CN116539549A - 一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫分析技术领域，具体为一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：S1：小分子抗原的活化；S2：碱性磷酸酶的活化；S3：抗原和碱性磷酸酶的连接反应；S4：连接物的纯化与测试。该方法能够有效地将包含伯氨基的小分子抗原交联到碱性磷酸酶的表面；实现含氨基小分子抗原高效快速的连接；具有连接效率高、连接物性能优越、批间差容易控制，连接成本低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，具体为一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法。
背景技术
化学发光免疫测定（CLIA）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发发光测的仪进行检测。化学发光免疫测定技术自问世以来发展迅速，在药物筛选、医疗诊断、食品安全检测等众多领域得到广泛应用。酶免疫测定技术既继承了放射性免疫测定的高灵敏度等优点，又克服了前者需使用放射性标记这一缺点。酶免疫测定将酶促反应的高效率和免疫反应的高特异性有机地结合起来，可对各种分析物进行定量检测，是目前灵敏度高、适应性强、并在生产和临床中得到推广的免疫测定技术。另外，在免疫测定中使用酶作为标记，还在于酶能保持长期的稳定性、对操作人员无危害、并避免了放射性免疫中存在的废物处理问题。而制备特定抗体和酶偶联物（酶标记抗体）是能否 实现对特定抗原分析物进行定量检测的关键。
目前用于酶标记抗体制备的方法传统的主要有戊二醛法和过碘酸钠法。戊二醛法也是至今最常见的标记酶到抗体上的偶联方法。它又分为一步法和两步法，一步法操作简便、快速，只要将一定量的酶和抗体加入到缓冲液中，同时加入一定量的戊二醛进行反应。但一步法的缺点是（1）偶联反应不易控制，若被偶联的两种物质与偶联剂的反应速度不同，则反应速度快的那种分子易发生自生聚合；（2）偶联效率不高，参与偶联反应的两种分子所占比率较低。而两步法克服了一步法的缺点，它采用将与偶联剂反应较弱的分子先用过量的偶联剂活化，然后去除多余偶联剂后再加入反应速度相对快的偶联分子。两步法虽然操作繁琐，但偶联率提高，而且形成的同分子聚合物减少。过碘酸钠法是偶联酶和糖蛋白产率最高的方法，该法利用过碘酸钠将糖蛋白（抗体、糖基化的酶等）上的糖链基团氧化成醛基，再通过醛基与待偶联的分子发生连接。与戊二醛法相比，过碘酸钠法的效率提高至少3～4倍。戊二醛法和过碘酸钠法各有优点，但这两种方法也都有一定局限性，比如都涉及使用高浓度的酶和抗体，也需要较为繁琐的分离与纯化步骤，如凝胶过滤、长时间透析或亲和层析柱纯化等，而且在小分子标记酶的效果上效果并不如意。随着化学发光行业的深入发展，越来越多的小分子项目的检测需求也越来越大。市场急需一种稳定可靠的小分子标记酶技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
S1：小分子抗原的活化
1) 称取一定量含氨基小分子抗原纯品粉末，用1N NaOH溶液将抗原溶解至20-30Mm；
2) 称量活化剂1 2-10mg，用碳酸盐缓冲液溶解至1-2mg/ml；
3) 取一定量含氨基小分子抗原溶液+碳酸盐缓冲液稀释，加活化剂1溶液混匀，冰水浴避光16-24h；
S2：碱性磷酸酶的活化
1) 称取活化剂2,用DMF溶解至约70-90mM；
2) 根据ALP量计算需要添加SMCC溶液的体积，根据ALP体积和 需要添加活化剂2溶液的体积计算需加ALP稀释液的体积；
3) 用稀释液将碱性磷酸酶稀释，加入需要体积的活化剂2溶液；37℃水浴反应40min-70min；
S3：连接反应
1) 将活化好的小分子抗原和碱性磷酸酶按一定比例混合；
2) 2-8℃避光反应16-24h；
3) 称取NEM，用DMF配成约100Mm的溶液,按反应总体积约0.5%-2%的比例加入反应液中，室温下封闭10-20min；
4) 活化好的ALP溶液立即过PD10脱盐柱除盐；
5) 用分光光度计在280nm波长下测试ALP浓度（浓度低于2mg/ml时）；
S3：纯化与标定浓度
1） 用G25凝胶柱或者PD10柱子纯化连接物；
2） 用紫外分光光度计在280nm测试连接物吸光度，按ALP连接物浓度=OD280/1计算连接物浓度。
优选的，步骤S1中提到活化剂1为2-亚氨基硫烷盐酸盐。
优选的，步骤S2中所用活化剂包括但不限于SMCC或者sulf-SMCC中的一种或几种。
优选的，步骤S3中使用的封闭剂包括但不限于N-马来酰亚胺或者马来酰亚胺中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明针对现有技术中小分子抗原连接碱性磷酸酶效果不佳，连接流程复杂的问题进行改进。实现含氨基小分子抗原高效快速的连接。具有连接效率高、连接物性能优越、批间差容易控制，连接成本低等优点。
附图说明
图1为本发明T3-AP纯化图谱的示意图。
图2为本发明T3-AP测试曲线的示意图。
图3为本发明T4-AP纯化图谱的示意图。
图4为本发明T4-AP测试曲线的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1至图4，本发明提供一种技术方案：一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
S1：小分子抗原的活化
1) 称取一定量含氨基小分子抗原纯品粉末，用1N NaOH溶液将抗原溶解至20-30Mm；
2) 称量活化剂1 2-10mg，用碳酸盐缓冲液溶解至1-2mg/ml；
3) 取一定量含氨基小分子抗原溶液+碳酸盐缓冲液稀释，加活化剂1溶液混匀，冰水浴避光16-24h；
S2：碱性磷酸酶的活化
1) 称取活化剂2,用DMF溶解至约70-90mM；
2) 根据ALP量计算需要添加SMCC溶液的体积，根据ALP体积和 需要添加活化剂2溶液的体积计算需加ALP稀释液的体积；
3) 用稀释液将碱性磷酸酶稀释，加入需要体积的活化剂2溶液；37℃水浴反应40min-70min；
S3：连接反应
1) 将活化好的小分子抗原和碱性磷酸酶按一定比例混合；
2) 2-8℃避光反应16-24h；
3) 称取NEM，用DMF配成约100Mm的溶液,按反应总体积约0.5%-2%的比例加入反应液中，室温下封闭10-20min；
4) 活化好的ALP溶液立即过PD10脱盐柱除盐；
5) 用分光光度计在280nm波长下测试ALP浓度（浓度低于2mg/ml时）；
S3：纯化与标定浓度
1） 用G25凝胶柱或者PD10柱子纯化连接物；
2） 用紫外分光光度计在280nm测试连接物吸光度，按ALP连接物浓度=OD280/1计算连接物浓度。
步骤S1中提到活化剂1为2-亚氨基硫烷盐酸盐。
步骤S2中所用活化剂包括但不限于SMCC或者sulf-SMCC中的一种或几种。
步骤S3中使用的封闭剂包括但不限于N-马来酰亚胺或者马来酰亚胺中的一种或几种。
实施例1 T3抗原标记碱性磷酸酶
S1：T3抗原的活化
1)称取2.5mg T3抗原纯品粉末，用1N NaOH溶液溶解至28mM。
2)称量2-亚氨基硫烷盐酸盐 2.3mg，用碳酸盐缓冲液溶解至1.42mg/ml。
3)取960ul碳酸盐缓冲液加36ul T3抗原溶液，震荡混匀。加25ul 2-Iminothiolane溶液混匀，冰水浴避光18h。
S2：碱性磷酸酶的活化
1） 称取3.8mg SMCC, 用DMF溶解至约75mM.
2） 根据ALP为5mg量计算需要添加SMCC溶液的体积为17ul，根据ALP体积和 需要添加SMCC溶液的体积计算需加ALP稀释液的体积为0.483ml。
3） 用0.483ml稀释液将碱性磷酸酶稀释，加入17ul的SMCC溶液。37℃水浴 反应50min。
4） 活化好的ALP溶液立即过PD10脱盐柱除盐，收集2.8ml。
5） 用分光光度计在280nm波长下测试ALP浓度（浓度低于2mg/ml时需要用超滤管浓度），实测浓度为1.6mg/ml ，用10KD超滤管超滤后定容至5mg/ml。
S3：连接反应
1)取2mg活化好的碱性磷酸酶体积为0.4ml，加活化好的T3抗原0.75ml，加碳酸盐缓冲液0.75ml，震荡混匀。
2)2-8℃避光反应 18h。
3)称取NEM，用DMF配成约100Mm的溶液,按反应总体积约1.5%的比例加入反应液中。室温下封闭15min。
S4：纯化与标定浓度
1） 用G25凝胶柱或者PD10柱子纯化连接物，收集体积为6.3ml。纯化图谱见图1
2） 用紫外分光光度计在280nm 测试连接物吸光度为0.242。按ALP连接物浓度=OD280/1计算连接物浓度为0.242mg/ml。
3） 打印粘贴标签，测试性能。
实施例2 T4抗原标记碱性磷酸酶
步骤一：T4抗原的活化
2)称取3mg T4抗原纯品粉末，用1N NaOH溶液溶解至28mM。
4)称量2-亚氨基硫烷盐酸盐 2.5mg，用碳酸盐缓冲液溶解至1.385mg/ml。
5)取960ul碳酸盐缓冲液加36ul T4抗原溶液，震荡混匀。加28ul 2-Iminothiolane溶液混匀，冰水浴避光24h。
步骤二：碱性磷酸酶的活化
6） 称取4.1mg SMCC, 用DMF溶解至约75mM.
7） 根据ALP为3mg量计算需要添加SMCC溶液的体积为10.2ul，根据ALP体积和 需要添加SMCC溶液的体积计算需加ALP稀释液的体积为0.488ml。
8） 用0.488ml稀释液将碱性磷酸酶稀释，加入10.2ul的SMCC溶液。37℃水浴 反应50min。
9） 活化好的ALP溶液立即过PD10脱盐柱除盐，收集2.5ml。
10） 用分光光度计在280nm波长下测试ALP浓度（浓度低于2mg/ml时需要用超滤管浓度），实测浓度为1.53mg/ml ，用10KD超滤管超滤后定容至5mg/ml。
S3：连接反应
4)取2mg活化好的碱性磷酸酶体积为0.4ml，加活化好的T4抗原0.8ml，加碳酸盐缓冲液0.7ml，震荡混匀。
5)2-8℃避光反应 18h。
6) 称取NEM，用DMF配成约100Mm的溶液,按反应总体积约1%的比例加入反应液中。室温下封闭15min.
S4：纯化与标定浓度
4） 用G25凝胶柱或者PD10柱子纯化连接物，收集体积为5.97ml。
5） 用紫外分光光度计在280nm 测试连接物吸光度为0.345。按ALP连接物浓度=OD280/1计算连接物浓度为0.345mg/ml。
6） 打印粘贴标签，测试性能。
本发明提供了一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的制备方法，该方法能够有效地将包含伯氨基的小分子抗原交联到碱性磷酸酶的表面，原理为先用2-亚氨基硫烷盐酸盐 活化含伯氨基的小分子抗原表面的氨基，使其形成能跟巯基反应的马来酰亚胺基团，用SMCC或者sulf-SMCC 活化碱性磷酸酶表面的伯氨基使其形成巯基。然后将抗原和碱磷酶按一定比例混合，经反映后纯化即可得稳定的小分子抗原-碱性磷酸酶连接物。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：小分子抗原的活化
1) 称取一定量含氨基小分子抗原纯品粉末，用1N NaOH溶液将抗原溶解至20-30Mm；
2) 称量活化剂1 2-10mg，用碳酸盐缓冲液溶解至1-2mg/ml；
3) 取一定量含氨基小分子抗原溶液+碳酸盐缓冲液稀释，加活化剂1溶液混匀，冰水浴避光16-24h；
S2：碱性磷酸酶的活化
1) 称取活化剂2,用DMF溶解至约70-90mM；
2) 根据ALP量计算需要添加SMCC溶液的体积，根据ALP体积和 需要添加活化剂2溶液的体积计算需加ALP稀释液的体积；
3) 用稀释液将碱性磷酸酶稀释，加入需要体积的活化剂2溶液；37℃水浴反应40min-70min；
S3：连接反应
1) 将活化好的小分子抗原和碱性磷酸酶按一定比例混合；
2) 2-8℃避光反应16-24h；
3) 称取NEM，用DMF配成约100Mm的溶液,按反应总体积约0.5%-2%的比例加入反应液中，室温下封闭10-20min；
4) 活化好的ALP溶液立即过PD10脱盐柱除盐；
5) 用分光光度计在280nm波长下测试ALP浓度（浓度低于2mg/ml时）；
S3：纯化与标定浓度
1） 用G25凝胶柱或者PD10柱子纯化连接物；
2） 用紫外分光光度计在280nm测试连接物吸光度，按ALP连接物浓度=OD280/1计算连接物浓度。
2.根据权利要求1所述的一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤S1中提到活化剂1为2-亚氨基硫烷盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤S2中所用活化剂包括但不限于SMCC或者sulf-SMCC中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种含伯氨基小分子抗原标记碱性磷酸酶的方法，其特征在于：步骤S3中使用的封闭剂包括但不限于N-马来酰亚胺或者马来酰亚胺中的一种或几种。
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