CN116555467A - 与小麦籽粒硬度相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应用，涉及作物分子遗传育种技术领域。本发明通过筛选鉴定到一个影响小麦籽粒硬度的位点，经检测该位点与小麦籽粒硬度性状显著相关。基于该位点，结合KASP技术原理，本发明进一步开发了鉴定该位点的特异性引物组合，采用本发明的特异性引物组合可以检测待测小麦的籽粒硬度性状，并进行高硬度性状或低硬度性状的小麦品种的筛选和选育，从而可为小麦籽粒硬度性状鉴定和软质小麦新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。

Description

与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应用
技术领域
本发明涉及作物分子遗传育种技术领域，具体涉及与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应用。
背景技术
小麦是我国第二大粮食作物，也是酿造白酒的重要原料。目前酿酒专用小麦种质资源匮乏，影响优质品种的发展，同时酿酒小麦品质受品种和环境因素影响大，选育品种中具广谱抗病性的品种很稀少。因此要加强酿酒(弱筋)小麦种质资源的收集鉴定和筛选，筛选筋力弱、硬度低、抗逆性好的种质资源。
酿酒专用小麦分为制曲专用小麦、酿酒发酵专用小麦。小麦既是制曲原料(小麦占95％-100％)，也是酿酒发酵的主要原料之一。小麦籽粒硬度与酿酒的品质息息相关。在制曲过程中，因硬麦较脆，多被粉碎成颗粒，无法达到制曲原料的粉碎要求，制成的曲块紧，发酵过程中水分不易蒸发，曲心易霉变，硬麦的晶状淀粉不易被微生物利用，曲中微生物种类和数量少，影响大曲质量，而软麦易压成片状，制成的曲块松紧适宜，曲中微生物易繁衍，有利于大曲的发酵生香，保障大曲的质量。大曲是白酒的发酵生香剂，大曲的品质奠定了白酒品质的基础。在酿酒发酵过程中，硬麦中蛋白质含量高，在制曲过程中只能被分解一部分，在酿酒发酵过程中蛋白质则转变为杂醇油，影响酒质，而软麦中一般支链淀粉含量高，易于糊化，出酒率高，产量稳定。因此小麦原料品质的好坏在一定程度上决定酿酒的品质，以泸州老窖为例，泸州老窖大曲的制曲原料90％以上都是小麦，传统制曲要求是小麦“心烂皮不烂”，对小麦的软质率要求较高。
小麦的籽粒硬度为数量性状不仅受多对基因控制，还受包括土壤含水量、肥力等气候因素的影响。研究发现，小麦籽粒硬度主要是由位于5D短臂上的两个主效基因Pina(Puroindoline a)和Pinb(Puroindoline b)调控，Pina和Pinb紧密连锁，共同形成小麦籽粒硬度的分子遗传基础，Pina和Pinb基因突变或缺失均会引起小麦胚乳质地的硬度增加。通过小麦Pan Genome数据，分析Pin基因遗传变异情况，根据差异位点开发相应的分子标记，用于小麦硬度的精准设计，对优质软质酿酒专用小麦品种的选育均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应用，通过小麦PanGenome数据，分析Pin基因遗传变异情况，在Pinb基因找出了不同等位基因类型，根据差异位点进行了KASP标记开发，能够快速鉴定小麦籽粒的硬度，辅助软质酿酒专用小麦品种的选育工作，缩短育种年限。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
本发明的第一目的是，提供一种检测小麦籽粒硬度的物质，所述物质为用于检测小麦基因组中染色体5D上3609894bp处的分子标记pinB_3609894的脱氧核糖核苷酸是GG、AA或GA的成套引物或含有所述成套引物的检测试剂或试剂盒；
本发明的第一目的是，提供小麦基因组中染色体5D上3609794-3609994bp处分子标记的序列，序列如SEQ ID No.4所示；
序列中[G/A]为SNP位点的位置。
进一步的，所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物。上游引物根据所述小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的基因片段的第101位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为C，另一条上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为T，本引物利用的反向互补设计的原则；下游引物根据所述小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的基因片段的第101位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。
进一步的，所述成套引物pinB_3609894-F为由SEQ ID No.4序列的第101-119位所示的单链DNA分子或其衍生物、pinB_3609894-H为由SEQ ID No.4序列的第101-119位所示的单链DNA分子或其衍生物和pinB_3609894-G为由SEQ ID No.4序列所示的第101-119位单链DNA分子组成的成套引物。
进一步的，所述pinB_3609894-F的第101-119位所示的单链DNA分子的衍生物的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述pinB_3609894-H的第101-119位所示的单链DNA分子的衍生物的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。
进一步的，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
进一步的，所述上游引物的序列分别如pinB_3609894-F、pinB_3609894-H所示，所述下游引物的序列如pinB_3609894-G所示。
本发明的另一目的在于，提供了上述的物质/引物序列组在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
本发明另一目的在于，提供了如下任一方法：
方法A：
一种比较待测小麦籽粒硬度的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：
(A1)检测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是GG还是AA还是G和A；
(A2)按照如下确定所述待测小麦籽粒硬度：基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体则所述待测小麦籽粒硬度低于于基因组中染色体5D上，上述序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体或者是G和A的杂合体的所述待测小麦的籽粒硬度；
方法B：
一种选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(B1)检测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是GG还是AA还是G和A；
(B2)选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的小麦，最终获得籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
方法C：
一种选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(C1)检测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(C2)选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的小麦，最终获得籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。
进一步的，所述(A1)、(B1)、(C1)的具体操作为，采用本发明上述的检测试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是GG还是AA还是G和A：
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则所述待测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是C和T的杂合体。
进一步的，所述PCR扩增具体为，引物组组合中以摩尔比计，所述上游引物F：所述上游引物H：所述下游引物＝12：12：30；PCR反应程序为：94℃、15min；94℃、15s，65℃、1min，10个循环(每个循环减低1℃)；94℃、20s，57℃、1min，40个循环；12℃、15min。
10μL扩增体系可参考设计如下：
所述Primer Mix，每100μL中：
上游引物F(F1)，10uM、12μL；
上游引物H(F2)，10uM、12μL；
下游引物(R)，10uM、30μL；
DdH2O，46μL。
本发明的有益效果：
本发明相对于现有技术而言，筛选鉴定到一个影响小麦籽粒硬度的位点，经检测该位点与小麦籽粒硬度性状显著相关。初步研究结果表明，AA基因型具有低硬度表型优势。基于该位点，结合KASP技术原理，本发明进一步开发了鉴定该位点的特异性引物组合，采用本发明的特异性引物组合可以检测待测小麦的籽粒硬度性状，并进行高硬度性状或低硬度性状的小麦品种的筛选和选育，从而可为小麦籽粒硬度性状鉴定和软质小麦新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明实施例所述等位基因序列比较结果；
图2为本发明实施例所述pinB_3609794在小麦中的差异表达；
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。
实验材料：下述实施例中所涉及的相关小麦品种，均由西北农林科技大学提供，相关小麦均播种于四川省成都市温江区和陕西省咸阳市杨陵区，待完全成熟后进行收获，并用于后续分析。
实施例1
获得小麦籽粒硬度调控基因，结合现有技术，对两年年连续种植的不同小麦品种的硬度表型情况进行了测定，以期对小麦籽粒硬度表型差异进行初步确定。具体测定结果参见后续表1。小麦籽粒硬度测量方法可参考如下操作：将所收获成熟期小麦籽粒，自然晒干后，挑选饱满干净的300粒完整种子，倒入近红外谷物分析仪中(型号为FOSS DS2500)，运行仪器，选取小麦整粒模型，测量获得样品硬度数据。
实施例2
基于实施例1测定所得硬度表型数据，通过在3个生态环境下性状的比较，鉴定具有软质特性并兼顾高产、抗病的优异种质材料。
通过小麦Pan Genome数据，分析Pin基因遗传变异情况，鉴定出Pinb等位基因型两种，结合其差异位点进行分析，开发KASP标记。
Pinb成功鉴定到一个标记位点，在5D基因的3609794-3609994bp处的3609894bp处(参考Chinese Spring v1.0)存在一个G/A突变。
5D基因3609794-3609994bp处分子标记序列具体如下：GCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTCTTGCAAGGATTACGTGATGGAGCGATGTT TCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGGTGGAAG[G/A]GC GGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAGAAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAG CACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAG
基于上述序列差异KASP原理，进一步开发设计了PCR扩增获得所述小麦分子标记用引物组，具体设计如下：
pinB_3609894-F GAAGGTGACCAAGTTCATGCTctcatgctcacagccgcC pinB_3609894-HGAAGGTCGGAGTCAACGGATTctcatgctcacagccgcT
pinB_3609894-G cgtgatggagcgatgtttcac
实施例3
基于实施例2的引物对设计，对301份小麦材料的基因型进行了检测，同时通过对基因型与硬度表型间关联关系进行了鉴定，具体过程简介如下。
首先，采用CTAB法提取各小麦品种的DNA，并将DNA浓度稀释为100ng/μL；
然后，按照实施例2中所设计引物，以上所提取DNA为模板，对不同小麦样品进行PCR(采用BIO-RAD荧光定量PCR仪CFX96TM Optics Module)检测分析，最终确定5D染色体3609894bp处碱基序列。
具体PCR扩增时，10μL扩增体系可参考设计如下：
KASP Mix(2X)，5μL；
Primer Mix，2μL；
DNA，1.8μL；
ddH201.2μL，
所述Primer Mix，每100μL中：
F，10uM、12μL；
H，10uM、12μL；
G，10uM、30μL；
DdH2O，46μL；
PCR反应程序参考(可根据扩增结果适当调整)为：
1.
94℃、15min；94℃、15s，65℃、1min(10个循环，每个循环降低1℃)；94℃、20s，57℃、1min，40个循环；12℃、15min。
等位基因序列比较结果、KASP分型图和基因型及小麦硬度统计结果如下图1和图2、表1、表2所示。
表1不同小麦品种基因型与其籽粒硬度对应结果
表2分子标记的pinB硬度指数平均值T测验结果
其中，图1为等位基因序列比较结果；
图2为pinB_3609794在小麦中的差异表达(A：GG；B：AA)
基于上述统计结果，可以看出：TT基因型小麦的籽粒硬度平均为67.57；CC基因型小麦的籽粒硬度平均为58.60。TT基因型小麦的籽粒硬度显著高于CC基因型小麦，相差15.34％，在p<0.01水平上有显著差异。TT基因型小麦的籽粒硬度显著高于CC基因型小麦。同时，作为杂合型的CT基因型小麦的籽粒硬度平均为63.71。
基于上述结果可以看出，一方面利用所设计引物对，可通过对特定位点检测方式来对小麦籽粒硬度特性进行准确判定，进而可为分子育种技术应用奠定基础；另一方面，基于该位点，可为不同硬度小麦新品种培育奠定一定技术和理论基础，对于相关小麦加工性能改良具有较好的技术意义。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (10)

1.一种KASP标记引物组，包括两条上游引物pinB_3609894-F、pinB_3609894-H和一条下游引物pinB_3609894-G，其特征在于：
所述上游引物pinB_3609894-F、pinB_3609894-H的序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；所述下游引物pinB_3609894-G的序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种DNA片段，其特征在于：所述DNA片段位于小麦基因组中染色体5D上3609794-3609994bp处，其序列如SEQ ID No.4所示。
3.如权利要求1所述的KASP标记引物组，其特征在于：所述pinB_3609894-F为SEQ IDNo.4所示的第101-119位所示的单链DNA分子或其衍生物；pinB_3609894-H为SEQ ID No.4所示的第101-119位所示的单链DNA分子或其衍生物；pinB_3609894-G为SEQ ID No.4所示的第101-119位所示的单链DNA分子组成。
4.如权利要求3所述的KASP标记引物组，其特征在于：所述pinB_3609894-F的第101-119位所示的单链DNA分子的衍生物的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；
所述pinB_3609894-H的第101-119位所示的单链DNA分子的衍生物的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。
5.如权利要求4所述的KASP标记引物组，其特征在于：
所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
6.一种检测小麦籽粒硬度的试剂盒、检测试剂，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的KASP标记引物组。
7.一种检测小麦籽粒硬度的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记位于小麦基因组中染色体5D上，如序列表SEQ ID No.4所示的第101位；所述SNP的脱氧核糖核苷酸是GG、AA或GA。
8.一种如权利要求1所述KASP标记引物组的应用，其特征在于：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
9.如权利要求8所述的KASP标记引物组的应用方法，其特征在于：所述应用方法包括：
方法A：
一种比较待测小麦籽粒硬度的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：
(A1)检测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是GG还是AA还是G和A；
(A2)按照如下确定所述待测小麦籽粒硬度：基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体则所述待测小麦籽粒硬度低于于基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体或者是G和A的杂合体的所述待测小麦的籽粒硬度；
方法B：
一种选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(B1)检测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是GG还是AA还是G和A；
(B2)选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的小麦，最终获得籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
方法C：
一种选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：
(C1)检测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是CC还是TT还是C和T；
(C2)选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的小麦，最终获得籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。
10.如权利要求9所述的应用方法，其特征在于：所述(A1)、(B1)、(C1)的具体操作为，采用权利要求6所述的检测试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是GG还是AA还是G和A：
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则所述待测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；
若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体5D上，SEQ ID No.4序列所示的分子标记的第101位脱氧核糖核苷酸是C和T的杂合体。
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