀物，用浓盐酸调滤液的pH至2，此时溶液呈乳白色，静置过夜，待固体粗品析出后弃去上层水溶液，粗品先经薄层色谱鉴定有无新点出现，若有新物质产生再经质谱鉴定产物分子量。用1∶2乙醇/水对粗品重结晶两次。
(3)称取4.307mg半抗原于一棕色小瓶中，加入200μl二甲基亚砜，半抗原溶解后再分别称取8.71lmg N-羟基琥珀酰亚胺、6.242mg N，N-二环已基碳二亚胺加入上述半抗原的二甲基亚砜溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；
(4)人工抗原的合成
将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml pH＝7.4的PBS缓冲液中所配置的溶液中，4℃反应过夜，反应产物于4℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存。
3.权利要求1所述的伏草隆酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得： 
准确称取1mg半抗原于4mL的小棕瓶中，加入100μLDMF，使半抗原完全溶解，然后加入1mgDCC，1mgNHS，室温搅拌4h，得到白色浑浊物，1600r/min离心取上清液记得到活化酯溶液。准确称取5mgHRP溶于1mL磷酸氢二钾中，将活化酯溶液缓慢滴加到蛋白溶液中，直到滴加完毕，得到的溶液4℃搅拌过夜后取出用1倍PBS透析3天得到酶标抗原加入等体积甘油置于-20℃保存备用。
4.权利要求1所述的除草剂伏草隆抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：
免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周，6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：
初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；
加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；
抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗伏草隆的特异性抗体。 
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