CN116751881A - 一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法，属于作物分子育种技术领域。为了开发一种检测小麦Pina‑D1n基因型的KASP分子标记引物组，本发明根据Pina基因编码区内的单碱基差异设计KASP标记Pina‑KN的引物组，该引物组包括正向特异性引物pina‑kasp‑F1、正向特异性引物pina‑kasp‑F2和反向通用引物pina‑kasp‑R1。以小麦基因组DNA为模板利用引物组进行PCR扩增，并对目的基因进行基因分型分析可实现小麦籽粒硬度的鉴定，该方法具有简便、精准、快速和特异性强的优点，适用于小麦Pina‑D1n基因型的鉴定分型和小麦品质性状的分子辅助选择育种。
Description
技术领域
本发明属于作物分子育种技术领域，具体涉及一种与小麦籽粒硬度相关的遗传信息识别方法。
背景技术
小麦作为世界第一大口粮作物，提供了世界上大约四分之一的蛋白质、膳食纤维和碳水化合物需求，是人类重要的营养物质。小麦越来越多地用于酿造、生物乙醇和生物可降解塑料的生产，其营养部分可用于牧场，籽粒磨粉后被制成面条、饼干、面包等食物。小麦碾磨、烘焙和制面过程中最重要的表型特征之一是籽粒硬度。籽粒硬度对小麦磨粉品质、加工品质和食用品质均产生影响，是决定小麦市场分级、碾磨性能和最终用途的重要指标和依据。随着当今社会经济的不断发展、生活水平的逐步提高以及人口数量的持续增加，对小麦品质提出了更高的要求。
根据籽粒结构不同，六倍体小麦分为软、硬两类。在硬麦胚乳中淀粉颗粒与基质蛋白紧密结合，在软麦胚乳中淀粉颗粒与基质蛋白相互作用强度较弱。不同硬度的小麦具有不同的使用价值，硬麦磨粉后含有更多受损的淀粉颗粒，吸水能力较强，适合制作面包和优质面条等食品；软麦适合制作饼干和糕点等食品。调控小麦籽粒硬度的主效基因是位于5D染色体短臂上的Pina基因和Pinb基因，到目前为止，已经鉴定出26个Pina的等位基因和33个Pinb的等位基因。当小麦基因型为Pina-D1a和Pinb-D1a时，籽粒为软质，当Pina和/或Pinb任意一个基因发生缺失或变异时，小麦的籽粒硬度就会发生变化，籽粒为中等硬度或硬质。含有Pina-D1n基因型的小麦材料中Pina基因编码区第212位碱基处有一个G/A的SNP突变，此位点的突变使得第71位色氨酸突变为终止密码子，导致翻译提前终止，最后使小麦籽粒硬度由软质变为硬质。为此，提供一种快速、精准地鉴定小麦Pina-D1n基因型的方法，对加快该基因在小麦品质改良中的应用有重要意义。
在小麦品质改良研究方面，针对不同Pina等位基因已经开发出了许多分子标记，例如针对Pina-D1b等位基因(小麦籽粒硬度主效基因Pina缺失类型)在分子水平上开发了特异引物检测PCR扩增产物的标记。竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specificPCR，KASP)是一种基于SNP荧光检测进行基因分型的技术，与上述分子标记相比操作简便，高通量，精准度高。目前在小麦中针对Pina-D1n等位基因的KASP标记还未报道，鉴于此，采用KASP技术对小麦Pina-D1n等位基因进行检测，并应用于小麦分子标记辅助育种，对优质小麦新品种的选育和改良具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测小麦Pina-D1n基因型的KASP分子标记引物组，该引物组具有操作简便，高通量，精准度高和特异性强的优点，利用该分子标记引物组可检测小麦Pina-D1n等位基因，也可将该分子标记的引物组应用于优质小麦新品种的选育和改良中。
为了实现上述目的，本发明提出如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种检测小麦籽粒硬度关联基因KASP标记的引物组，所述引物组包括正向特异性引物pina-kasp-F1，正向特异性引物pina-kasp-F2和反向通用引物pina-kasp-R1；所述正向特异性引物pina-kasp-F1为如SEQ ID NO.1所示的单链DNA或其衍生物，所述正向特异性引物pina-kasp-F2为如SEQ ID NO.2所示的单链DNA或其衍生物，所述反向通用引物pina-kasp-R1为如SEQ ID NO.3所示的单链DNA。
在本发明的一种实施方式中，所述如SEQ ID NO.1所示的单链DNA的衍生物为SEQID NO.1的5'端连接特异荧光标签序列A；所述如SEQ ID NO.2所示的单链DNA的衍生物为SEQ ID NO.2的5'端连接特异荧光标签序列B。
在本发明的一种实施方式中，所述特异荧光标签序列A和特异荧光标签序列B为不同的荧光报告基因，分别选自FAM、TET、VIC、JOE或HEX。
在本发明的一种实施方式中，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
在本发明的一种实施方式中，所述荧光标签序列FAM的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述荧光标签序列HEX的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测小麦籽粒硬度关联基因的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物组。
本发明的第三个目的是提供一种检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型的方法，所述方法包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述引物组或上述试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，以不同的荧光信号值显示不同散点区域进行分析，根据分析结果确定所述待测小麦的籽粒硬度关联基因的基因型：
若扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则待测小麦染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为A，待测小麦为Pina-D1n基因型；
若扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则待测小麦染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为G，待测小麦为非Pina-D1n基因型。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增反应体系按体积份数计包括2×KASPMaster mix2.5份、KASP Primer mix0.7份、MgCl2 0.04份、模板DNA 1份、ddH2O 0.76份组成，其中模板DNA的浓度为30ng/μL。
在本发明的一种实施方式中，所述KASP Primer mix由正向特异性引物pina-kasp-F1，正向特异性引物pina-kasp-F2和反向通用引物pina-kasp-R1组成，正向特异性引物pina-kasp-F1，正向特异性引物pina-kasp-F2和反向通用引物pina-kasp-R1的浓度均为10μM，三种引物的体积比为1:1:2.5。
在本发明的一种实施方式中，所述PCR扩增的反应程序为：第一步：预变性95℃15min；第二步：变性95℃20s，退火65℃1min，之后每个循环退火温度降低1℃，连续循环10个；第三步：变性95℃20s，延伸57℃1min，连续循环31个；第四步：延伸37℃1min。
在本发明的一种实施方式中，采用BIO-RAD公司的荧光定量PCR仪进行荧光信号扫描。
本发明的第四个目的是提供一种检测小麦籽粒硬度的方法，所述方法为采用上述检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型的方法检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型，Pina-D1n基因型小麦籽粒的硬度高于非Pina-D1n基因型小麦。
本发明的第五个目的是提供一种选育或筛选小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下(A)或(B)：
(A)培育小麦籽粒硬度高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7所述方法检测得到的染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为A的小麦作为亲本进行选育的步骤；
(B)培育小麦籽粒硬度低的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7所述方法检测得到的染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为G的小麦作为亲本进行选育的步骤。
本发明的第六个目的是提供上述引物组或上述试剂盒在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒硬度性状；
(B)比较待测小麦籽粒硬度的高低；
(C)选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种；
(D)选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种；
(E)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；
(F)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品；
(G)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
有益效果
本发明的KASP分子标记是根据Pina基因编码区内第212位碱基差异设计的，并命名为Pina-KN。利用根据该KASP分子标记设计的引物组能够对小麦Pina-D1n等位基因进行高通量的检测，检测方法具有操作简便，精准度高快速和特异性强的优点，适用于Pina-D1n等位基因的鉴定和小麦品质性状的辅助选择育种，对优质小麦新品种的选育和改良具有重大意义。
附图说明
图1为KASP分子标记Pina-KN在不同小麦品种中检测Pina-D1n等位基因结果图；其中，黑色的为无模板对照，蓝色为纯合基因型AA，黄色的为纯合基因型GG。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明描述的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
小麦材料：下述实施例中所涉及的相关小麦品种(系)，均由河南省农业科学院小麦研究所提供，相关小麦均播种于河南新乡(原阳，河南省农业科学院实验基地)，待生理成熟后进行收获(期间收获不同生长阶段不同组织样品，实验室冷冻保存备用)，并用于后续分析。
需要说明的是，作为专业性农业研究机构，申请人长期保存有相关种质材料，而且相关小麦品种均是可以市场或者现有种质库中公开获得的。
实施例1：小麦籽粒硬度关联基因KASP分子标记Pina-KN的获得
Pina-D1n是在籼麦材料中检测到的Pina基因变异类型，为获得小麦籽粒硬度调控基因，结合现有技术，首先基于小麦籽粒硬度测量方法(单籽粒谷物特性测定仪法，singlekernel c haracterization system,SKCS)，对三年连续种植的不同小麦品种的硬度表型情况进行了测定，以期对小麦籽粒硬度表型差异进行初步确定。具体测定结果参见表1。
具体小麦籽粒硬度测量方法可参考如下操作：
将所收获成熟期小麦籽粒，自然晒干后，挑选无半粒或虫眼等问题的300粒完整种子，倒入单籽粒谷物硬度测试仪SKCS中(型号为Perten SKCS 4100)，运行仪器，测量获得样品硬度数据。
我们前期对82份小麦品种进行了Pina基因等位变异分析，鉴定出1份Pina-D1n基因型的小麦品种(秃头麦)。
实施例2：一种检测小麦籽粒硬度关联基因的KASP分子标记的引物组
基于KASP原理，设计针对实施例1获得的KASP分子标记Pina-KN的引物组，包括三条引物，分别为正向特异性引物pina-kasp-F1，正向特异性引物pina-kasp-F2和反向通用引物pina-kasp-R1。
正向特异性引物pina-kasp-F1是在核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的单链DNA的5'端连接特异荧光标签FAM获得的序列；正向特异性引物pina-kasp-F2是在核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的单链DNA的5'端连接特异荧光标签HEX获得的序列；反向通用引物pina-kasp-R1为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的单链DNA。特异荧光标签FAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，特异荧光标签HEX的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.1：5'-GGTCACCTGGCGTTGGTGGAAATG-3'；
SEQ ID NO.2：5'-GGTCACCTGGCGTTGGTGGAAATA-3'；
SEQ ID NO.3：5'-ATTTGGCCGAGCCGACTGCAACACT-3'；
SEQ ID NO.4：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；
SEQ ID NO.5：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。
利用本实施例获得的KASP分子标记Pina-KN的引物组针对秃头麦开展Pina-D1n等位基因的检测与验证。
材料：选取非Pina-D1n基因型和Pina-D1n基因型的小麦品种共82份。其中Pina-D1n基因型小麦品种仅1份，因此我们做了5个重复来避免实验过程中的误差，达到更高的准确率。共计87份小麦样品。
具体步骤为：使用CTAB法提取87份小麦叶片DNA，进行样品的DNA完整性电泳和DNA浓度检测，将所有样品浓度稀释至30ng/μL。接下来利用Pina-KN引物组以小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系按体积份数计包括2×KASP Master mix2.5份、KASP Primer mix0.7份、MgCl2 0.04份、模板DNA 1份、ddH2O 0.76份组成，其中模板DNA的浓度为30ng/μL。PCR扩增的反应体系中KASP Primer mix由Pina-KN引物组组成，其中pina-kasp-F1、pina-kasp-F2和pina-kasp-R1的体积比为1:1:2.5，三种引物的浓度均为10μM，MgCl2的浓度为50mM。扩增的反应程序为：第一步：预变性95℃15min；第二步：变性95℃20s，退火65℃1min，之后每个循环退火温度降低1℃，连续循环10个；第三步：变性95℃20s，延伸57℃1min，连续循环31个；第四步：延伸37℃1min。扩增完成后进行荧光信号扫描，并将扫描到的荧光信号进行分析后得到图1。具体是用BioRad CFX Manager软件可以直接进行PCR扩增并对PCR产物进行扫描，最终以不同的荧光信号值显示在不同散点区域，进而划分不同等位基因型。
对82份小麦品种进行Pina基因的PCR扩增并测序，所得测序结果与上述检测方法分析得到的结果相同(见表1)。由表1可得，基因型为Pina-D1n的小麦品种平均硬度指数为73.74；基因型为非Pina-D1n的小麦品种平均硬度指数为43.58。含Pina-D1n基因型的小麦品种在Pina-KN测试位点检测到碱基A，含非Pina-D1n基因型的小麦品种在测试位点检测出碱基G，表明该KASP分子标记能够对小麦Pina-D1n基因型进行精准的检测，而且该检测方法具有操作简便，精准度高快速和特异性强的优点，适用于小麦Pina-D1n基因型的鉴定分型和小麦品质性状的辅助选择育种，对优质小麦新品种的选育和改良具有重大意义。
表1 82份小麦品种的硬度指数和KASP分子标记Pina-KN的分型结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种检测小麦籽粒硬度关联基因KASP标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括正向特异性引物pina-kasp-F1，正向特异性引物pina-kasp-F2和反向通用引物pina-kasp-R1；所述正向特异性引物pina-kasp-F1为如SEQ ID NO.1所示的单链DNA或其衍生物，所述正向特异性引物pina-kasp-F2为如SEQ ID NO.2所示的单链DNA或其衍生物，所述反向通用引物pina-kasp-R1为如SEQ ID NO.3所示的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述如SEQ ID NO.1所示的单链DNA的衍生物为SEQ ID NO.1的5'端连接特异荧光标签序列A；所述如SEQ ID NO.2所示的单链DNA的衍生物为SEQ ID NO.2的5'端连接特异荧光标签序列B。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述特异荧光标签序列A和特异荧光标签序列B为不同的荧光报告基因，分别选自FAM、TET、VIC、JOE或HEX。
4.根据权利要求2或3所述的引物组，其特征在于，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述荧光标签序列FAM的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述荧光标签序列HEX的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
6.一种用于检测小麦籽粒硬度关联基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一所述的引物组。
7.一种检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1-3任一所述引物组或权利要求6所述试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，以不同的荧光信号值显示不同散点区域进行分析，根据分析结果确定所述待测小麦的籽粒硬度关联基因的基因型：
若扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则待测小麦染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为A，待测小麦为Pina-D1n基因型；
若扩增产物的荧光信号数据显示为黄色，则待测小麦染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为G，待测小麦为非Pina-D1n基因型。
8.一种检测小麦籽粒硬度的方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求7所述的方法检测小麦籽粒硬度关联基因的基因型，Pina-D1n基因型小麦籽粒的硬度高于非Pina-D1n基因型小麦。
9.一种选育或筛选小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下(A)或(B)：
(A)培育小麦籽粒硬度高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7所述方法检测得到的染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为A的小麦作为亲本进行选育的步骤；
(B)培育小麦籽粒硬度低的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求7所述方法检测得到的染色体5D上Pina基因编码区第212位碱基为G的小麦作为亲本进行选育的步骤。
10.权利要求1-3任一所述引物组或权利要求6所述试剂盒在如下任一中的应用：
(A)鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低；
(B)选育或筛选籽粒硬度相对较高/低的小麦单株或株系或品系或品种；
(C)制备用于鉴定或辅助鉴定或比较待测小麦籽粒硬度高低的产品；
(D)制备用于选育或筛选籽粒硬度相对较高/低的小麦单株或株系或品系或品种的产品。
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