CN116287397A - 一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法 - Google Patents
一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116287397A CN116287397A CN202310238560.XA CN202310238560A CN116287397A CN 116287397 A CN116287397 A CN 116287397A CN 202310238560 A CN202310238560 A CN 202310238560A CN 116287397 A CN116287397 A CN 116287397A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wheat
- hardness
- primer
- genotype
- grain hardness
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 146
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 140
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 16
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 abstract description 5
- 244000098345 Triticum durum Species 0.000 abstract description 3
- 235000007264 Triticum durum Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000007542 hardness measurement Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法，属于小麦籽粒硬度KASP标记技术领域。同时，本发明还公开了一组与该KASP标记相关的KASP引物组及其应用，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物3，其中引物3为共用引物；以该KASP引物组为引物，以待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，当小麦两条染色体对应位点碱基均为C时，小麦籽粒属于低硬度籽粒表型的CC基因型小麦品种，可用于培育软质小麦新品种；当小麦两条染色体对应位点碱基均为T时，小麦籽粒属于高硬度籽粒表型的TT基因型小麦品种，可用于培育硬质小麦新品种。
Description
技术领域
本发明涉及一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法，属于小麦籽粒硬度KASP标记技术领域。
背景技术
小麦籽粒硬度是小麦加工质量的最重要技术指标之一，也是国内外小麦市场分类和定价的重要指标之一，也是不同国家育种的重要指标。通常而言，硬质小麦的胚乳中的淀粉颗粒密集地包裹着蛋白质基质，使得胚乳颗粒很难在磨粉机加工小麦籽粒过程中被精细研磨，但同时使得胚乳很容易与麸皮和面粉分离，表现为：小麦麸皮大而矮、颜色好、灰分低，总体加工表现为：面粉提取率相对较低，但具有较大的颗粒、更规则的形状和良好的筛分效果。而软质小麦加工所得面粉则粒径相对较小、面粉整体蓬松，致密性低，柔滑性差，同时由于粒径较小，使得加工过程中筛网效率较差。
总之，由于小麦硬度指标与小麦面粉加工(小麦制粉)过程中面粉出粉率、加工效率、面粉质量、加工动力消耗等具有直接关系，因此，小麦籽粒硬度对于小麦产业化加工具有十分重要的技术意义。
通过对我国不同小麦品种籽粒硬度的初步统计，结果表明，我国现有小麦品种硬度指标普遍偏高。而随着近年来小麦基因组测序工作完成，如何结合相关基因测序工作，挖掘小麦籽粒硬度控制基因，对于改良小麦品种硬度指标、以及培育新的软质小麦新品种具有十分重要的技术理论意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明结合现有技术中常用的小麦籽粒硬度测量方法(单籽粒谷物特性测定仪法，single kernel characterization system,SKCS)，通过对我国不同小麦品种的小麦籽粒硬度测定和统计，结合小麦全基因组关联分析(GWAS)鉴定结果，筛选鉴定到一个影响小麦籽粒硬度的显著位点8108，并结合KASP技术原理，进一步开发了鉴定该位点的特异性引物组合在小麦籽粒硬度性状筛选中的应用。
本发明第一方面提供了一种检测小麦籽粒硬度关联基因的成套KASP引物，所述成套KASP引物包含引物A、引物B和引物C；所述引物A为SEQ ID No.1的第22-45位所示的单链DNA或其衍生物；所述引物B为SEQ ID No.2的第22-45位所示的单链DNA或其衍生物；所述引物C为SEQ ID No.3的单链DNA。
在一种实施方式中，所述SEQ ID No.1的第22-45位所示的单链DNA的衍生物为SEQIDNo.1的第22-45位所示的单链DNA的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.2的第22-45位所示的单链DNA的衍生物为SEQ ID No.2的第22-45位所示的单链DNA的5'端连接特异荧光标签序列B。
在一种实施方式中，所述特异荧光标签序列A和特异荧光标签序列B为不同的荧光报告基因，分别选自FAM、TET、VIC、JOE、HEX。
在一种实施方式中，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
在一种实施方式中，所述荧光标签序列FAM的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位，所述荧光标签序列HEX的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测小麦籽粒硬度关联基因的试剂盒，所述试剂盒含有所述成套KASP引物。
在一种实施方式中，所述试剂盒还含有MgCl2。
本发明的第三个目的是提供一种检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述成套KASP引物或所述试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，根据分析结果确定所述待测小麦的籽粒硬度关联基因的基因型：
若扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中籽粒硬度关联基因的基因型是CC；
若扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则所述待测小麦基因组中籽粒硬度关联基因的基因型是TT；
若扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中籽粒硬度关联基因的基因型是CT。
在一种实施方式中，所述小麦籽粒硬度关联基因为小麦基因组中染色体7B上SNP位点8108。
在一种实施方式中，所述小麦籽粒硬度关联基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述PCR扩增具体为，
引物组组合中以摩尔比计，上游引物1：上游引物2：下游引物＝12：12：30；PCR反应程序为：95℃变性15min；95℃变性20s，65℃退火1min，10个循环；95℃变性20s，57℃延伸1min，连续30个循环；37℃延伸1min。
5μL扩增体系可参考设计如下：
所述Primer Mix，每100μL中：
上游引物1(F1)，10μM、12μL；
上游引物2(F2)，10μM、12μL；
下游引物(R)，10μM、30μL；
ddH2O，46μL。
本发明的第四个目的是提供一种检测小麦籽粒硬度的方法，包括如下步骤：
(1)检测小麦基因组中染色体7B上SNP位点8108的基因型；
(2)染色体7B上SNP位点8108的基因型是TT的待测小麦籽粒硬度高于染色体7B上SNP位点8108的基因型是CC或CT的待测小麦。
本发明的第五个目的是提供一种选育或筛选小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下(A)或(B)：
(A)培育小麦籽粒硬度高的小麦品种的方法；选择染色体7B上SNP位点8108的基因型是TT的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体7B上SNP位点8108的基因型是TT的小麦，最终获得籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(B)培育小麦籽粒硬度低的小麦品种的方法；选择染色体7B上SNP位点8108的基因型是CC的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体7B上SNP位点8108的基因型是CC的小麦，最终获得籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种。
本发明另一方面提供了所述染色体7B上SNP位点8108，或所述引物，或所述试剂盒在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
有益效果：
本发明相对于现有技术而言，筛选鉴定到一个影响小麦籽粒硬度的显著位点8108，该位点与小麦籽粒硬度性状显著相关。初步研究结果表明，CC基因型具有低硬度表型优势。基于该位点，结合KASP技术原理，本发明进一步开发了鉴定该位点的特异性引物组合。由于KASP技术具有检测通量高、时间短、准确性高、易于实现自动化、成本低、环境友好等特点，因此，本申请可为小麦籽粒硬度性状鉴定和软质小麦新品种培育奠定一定理论基础和技术基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为小麦KASP标记在不同年份、省份和国家新育成小麦品种的检测结果图；彩色视图下，黑色的为无模板对照，蓝色为纯合基因型CC，黄色的为纯合基因型TT，绿色的为杂合基因型CT；
图2为小麦KASP标记在不同年份、省份和国家新育成小麦品种的硬度指数箱线图；图中：“**”表示在p<0.01下显著。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
小麦材料：下述实施例中所涉及的相关小麦品种(系)，均由河南省农业科学院小麦研究所提供，相关小麦均播种于河南新乡(原阳，河南省农业科学院实验基地)，待生理成熟后进行收获(期间收获不同生长阶段不同组织样品，实验室冷冻保存备用)，并用于后续分析。
需要说明的是，作为专业性农业研究机构，申请人长期保存有相关种质材料，而且相关小麦品种均是可以市场或者现有种质库中公开获得的。
实施例1
为获得小麦籽粒硬度调控基因，结合现有技术，首先基于小麦籽粒硬度测量方法(单籽粒谷物特性测定仪法，single kernel characterization system,SKCS)，对三年连续种植的不同小麦品种的硬度表型情况进行了测定，以期对小麦籽粒硬度表型差异进行初步确定。具体测定结果参见后续表1。
具体小麦籽粒硬度测量方法可参考如下操作：
将所收获成熟期小麦籽粒，自然晒干后，挑选无半粒或虫眼等问题的300粒完整种子，倒入单籽粒谷物硬度测试仪SKCS中(型号为Perten SKCS 4100)，运行仪器，测量获得样品硬度数据。
实施例2
基于实施例1测定所得的小麦籽粒硬度表型数据，本发明利用
Wheat660K SN P芯片对201份关联群体材料进行基因分型，对分型结果进行人工质量控制，剔除数据缺失率>50％，杂合率大于20％和最小等位基因频率<0.1的SNP标记，获得22万个高质量SNP标记。根据分型结果，关联该群体在三年(2019、2020、2021)同一环境下的硬度数据(具体方法见实施例1)，利用TASSEL 5.0处理数据及矩阵合并，采用混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析。分析结果显示，三年的分析数据共同鉴定到的位于7B染色体上的SNP位点8108为影响小麦籽粒硬度的稳定遗传位点，对表型贡献率为8.44-10.57％。
进一步分析后，鉴定所得影响小麦籽粒硬度显著位点存在一个C/T突变；具体碱基序列如下：
GCTGAGCGGTGGGTCTGTGTTCAGGCATACCATCATGTTGCGCGCCAGTCTGTGTTCAGGCCCGCGCTCGATCTGGGCTCCCATCGAAACAAACTGGAACGGCCTAARGGGGAAGTTGGCCATGGTAGTGGAGGGCTTGATGATGCAGTTCGTCACAGTCGAGGAGGGATGGTAAAGCAGGGGAATGACTCTGTGCTCGTTGGTCGACTGGGGTGGGCGGAAAAGGGAACTGGTGCGGGGTGTGGAGCGGAATTGTTAGGCCAATTGTGTTTGCGGGAGGGGGCCCATCTGCAGTCACAATCCTTTTGGGGCGCCATATCT(SEQ ID No.4)，其中，第108位R代表[C/T]。
基于KASP原理，设计针对所述小麦KASP标记的PCR扩增用引物组，具体如下：
上游引物F1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAAACAAACTGGAACGGCCTAAT-3’(SEQ IDNo.1)，(5’端“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”部分序列为FAM标记序列)
上游引物F2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAAACAAACTGGAACGGCCTAAC-3’(SEQ IDNo.2)，(5’端“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”部分序列为HEX标记序列)
下游引物R：5’-AGAGTCATTCCCCTGCTTTACCA-3’(SEQ ID No.3)。
以F1和R为引物对组合时，用于扩增小麦KASP标记中突变位点碱基为C的序列；
以F2和R为引物对组合时，用于扩增小麦KASP标记中突变位点碱基为T的序列。
所述小麦KASP标记在小麦籽粒硬度性状鉴定或小麦育种中应用，通过基因型区分，用于判定小麦籽粒硬度类型或者用于小麦育种应用；具体而言：
当小麦两条染色体对应位点碱基均为C时，小麦籽粒属于低硬度籽粒表型的CC基因型小麦品种，可用于培育软质小麦新品种；
当小麦两条染色体对应位点碱基均为T时，小麦籽粒属于高硬度籽粒表型的TT基因型小麦品种，可用于培育硬质小麦新品种。
实施例3
基于实施例2的引物对设计，发明人对所种植的201份小麦材料的基因型进行了检测，同时对基因型与硬度表型间关联关系进行了鉴定，具体过程简介如下。
首先，分别提取各小麦品种的基因组DNA(采用CTAB法提取，提取完成后进行电泳检测确保所提取DNA的完整性，并对其浓度检测确保满足扩增要求)；
然后，按照实施例2中所设计引物，以提取的基因组DNA为模板，对不同小麦样品进行PCR(采用BIO-RAD荧光定量PCR仪CFX ConnectTM Real-Time System)检测分析，最终确定相应位点碱基序列。
具体PCR扩增时，5μL扩增体系可参考设计如下：
KASP Mix(2X)，2.5μL；
Primer Mix，0.7μL；
DNA，30ng(1.0μL)；
ddH2O，补充至5μL；
所述Primer Mix，每100μL中：
上游引物F1，10μM、12μL；
上游引物F2，10μM、12μL；
下游引物R，10μM、30μL；
ddH2O，46μL；
PCR反应程序参考(可根据扩增结果适当调整)为：
95℃变性15min；95℃、20s，65℃退火1min(10个循环，每个循环降低1℃)；95℃变性20s，57℃延伸1min，30个循环；37℃延伸1min。
扩增程序结束，按照PCR仪读取的荧光信号值得高低，将小麦品种分为三类(如图1所示)：蓝色为纯合基因型CC，黄色的为纯和基因型TT，绿色的为杂合基因型CT。
结合硬度测定结果，纯合基因型CC对应小麦籽粒硬度平均值(43.8)显著低于纯和基因型TT对应小麦籽粒硬度平均值(54.7)。
具体基因型和小麦硬度统计结果如下表1和图2所示。
表1 201份不同育成小麦品种的硬度指数和KASP基因分型结果
对上表结果进行进一步统计分析，结果如下表2所示。
表2KASP标记不同基因型的小麦品种的硬度指数平均值T测验结果
注：表中“t值”、“P值”、“F值”均为统计学词语，具体含义可参见《试验统计方法》(盖钧镒著，2000，中国农业出版社)
基于上述统计结果，可以看出：
基因型为CC的品种比基因型为TT的品种硬度指数低，且相关差异具有显著性，这也充分说明基因分析的正确性；或者说，正是这种基因型差异导致了硬度表型差异；
基因型为CC的品种比基因型为TT的品种三年硬度指数平均值低20.48％，说明含有等位基因TT的小麦籽粒硬度高于含有等位基因CC的小麦；
另一方面，基于KASP原理所设计引物能够准确区分相关基因型差异，从而可为小麦籽粒硬度鉴定、以及可为KASP标记辅助育种奠定良好的技术基础和理论基础。
总体上，基于上述结果，可以看出，一方面利用所设计引物对，可通过对特定位点检测方式来对小麦籽粒硬度特性进行准确判定，进而可为小麦育种技术应用奠定基础；另一方面，基于该位点，可为不同硬度小麦新品种培育奠定一定技术和理论基础，对于相关小麦加工性能改良具有较好的技术意义。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种检测小麦籽粒硬度关联基因的成套KASP引物，其特征在于，所述成套KASP引物包含引物A、引物B和引物C；所述引物A为SEQ ID No.1的第22-45位所示的单链DNA或其衍生物；所述引物B为SEQ ID No.2的第22-45位所示的单链DNA或其衍生物；所述引物C为SEQ IDNo.3的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的成套KASP引物，其特征在于，所述SEQ ID No.1的第22-45位所示的单链DNA的衍生物为SEQ ID No.1的第22-45位所示的单链DNA的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.2的第22-45位所示的单链DNA的衍生物为SEQ ID No.2的第22-45位所示的单链DNA的5'端连接特异荧光标签序列B。
3.根据权利要求2所述的成套KASP引物，其特征在于，所述特异荧光标签序列A和特异荧光标签序列B为不同的荧光报告基因，分别选自FAM、TET、VIC、JOE或HEX。
4.根据权利要求2或3所述的成套KASP引物，其特征在于，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
5.根据权利要求4所述的成套KASP引物，其特征在于，所述荧光标签序列FAM的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位，所述荧光标签序列HEX的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位。
6.一种用于检测小麦籽粒硬度关联基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1～3任一所述的成套KASP引物。
7.一种检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1～3任一所述成套KASP引物或权利要求6所述试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，根据分析结果确定所述待测小麦的籽粒硬度关联基因的基因型：
若扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中籽粒硬度关联基因的基因型是CC；
若扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则所述待测小麦基因组中籽粒硬度关联基因的基因型是TT；
若扩增产物的荧光信号数据显示为绿色，则所述待测小麦基因组中籽粒硬度关联基因的基因型是CT。
8.一种检测小麦籽粒硬度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用权利要求7所述的方法检测小麦基因组中染色体7B上SNP位点8108的基因型；
(2)染色体7B上SNP位点8108的基因型是TT的待测小麦籽粒硬度高于染色体7B上SNP位点8108的基因型是CC或CT的待测小麦。
9.一种选育或筛选小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下(A)或(B)：
(A)培育小麦籽粒硬度高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7所述方法检测得到的染色体7B上SNP位点8108的基因型是TT的小麦作为亲本进行选育的步骤；
(B)培育小麦籽粒硬度低的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7所述方法检测得到的染色体7B上SNP位点8108的基因型是CC的待测小麦作为亲本进行选育。
10.染色体7B上SNP位点8108，或权利要求1～3任一所述引物，或权利要求6所述试剂盒在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022109696535 | 2022-08-12 | ||
| CN202210969653 | 2022-08-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116287397A true CN116287397A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86814524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310238560.XA Pending CN116287397A (zh) | 2022-08-12 | 2023-03-13 | 一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116287397A (zh) |
-
2023
- 2023-03-13 CN CN202310238560.XA patent/CN116287397A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107012252B (zh) | 一组用于改良稻米品质的分子标记及水稻改良方法和应用 | |
| CN110295251B (zh) | 与小麦有效分蘖数qtl连锁的snp分子标记及其应用 | |
| CN110157833B (zh) | 检测高赖氨酸玉米的方法及其专用分子标记 | |
| CN115927703A (zh) | 检测水稻粒型基因gs3和gw5特异分子标记的引物组及其应用 | |
| CN114134247B (zh) | 与谷子株高性状紧密连锁的分子标记及其引物序列和应用 | |
| CN112029898B (zh) | 一种用于鉴定青花菜品种‘浙青100’的snp标记 | |
| CN117737279A (zh) | 镉低积累杂交稻分子标记、水稻突变型OsNramp5基因及其鉴定方法、应用和引物 | |
| CN114480698B (zh) | 小麦结实小穗数和/或籽粒硬度性状相关分子标记及应用 | |
| CN108531642B (zh) | 一组用于鉴别玉米品种的ssr分子标记及其应用 | |
| CN113197089B (zh) | 一种便于早代选择软质弱筋小麦的育种方法 | |
| CN113736903B (zh) | 一种与油菜硒高效性状主效QTL位点qSe.C03紧密连锁的分子标记及应用 | |
| CN116287397A (zh) | 一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法 | |
| CN115852021A (zh) | 鉴定小麦粒重和粒长的snp分子标记及其应用 | |
| CN115896324A (zh) | 一种耐盐小麦分子设计育种方法 | |
| CN115927718A (zh) | 用于鉴定小麦粒重和粒宽的kasp分子标记及应用 | |
| CN111849999B (zh) | 水稻gs3突变基因、其分子标记及用途 | |
| CN114854902B (zh) | 小麦分子标记5668及其在籽粒硬度改良中的应用 | |
| CN116555467A (zh) | 与小麦籽粒硬度相关的kasp标记及其应用 | |
| CN116751881A (zh) | 一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法 | |
| CN116377102A (zh) | 小麦分子标记ax-95660756及其在面筋聚集特性改良中的应用 | |
| CN113444829B (zh) | 一种小麦脱水速率相关的分子标记及其应用 | |
| CN116004889A (zh) | 一种水稻育性基因的kasp分子标记及其应用 | |
| CN116837133A (zh) | 控制稻米低蛋白质含量的qtl位点及分子标记方法 | |
| CN116411120A (zh) | 与燕麦裸粒性状基因n1共分离的kasp分子标记及其应用 | |
| CN117757973A (zh) | 一种与番茄抗旱性相关的分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |