CN117802263A - 与豇豆豆荚可溶性糖含量qtl pss-11.1相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与豇豆豆荚可溶性糖含量相关的β‑半乳糖苷酶基因VuPSS3上的SNP位点、KASP分子标记及其引物序列，该SNP位点位于11号染色体上41950713bp的位置，进一步基于该SNP位点开发KASP类型标记，可利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本是否携带控制豆荚高可溶性糖含量的等位变异。利用本发明提供的分子标记及其引物可以实现对豇豆可溶性糖含量高低的辅助筛选，在短时间内进行高通量检测，相比较于传统的基于表型选择，本发明所带来的选择结果更准确，重复性好，极大地提高了品种选育效率，简化育种程序，缩短育种年限。
Description
技术领域
本发明属于生物分子技术领域，涉及豇豆豆荚可溶性糖含量QTL PSS-11.1相关的分子标记及其KASP引物、选育方法。
背景技术
豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)(2n＝2x＝22)隶属豆科(Fabaceae)菜豆族(Trib.Phasoleae DC.)豇豆属(Vigna Savi)，是热带和亚热带地区重要的豆类作物之一。豇豆为自花授粉二倍体，基因组大小约620Mb。栽培豇豆包括普通豇豆和长豇豆两个亚种，前者以干籽粒做粮食食用，后者以嫩荚做蔬菜使用。豇豆是亚洲十大蔬菜作物之一，主要种植在中国、日本、菲律宾、泰国等地区。我国豇豆年种植面积超过800万亩，栽培面积和产量约占世界的五分之一。
随着产业结构调整和居民生活水平的提高，消费者对蔬菜营养品质的关注越来越高。近年来，豇豆生产上普遍存在“好吃不好看，好看不好吃”的现象，即外观商品性与内在营养品质无法协调。豇豆营养品质是一个复杂的数量性状，研究表明可溶性糖、粗蛋白、纤维素、维生素含量等均影响豇豆的口感和营养品质。品质性状受环境影响较大，且受个人品尝的主观能动性影响，因此，依靠表型鉴定严重限制了豇豆品质育种的进展。解析豇豆品质性状的遗传基础，开发育种可用的分子标记，通过分子育种辅助传统育种是促进品质育种的最佳策略。
随着豇豆高质量基因组的释放和测序技术的快速发展，通过重测序技术可以快速获得不同种质高质量的SNP基因型数据，结合其品质数据进行全基因组范围内的关联分析，可以快速挖掘控制品质性状的遗传变异，为豇豆品质育种提供目标QTL/基因。单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)由于其数量多、多态性丰富逐步成为豇豆遗传研究的主流标记，近年来，结合竞争性等位变异特异性PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)技术，可以针对海量的SNP标记进行灵活、个性化的筛选和应用，成为作物分子育种研究中有力的遗传工具。目前，KASP标记在水稻、玉米、菜豆等作物上已经广泛用于遗传多样性分析、基因定位和分子标记辅助选择。
目前豇豆性状的QTL定位研究仍属起步阶段，尤其是对品质性状豇豆豆荚中可溶性糖含量的QTL定位及分子标记的研究未见有报道。因此，开展豇豆豆荚中可溶性糖含量主效基因的QTL定位，筛选紧密连锁的分子标记比较重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供与豇豆豆荚可溶性糖含量QTL PSS-11.1紧密连锁的分子标记，目的之二在于提供检测该SNP位点基因型的引物对，目的之三在于提供利用该引物对进行对豆荚可溶性糖含量辅助育种的方法。该方法首先利用全基因组关联分析的方法，获得与可溶性糖含量基因紧密连锁的SNP，再将SNP转化为KASP标记进行验证，并利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本可溶性糖含量的有利等位变异，从而为豇豆豆荚可溶性糖含量性状的遗传改良提供新的技术支撑。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、本发明首先构建了一个含344份种质的豇豆核心种质群体，随后于2021年在杭州和广州两地分别进行种植，取各材料商品成熟期(开花后15天)的豆荚，测量可溶性糖含量，采用蒽酮比色法进行测定，使用产自苏州科铭生物技术有限公司的植物可溶性糖含量试剂盒。利用重测序技术对344份种质进行基因型鉴定，鉴定出1,262,497个高质量SNP用于群体结构分析和关联分析，结合该群体的嫩荚可溶性糖含量表型，利用GEMMA软件在全基因组范围内鉴定出3个与嫩荚可溶性糖含量显著相关的区段，其中PSS-11.1区段含有一个β-半乳糖苷酶基因VuPSS3，可能与可溶性糖的合成与转运相关，本发明根据VuPSS3的基因组序列，设计出一个位于11号染色体41950713bp处的SNP-KASP标记VuPSS3_41950713与可溶性糖含量显著相关，说明该标记可以指示豆荚可溶性糖含量基因VuPSS3的筛选，利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型即可判断样本是否携带控制豆荚可溶性糖含量的有利等位变异，基因型的多态性为C/T。进一步用220份其它豇豆种质得到验证。
具体的VuPSS3基因在41950713bp处的SNP为C/T，其在群体中序列变异为：
TCACAAAGTTTTATGGCCTTATGCAAGTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGG[C/T]TGTCTAATAGTTCCTGCATCATGCAGTTCAGATATATTTAGAAGAATATA SEQ ID No：1。
2、检测豇豆豆荚可溶性糖含量QTL PSS-11.1紧密连锁的分子标记的KASP引物，所述KASP引物为以下具体序列：
VuPSS3_41950713KASP引物：
VuPSS3_41950713Primer1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGC-3’；
VuPSS3_41950713Primer2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGT-3’；
VuPSS3_41950713Primer1和VuPSS3_41950713Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光序列；
VuPSS3_41950713Primer_Common：
5’-TATATCTGAACTGCATGATGCA-3’。
其中VuPSS3_41950713Primer1连接FAM基团，VuPSS3_41950713Primer2连接HEX基团。
3、以上技术方案中所述KASP引物、含有KASP引物的试剂或试剂盒在检测豇豆豆荚可溶性糖含量基因中的应用。
4、利用豇豆嫩荚可溶性糖含量基因紧密连锁的分子标记的KASP引物进行选育不同豆荚可溶性糖含量高低豇豆品种的方法，所述方法具体包括以下步骤：
S1、提取豇豆植株样本基因组DNA；
S2、以豇豆植株样本基因组DNA为模板，利用VuPSS3_41950713KASP引物进行KASP标记鉴定；
所述VuPSS3_41950713KASP引物为：
VuPSS3_41950713Primer1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGC-3’；
VuPSS3_41950713Primer2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGT-3’；
VuPSS3_41950713Primer1和VuPSS3_41950713Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光基团；
VuPSS3_41950713Primer_Common：5’-TATATCTGAACTGCATGATGCA-3’。
S3、读取KASP反应检测的荧光信号，若豇豆植株样本基因组DNA显示VuPSS3_41950713Primer2所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带高可溶性糖含量性状基因型；若豇豆植株样本基因组DNA显示VuPSS3_41950713Primer1所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带低可溶性糖含量性状基因型。
进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，其中Primer1连接FAM基团，Primer2连接HEX基团。
进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，KASP反应检测还包括2XKASP Master mix试剂。
进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，KASP反应检测的PCR体系为：DNA 0.8μl，2x KASP Master mix 0.75μl，Primer mix 0.05μl。
进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，KASP反应检测的PCR反应程序为94℃预变性15分钟，94℃变性20秒，61～55℃梯度复性60秒，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃延伸60秒，循环10次；再94℃变性20秒，55℃复性60秒，延伸60秒，循环26次。
本发明的有益效果在于：本发明从344份豇豆核心种质群体的种质的基因型鉴定中，结合该群体的嫩荚可溶性糖含量表型，得出的VuPSS3基因上SNP表型值能够准确区分品种的可溶性糖含量高低。在豇豆品种G98基因组上11号染色体41950713bp处具有C/T多态性，进一步开发了相关的KASP标记进行验证，并利用该标记扩增需要鉴定的材料，验证得到其基因型C/T判断样本中的有利等位变异，可准确快速判断豆荚品种可溶性糖含量高低。从而为豇豆豆荚可溶性糖含量性状的遗传改良提供快速、可靠的检测手段。
利用本发明提供的分子标记及其引物进行不同可溶性糖含量性状的辅助筛选，不进行DNA测序、限制性内切酶等的使用，操作方法简单、快速，而且可以在短时间内进行高通量样本检测，节省人力物力，为豇豆遗传多样性分析、基因定位及未来的分子育种提供充足的标记资源。相比较于传统的基于表型选择，本发明所带来的选择结果更准确，重复性好，极大地提高了品种选育效率，简化育种程序，缩短育种年限。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为VuPSS3_41950713标记位点相关基因KASP标记基因分型图。
图2为VuPSS3_41950713标记位点的种质在不同等位变异的可溶性糖含量差异图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。
实施例1
本实施例使用一个含344份种质的豇豆核心种质群体，随后于2021年在杭州和广州两地分别进行种植，取各材料商品成熟期(开花后15天)的豆荚，测量豆荚可溶性糖含量，采用蒽酮比色法进行测定，使用产自苏州科铭生物技术有限公司的植物可溶性糖含量试剂盒。并同时利用重测序技术对344份种质进行基因型鉴定，最终鉴定出1,262,497个高质量SNP用于群体结构分析和关联分析，结合该群体的嫩荚可溶性糖含量表型，利用GEMMA软件在全基因组范围内鉴定出3个与嫩荚可溶性糖含量显著相关的区段，其中PSS-11.1区段含有一个β-半乳糖苷酶基因VuPSS3，可能与可溶性糖的合成与转运相关。进一步，本发明根据VuPSS3的基因组序列，设计出一个位于11号染色体41950713bp处的SNP-KASP标记VuPSS3_41950713，该SNP位点与可溶性糖含量显著相关，说明该标记可以指示豆荚可溶性糖含量基因VuPSS3的筛选，利用该标记扩增需要鉴定的材料，344份种质中部分材料基因型及其豆荚可溶性糖含量结果如表1所示，根据其基因型即可判断样本是否携带控制豆荚可溶性糖含量的有利等位变异，基因型的多态性为C/T。
表1 344份种质中部分材料基因型及其豆荚可溶性糖含量
VuPSS3基因在41950713bp处的SNP为A/G，其在群体中序列变异为：TATATTCTTCTAAATATATCTGAACTGCATGATGCAGGAACTATTAGACA[A/G]CCTAAGTGGGGCCACCTTAAAGACTTGCATAAGGCCATAAAACTTTGTGAA SEQ ID No：1；
利用该序列设计VuPSS3_41950713的两条特异性引物和一条通用引物，所述引物序列如下：
VuPSS3_41950713KASP引物：
VuPSS3_41950713Primer1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGC-3’；SEQ ID No：2；
VuPSS3_41950713Primer2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGT-3’；SEQ ID No：3；
VuPSS3_41950713Primer1和VuPSS3_41950713Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光序列；
VuPSS3_41950713Primer_Common：
5’-TATATCTGAACTGCATGATGCA-3’；SEQ ID No：4。
实施例2验证
本实施例使用浙江省农业科学院收集到的220份豇豆种质，于2022年秋季在浙江海宁种植，取各材料商品成熟期(开花后15天)的豆荚，利用苏州科铭生物技术有限公司的植物可溶性糖含量试剂盒，采用蒽酮比色法测定嫩荚中可溶性糖含量，每份样本设置2个重复。
用上述220份豇豆种质进行标记验证，取各材料生长两周的幼苗叶片，采用CTAB方法提取基因组DNA，使用IntelliQube基因分型平台，利用VuPSS3_41950713的标记引物(SEQID No：2-SEQ ID No：4)对上述群体的基因组DNA样品进行扩增和荧光检测。PCR反应体系，包含模板DNA 0.8μl，2x KASP Master mix 0.75μl，Primer mix 0.05μl(Primer1、Primer2、Primer_Common引物先分别稀释至100μM，然后按照12％、12％和30％的比例混合在一起，其中ddH2O占比46％)。PCR反应程序为94℃预变性15分钟，94℃变性20秒，61～55℃梯度复性60秒，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃延伸60秒，循环10次；再94℃变性20秒，55℃复性60秒，延伸60秒，循环26次。
利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析，基因分型结果如图1所示，若豇豆样本基因组DNA显示FAM信号(红色)，则即可判断该样本携带豆荚低可溶性糖含量性状等位变异CC(HapI)；若豇豆样本基因组DNA显示HEX信号(蓝色)，则即可判断该样本携带豆荚高可溶性糖含量性状等位变异TT(HapII)。结合其豆荚中测定的可溶性糖含量发现，携带CC(HapI)基因型的株系平均豆荚可溶性糖含量为11.08mg/g，而携带TT(HapII)基因型的株系平均豆荚可溶性糖含量为11.94mg/g，TT基因型可以增加豆荚可溶性糖含量0.86mg/g，两种基因型株系的可溶性糖含量之间差异达到显著水平(p＝0.0458)，说明该标记可以指示可溶性糖含量基因VuPSS3(表2，图2)。图1为VuPSS3_41950713标记分型图，经检测，基因型为CC的共149份，基因型为TT的共66份，图2为携带VuPSS3_41950713不同等位变异株系的可溶性糖含量比较图。
表2部分豇豆种质的基因型及其豆荚可溶性糖含量
上述实验结果表明，本发明涉及的针对11号染色体41950713bp处的SNP-KASP标记VuPSS3_41950713能够通过等位基因型来鉴别选择具有高含糖量潜力的豇豆品种。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.豇豆豆荚可溶性糖含量QTL PSS-11.1紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为VuPSS3_41950713，位于豇豆品种G98基因组上11号染色体41950713bp处，所述分子标记为基于PCR技术的KASP标记，多态性为C/T。
2.根据权利要求1所述的豇豆豆荚可溶性糖含量QTL PSS-11.1紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.检测权利要求1所述豇豆豆荚可溶性糖含量QTL紧密连锁的分子标记的KASP引物，其特征在于，所述KASP引物为以下具体序列：
VuPSS3_41950713KASP引物：
VuPSS3_41950713Primer1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGC-3’；
VuPSS3_41950713Primer2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGT-3’；
VuPSS3_41950713Primer1和VuPSS3_41950713Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光序列；
VuPSS3_41950713Primer_Common：
5’-TATATCTGAACTGCATGATGCA-3’。
4.权利要求3所述KASP引物，其特征在于，其中VuPSS3_41950713Primer1连接FAM基团，VuPSS3_41950713Primer2连接HEX基团。
5.权利要求3或4所述KASP引物、含有KASP引物的试剂或试剂盒在鉴定豇豆豆荚可溶性糖含量中的应用。
6.利用权利要求3所述的KASP引物进行选育不同豇豆豆荚可溶性糖含量高低品种的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
S1、提取豇豆植株样本基因组DNA；
S2、以豇豆植株样本基因组DNA为模板，利用VuPSS3_41950713KASP引物进行KASP反应检测；
所述VuPSS3_41950713KASP引物为：
VuPSS3_41950713Primer1：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGC-3’；
VuPSS3_41950713Primer2：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCTTTAAGGTGGCCCCACTTAGGT-3’；
VuPSS3_41950713Primer1和VuPSS3_41950713Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光基团；
VuPSS3_41950713Primer_Common：5’-TATATCTGAACTGCATGATGCA-3’；
S3、读取KASP反应检测的荧光信号，若豇豆植株样本基因组DNA显示VuPSS3_41950713Primer2所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带高可溶性糖含量性状基因型；若豇豆植株样本基因组DNA显示VuPSS3_41950713Primer1所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带低可溶性糖含量性状基因型。
7.根据权利要求6所述的选育不同荚长的豇豆品种的方法，其特征在于，其中Primer1连接FAM基团，Primer2连接HEX基团。
8.根据权利要求7所述的选育不同豆荚可溶性糖含量的豇豆品种的方法，其特征在于，KASP反应检测还包括2X KASP Master mix试剂。
9.根据权利要求8所述的选育不同豆荚可溶性糖含量的豇豆品种的方法，其特征在于，KASP反应检测的PCR体系为：DNA 0.8μl，2x KASP Master mix 0.75μl，Primer mix 0.05μl。
10.根据权利要求6所述的选育不同豆荚可溶性糖含量的豇豆品种的方法，其特征在于，KASP反应检测的PCR反应程序为94℃预变性15分钟，94℃变性20秒，61～55℃梯度复性60秒，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃延伸60秒，循环10次；再94℃变性20秒，55℃复性60秒，延伸60秒，循环26次。
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