CN114286941A - 用于检测和贫化样品干扰物的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了对抗链霉亲合素物质干扰和抗生物素物质干扰具有特异性的试剂和微粒结合表面的制备方法。还公开了在诊断测试之前如何使用试剂和微粒结合表面来阻断、贫化样品中的抗链霉亲合素物质干扰和抗生物素物质干扰或将其浓度降低至低于测定阻断阈值(ABT)。
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本申请要求2020年4月7日提交的美国临时申请No.63/006,630和2019年6月25日提交的No.62/866,318的优先权，每个所述临时申请的全部内容通过参考并入本文。
背景技术
每9分钟就有一人因诊断错误或延迟而死亡[1]。医生依靠诊断测试来指导治疗，但由于血液或尿液中的多种干扰物(例如血液测试中的生物素)，2％或更多的测试可能不准确[2]。
也被称为维生素B7、维生素H和辅酶R的生物素是一种水溶性维生素，常常以高剂量存在于非处方(OTC)膳食补充剂、复合维生素和产前维生素中。生物素主要用于健康和美容，包括头发、皮肤和指甲生长以及减肥。它也以高治疗剂量提供给患者以治疗某些医学病症，例如多发性硬化症。然而，生物素会显著干扰某些实验室测试并导致不正确的测试结果，可能变得未检测到并可能导致误诊或延误治疗[3-13]。
2017年，FDA因不良事件的数量与不准确的测试结果和生物素补充有关而发布了安全警告[14]。2019年6月13日，FDA发布了一份关于“在体外诊断装置中生物素干扰的测试”(Testing for Biotin Interference in In Vitro Diagnostic Devices)的指导文件草案的通知[15]。
体外诊断(IVD)公司正积极工作以重新设计或重新制定它们的测试，以减轻生物素干扰或提高生物素干扰阈值，使得需要高得多的生物素浓度才能干扰测试。然而，这些基于生物素的测试仍然容易受到与生物素或患者使用生物素或抗生物素干扰物相关的二次干扰机制[16-17]以及与在测试设计中使用链霉亲合素捕获已被偶联到抗体、蛋白质或抗原的生物素或抗链霉亲合素干扰物相关的干扰机制[18-26]的影响。
抗生物素和抗链霉亲合素抗体和蛋白可以显著干扰某些实验室测试并引起不正确的测试结果。与引起测试信号降低或取决于测定法设计和格式引起假低或假高患者结果的生物素干扰物相似，抗生物素物质和抗链霉亲合素干扰物也引起测试信号降低但机制不同，因此它们可能被误认为是生物素干扰物[16-26]。
尽管FDA最近提供了指导要求IVD公司应按照临床和实验室标准协会(CLSI)标准中的建议测试浓度高达1200ng/mL的生物素干扰物，并且为了反映当前生物素消费的趋势，但对于与由人类抗生物素或人类抗链霉亲合素干扰物造成的不准确测试结果相关的不良事件，FDA尚未发布安全警告[15]。尽管人类抗链霉亲合素和人类抗生物素干扰物在文献中已有报道，但很难检测和确认这些特定干扰物的机制或将它们与生物素干扰物区分开。
用固定化或共价偶联到捕获部分或干扰物特异性靶的结合表面(即磁性珠子、非磁性珠子、纳米粒子、微量滴定板/孔、比色杯、载片、传感器、芯片、杆、滤膜、膜、试管或用于加工样品的任何其他固相)进行的样品预处理，可用于在诊断测试之前贫化、富集和/或表征样品干扰物或生物标志物，以提高测试结果的质量和准确性[27]。
发明内容
很大比例的IVD测定法利用链霉亲合素-生物素结合。这些测定法受到来自于游离生物素和竞争或以其他方式干扰测定试剂与链霉亲合素或生物素之间的结合的试剂、包括抗链霉亲合素抗体和抗生物素抗体的嗜异性干扰的影响。干扰测定试剂与链霉亲合素或生物素之间的结合的物质在本文中被称为抗生物素物质或抗链霉亲合素物质，不论所述物质是否是抗体。本文公开的试剂(珠子)可用于：1)检测或量化这些不同类型的干扰物，和2)除去或贫化可能存在于测定试剂、样品或反应混合物中的干扰性物质，以便可以获得更准确的测定结果。还提供了制备和使用这些试剂的方法。
某些本文公开的试剂包含已用链霉亲合素包被的纳米粒子，以形成链霉亲合素珠子。在某些实施方式中，一些或所有所述链霉亲合素被共价偶联到所述纳米粒子。在某些实施方式中，所述纳米粒子是磁性的，以便于从储存溶液和处理过的样品、测定试剂等分离所述珠子。在某些实施方式中，所述纳米粒子可以是磁性也可以不是磁性的，并且所述珠子与储存溶液和处理过的样品的分离通过沉降(例如离心)或过滤来实现。其他实施方式包含游离(或可溶的)链霉亲合素。在游离或包被的珠子中的任一类型的实施方式中，将所述链霉亲合素用最低过量的生物素饱和(或淬灭)，优选为饱和，使得所述链霉亲合素不能在生物素化的测定试剂分子之间桥接并变成嗜异性干扰物的来源。饱和意味着所述链霉亲合素上的所有可及生物素结合位点均被生物素占据。所述游离生物素饱和的链霉亲合素适合用作抗链霉亲合素嗜异性干扰物阻断试剂，其例如可以被添加到测定反应混合物(存在于其中)。所述生物素饱和的链霉亲合素包被的珠子适合用作抗链霉亲合素嗜异性干扰物清洁试剂，其例如可以被添加到待测定的生物学流体或提取物(样品)，然后在将所述样品添加到所述测定反应混合物之前除去。在某些用法中，可以将清洁试剂添加到测定试剂或一部分测定反应混合物，并在完成所述测定反应混合物并开始测定反应之前除去。
在整个本公开中描述了利用链霉亲合素的实施方式。然而，也设想了包含替选物例如亲合素、去糖基化亲合素(中性亲合素)、CaptAvidin、单体亲合素的其他实施方式。也设想了天然和重组版本的链霉亲合素及其替选物。这些试剂可以被称为结合生物素的手段或结合抗链霉亲合素干扰物的手段。
在整个本公开中描述了利用生物素来淬灭或饱和链霉亲合素活性生物素结合位点的实施方式。然而，也设想了使用生物素化试剂例如生物素-PEGn-COOH或生物素-PEGn-CH3或生物素-PEGn-OH或其他生物素-R-(非反应性末端化学基团)(其中R是碳链或环结构)的其他实施方式。生物素和这些生物素的修饰形式可以被称为结合链霉亲合素的手段或结合抗生物素干扰物的手段。
在其他实施方式中，所述链霉亲合素包被的珠子、生物素饱和的链霉亲合素包被的珠子、链霉亲合素或淬灭的链霉亲合素通过偶联一个或多个另外的捕获部分进行修饰，用于除去其他嗜异性或交叉反应性干扰物(除了抗链霉亲合素干扰物之外)。在这些实施方式的一种情况下，所述另外的捕获部分是偶联到所述生物素饱和的链霉亲合素包被的珠子的生物素，并且另外适合用作抗生物素嗜异性干扰物清洁试剂。在这些实施方式的其他情况下，所述另外的捕获部分是钌(一种元素)；鲁米诺、吖啶酯、ABEI或环状ABEI(类似于生物素，小有机分子)；或蛋白质，例如产生信号的酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；链霉亲合素；抗体，例如来自于非人类物种的抗体；或抗原。在其他情况下，所述捕获部分可以是任何非抗体肽或蛋白质。在所有这些情况下，所述另外的捕获部分使所述链霉亲合素包被的珠子或生物素饱和的链霉亲合素包被的珠子适合用作清洁试剂，用于除去或贫化与所述偶联的分子相关的嗜异性或交叉反应性干扰物。某些实施方式具体来说包括一种或多种捕获部分。某些实施方式具体来说排除一种或多种捕获部分。例如，在某些实施方式中，所述另外的捕获部分不是生物素。
有几种化学方法可用于实现与链霉亲合素(可溶性的或珠子结合的、用或未用生物素饱和的)的偶联。偶联可以使用与链霉亲合素的伯胺成键的胺反应性试剂进行，通常为酯，例如NHS修饰的化合物或蛋白质。或者，可以将链霉亲合素的伯胺硫醇化。标准的硫醇化试剂在本领域中是已知的，但包括反-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)和3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺基酯(SPDP)。然后可以使用硫醇或巯基反应性试剂例如马来酰亚胺修饰的化合物或蛋白质进行偶联。在另一个可选方案中，使用标准的酯-马来酰亚胺异双功能交联剂将链霉亲合素的伯胺与马来酰亚胺反应。然后可以使用硫醇或巯基修饰的(或含有它们的)化合物或蛋白质进行偶联。这些化学方法和相关试剂可以被称为偶联手段，并且所述反应本身被称为偶联步骤。
通常，另外的捕获部分与所述链霉亲合素包被的珠子、生物素饱和的链霉亲合素包被的珠子、链霉亲合素或淬灭的链霉亲合素的偶联涉及使用异双功能连接物。所述连接物的一个末端处的官能团与所述链霉亲合素形成共价附连，另一个末端处的官能团与所述另外的捕获部分形成共价附连。特定官能团的化学在后文中讨论。在某些实施方式中，附连到连接物的捕获部分可能是可商购的。某些实施方式具体包括特定的一个官能团或一组官能团。某些实施方式具体排除特定的一个官能团或一组官能团。在某些实施方式中，所述异双功能连接物的中心部分包含聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯(PEO)。在这个实施方式的某些情况下，所述连接物可以包含多个PEG或PEO单元例如PEGn或PEOn，其中n是1至36的任何整数。在其他情况下，所述PEG连接物可以是支链或树枝状的，例如单分散PEG、三功能PEG、4-臂PEG、8-臂PEG、异双功能PEG、同双功能PEG，而不是直链单功能PEG。其他连接物在下文中公开。
在下文中公开了将生物素偶联到生物素饱和的链霉亲合素的各种不同方式。然而，可以将任何其他捕获试剂类似地偶联到链霉亲合素(用或未用生物素饱和的、珠子结合或未结合的)。
在可选实施方式中，所述另外的捕获部分未被共价附连，而是使用生物素连接物附连。在某些实施方式中，所述另外的捕获部分是生物素，并且所述连接物在每个末端具有生物素分子，例如生物素-PEGn-生物素。在此类实施方式中，所述双生物素连接物作为在链霉亲合素饱和程序中所用生物素的一小部分添加(以避免珠子之间的桥接)。由此，一个末端处的生物素与链霉亲合素结合，而另一个末端处的生物素游离，以充当捕获部分。在其他实施方式中，使用在一个末端处带有生物素并在另一个末端处带有任何其他捕获部分的连接物，例如生物素-(PEO)n-钌。在其他实施方式中，可以通过这种方法引入两个或更多个不同的捕获部分，例如用生物素-(PEO)n-钌和生物素-(PEO)n-碱性磷酸酶共包被链霉亲合素。在这些实施方式中，在链霉亲合素饱和程序中使用的生物素的可能更大比例可以是捕获部分连接的生物素，因为珠子之间的桥接不应成为问题；然而，基于所述捕获部分的尺寸和所述连接物的长度的空间考量，可能是限制所述比例的因素。
某些实施方式涉及减轻液体生物样品中的干扰的方法。其他实施方式涉及降低诊断测定中的干扰的方法。在某些实施方式中，将生物素饱和的链霉亲合素(生物素淬灭的链霉亲合素；QSAv)与液体生物样品合并，以形成混合物，将所述混合物混合以促进所述干扰物与所述链霉亲合素的结合，以便阻断或降低干扰。某些实施方式还包括进行诊断测定。在某些实施方式中，所述合并和混合发生在所述测定的分析阶段之前。当在本文中使用时，术语“测定的分析阶段”在将所述样品与所述试剂混合以捕获或检测分析物和/或产生指示或量化所述分析物的存在的信号时开始，并继续直至获得所述信号的测量。
在其他实施方式(用于减轻或降低干扰)中，将用或未用生物素淬灭的包含链霉亲合素的粒子与液体生物样品合并，以形成混合物，将所述混合物混合以促进所述干扰物与所述链霉亲合素的结合，并从所述样品分离所述粒子，以便除去或降低干扰。某些实施方式还包括进行诊断测定。在某些实施方式中，所述合并、混合和分离发生在所述测定的分析阶段之前。在这些方法的一种情况下，所述粒子是磁性的，并且从所述样品分离所述粒子包括将所述混合物暴露于磁铁，并收集所述液体样品。在其他情况下，所述样品未被稀释，并且存在很少或不存在样品损失。
在这些减轻或降低干扰的方法的某些实施方式中，所述样品用于夹心免疫测定。在其他实施方式中，所述样品用于竞争免疫测定。
某些实施方式涉及制备淬灭的链霉亲合素的方法。这些实施方式中的某些包括将所述链霉亲合素暴露于最低摩尔过量的游离生物素。在一种情况下，这可以包括计量添加以将生物素溶液与链霉亲合素溶液合并。这些实施方式中的某些包括用热缓冲液清洗所述淬灭的链霉亲合素。在一种情况下，这可以包括渗滤。某些所述实施方式包括阻断所述链霉亲合素以避免聚集体形成。某些实施方式包括将另外的捕获部分偶联到所述淬灭的链霉亲合素。某些实施方式包括通过这些方法中的任一者制备的淬灭的链霉亲合素。
某些实施方式涉及制备粒子偶联的链霉亲合素的方法。这些实施方式中的某些包括将所述粒子偶联的链霉亲合素暴露于最低摩尔过量的游离生物素。在一种情况下，这可以包括计量添加以将生物素溶液与粒子偶联的链霉亲合素悬液合并。这些实施方式中的某些包括用热水清洗所述淬灭的链霉亲合素。在一种情况下，这可以包括粒子的磁性分离。在其他情况下，这可以包括通过过滤或沉降分离所述粒子。某些实施方式包括将另外的捕获部分偶联到所述用或未用生物素淬灭的粒子偶联的链霉亲合素。某些实施方式包括通过这些方法中的任一者制备的用或未用生物素淬灭的粒子偶联的链霉亲合素。
附图说明
图1描绘了生物素化的100BS链霉亲合素珠子的尺寸分布。该数据显示出883.9nm的均匀尺寸单峰，多分散指数为12.2％。
图2A-B描绘了：(2A)在与链霉亲合素温育30分钟后生物素化的100BS链霉亲合素珠子的尺寸分布。发生珠子聚集，峰位于1,441.3nm和6,641nm处，多分散指数为173.3％；和(2B)与链霉亲合素温育4小时后生物素化的100BS链霉亲合素珠子的尺寸分布。发生珠子聚集，峰位于1,512.6nm和14,536nm处，多分散指数为242.8％。
图3描绘了在与单克隆抗生物素偶联物抗体温育过夜后生物素化的100BS链霉亲合素珠子的尺寸分布。发生珠子聚集，峰位于2,148nm处，多分散指数为316.2％。
图4A-C描绘了(4A)抗生物素抗体的SEC-HPLC标准曲线。用箭头指示的数据点对应于在用生物素化的100BS链霉亲合素珠子预处理以贫化抗生物素抗体后样品中的峰面积和剩余抗生物素抗体(μg/mL)。4B-C描绘了在用生物素化的100BS链霉亲合素珠子(4B)贫化之前和(4C)贫化之后，抗生物素抗体的SEC-HPLC分析。在贫化抗生物素抗体之后，峰面积从1,384减小到318，抗生物素抗体的浓度从205μg/mL降低到44.62μg/mL。
图5A-D是来自于使用生物素化的100BS链霉亲合素珠子的HPLC-SEC贫化测定的处理之前和之后的色谱图。5A示出了不存在亲和纯化的山羊IgG被所述珠子的贫化。5B示出了不存在生物素化的亲和纯化的山羊IgG被所述珠子的贫化。5C示出了山羊抗生物素Ab被所述珠子的贫化。5D示出了山羊抗链霉亲合素抗体被所述珠子的贫化。在所有情况下未处理和处理的曲线用标记的箭头指示。
图6描绘了在具有各种不同的干扰物并使用和不使用生物素化的100BS链霉亲合素珠子处理的情况下，通过ELISA检测的血清甲状旁腺激素的量。无-无干扰物；生物素->250ng/mL；抗生物素IgG-16.5μg/mL的Ab；Anti-SAv IgG-16.5μg/mL的Ab；抗生物素IgG/SAvIgG-8.25μg/mL的每种Ab。
图7描绘了在饱和程序中用于向链霉亲合素计量添加生物素的装置。
图8描绘了用于生物素饱和的链霉亲合素的渗滤、清洗和浓缩的装置。
详细描述
尽管已有方法用于鉴定或贫化引起测定干扰的化合物，但对检测和减轻患者样品中的抗生物素和抗链霉亲合素物质干扰的快速且易于使用的产品解决方案，仍存在着临床需求。此类产品解决方案也将促进流行性研究，以帮助临床医生和实验室医学专业人员更好地了解哪些患者和患者群体面临这些干扰的风险最大。
对于通过使用特异性针对测定制剂中的抗链霉亲合素物质干扰的阻断试剂来减轻患者样品中的抗链霉亲合素物质干扰，也存在着临床需求。这种产品解决方案也将对实验室工作流程具有最小影响，因为抗链霉亲合素物质干扰将被所述诊断测试设计减轻。
免疫测定受到干扰可能导致报告被测定的分析物的假的高或低水平。一种类型的干扰涉及信号生成和观测。它们包括诸如混浊、溶血、淬灭和信号生成酶的抑制等因素。一般来说，这些干扰是可以直接观察的，或者可以在没有专门试剂的情况下进行测试。本文公开的实施方式不解决这样的信号生成/观测干扰，并且本文对干扰的一般性指称不包括此类干扰。
另一种类型的免疫测定干扰涉及分析物的捕获和物理检测。它们包括抑制分析物与捕获或检测试剂之间的相互作用或不论分析物存在(还是不存在)均引起捕获和检测试剂结合的干扰。这种类型的干扰被称为嗜异性干扰；当在本文中使用时，“干扰”应该被理解为意味着嗜异性干扰，除非上下文另有规定。本文公开的实施方式解决各种不同的特异性嗜异性干扰。一般来说，嗜异性干扰不是可直接观测的，它们的存在也不能用标准测定试剂容易地证实。某些本文公开的实施方式可用于证实特定嗜异性干扰的存在或对其定量。嗜异性干扰物包括生物素、抗生物素物质、抗链霉亲合素物质和抗异种抗体干扰物，以及与测定法信号生成系统的组分(酶、荧光剂等)结合的干扰物。抗异种抗体干扰物包括识别小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛和/或山羊免疫球蛋白的人类抗体。
另一种类型的免疫测定干扰涉及交叉反应性抗体。当针对一种特定抗原的抗体成功地与另一种不同抗原结合时，在所述抗原之间出现交叉反应性。换句话说，交叉反应性涉及抗体与其免疫原之外的抗原的结合。这在例如旨在检测识别来自于特定株的细菌或病毒的抗原的抗体的免疫测定中可能是特别成问题的。此类测定通常用于确定受试者是否已暴露于所讨论的病原体或因子(被其感染)。如果受试者以前已暴露于相关株，则它们可能具有将与来自于所述测定法旨在检测的株的抗原交叉反应的抗体，因此产生假阳性结果。
当在本文中使用时，“免疫测定法”通常是指其中分析物的检测或定量利用了与所述分析物特异性结合的抗体(或其抗原结合片段或衍生物)的测定法。然而，也可以设计在其中与抗分析物抗体类似地使用可以特异性结合所述分析物的非抗体试剂的测定法。在某些实施方式中，所述可以特异性结合所述分析物的非抗体试剂是适体或分子印迹聚合物。因此，在某些实施方式中，“免疫测定法”可以涵盖其中非抗体试剂提供通常由抗体提供的分析物特异性结合活性的测定法。各种不同的实施方式具体包括或排除了抗体或非抗体试剂作为所述分析物特异性结合活性。某些实施方式具体包括或排除了适体或分子印迹聚合物。免疫测定法可以在技术和组分的物理排布、测定法格式的基础上分类。一种类型涉及将样品(潜在地含有分析物)与检测和/或信号生成试剂在容器例如微量管或微量滴定板中合并，在其中进行测定反应。在测定过程中可以将试剂添加到容器或从容器移除。(在某些变化形式中将一部分测定组分从初始容器取出并添加到第二个容器，在其中继续进行测定。)此类测定法在本文中将被称为“锅式”测定法。在另一种类型中，将某些检测和/或信号生成试剂固定到固体基材或基质例如膜的特定区域。将样品(潜在地含有分析物)施加到含有所述固体基材或基质的装置的特定位置，并通过移动例如通过侧向流移入并通常通过固定有所述试剂的区域，遇到所述固定的试剂。其他测定试剂将随着所述流动相移动。此类测定法在本文中被称为“区域式”测定法。从对于锅式测定法来说向进行测定反应的容器添加样品的时间点或对于区域式测定法来说向含有固体基材或基质的装置的特定位置添加样品的时间点直至生成的信号的测量，被称为所述测定的分析阶段。在许多实施方式中，在所述分析阶段之前，向样品添加本文公开的干扰清洁或阻断试剂以及将清洁试剂从所述样品中除去；也就是说，在这些实施方式中，所述干扰减除试剂被用作“预处理”。
摄入用于健康和美容(每天5,000至20,000mcg)或用于治疗(每天100,000至300,000mcg)的高剂量生物素的患者可能在他们的血液中具有高的生物素循环浓度，可以高达1,000ng/mL或更高，其取决于从生物素摄入起的时间长度、患者特异性生物素清除时间以及患者是否具有可能损害生物素清除并提高生物素循环水平的肾病或肾功能不良。如果在抽取血液、血清或血浆样品之前或在收集尿液样品之前患者的游离生物素尚未被清除到低于测试特异性生物素干扰阈值，则所述样品中高于所述测试特异性生物素干扰阈值的任何生物素将竞争并结合抗生物素物质捕获部分(即，链霉亲合素、亲合素、中性亲合素、单体亲合、CaptAvidin或对生物素具有特异性的抗体、抗体片段/Fab/F(ab)’2、适体和分子印迹聚合物)，并随后干扰在所述测定制剂中使用的生物素化抗体、蛋白质或抗原的结合。这将产生假的低测定信号，并且取决于测定法格式产生假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。
链霉亲合素是一种～52,000–55,000KDa的蛋白质，并由4个相同的多肽链组成。当在本文中使用时，单体链霉亲合素是指非聚集的链霉亲合素蛋白，但不是指解离的链霉亲合素多肽链。生物素与链霉亲合素的结合(文献中报道为10-14或10-15mol/L不等)是自然界中已知的最强非共价相互作用之一。重组链霉亲合素是在免疫学和分子诊断学中获得通用测试系统的适合工具，并且常用于在诊断测试例如免疫测定法中捕获生物素化抗体、蛋白质和抗原，或将各种不同的生物分子彼此附连或附连到固体支持物例如微孔板、珠子和微阵列上。链霉亲合素的使用也使测定法开发者能够利用已被证明的抗生物素物质延迟捕获测定法格式，以获得改进的测定法动力学、精密度和灵敏度，同时有助于STAT测定法更短的测定温育时间和更快的周转时间(TAT)。
如果样品含有对链霉亲合素具有特异性的干扰物，则所述抗链霉亲合素干扰物可以与链霉亲合素或其多肽链结合，并在空间上阻断或损害偶联的生物素与链霉亲合素的生物素结合位点的结合。如果链霉亲合素不再可以自由地结合在测试设计或测定法格式中使用的生物素化抗体、蛋白质或抗原，则就像生物素干扰物一样，抗链霉亲合素干扰物将产生假的低测定信号，并且可以产生假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。同样地，如果样品含有对生物素具有特异性的干扰物，则所述抗生物素干扰物可以与生物素结合，并在空间上阻断或损害偶联的生物素与链霉亲合素的生物素结合位点的结合。如果生物素来自于在测试设计或测定法格式中使用的生物素化抗体、蛋白质或抗原等，则抗生物素干扰物将产生假的低测定信号，并且同样可以产生假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。某些实施方式针对抗链霉亲合素干扰物。某些实施方式针对抗链霉亲合素和抗生物素干扰物两者。
尽管在免疫测定法机制的捕获部分中通常使用生物素-链霉亲合素相互作用，但通过与常用检测组分的相互作用也可能产生嗜异性干扰。此类组分可以包括荧光剂例如荧光素或元素钌；化学发光剂例如鲁米诺、吖啶酯、ABEI和环状ABEI；生物发光剂例如萤光素；以及酶例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。与这些信号生成分子结合的干扰物可以引起结合到分析物和不结合到分析物的检测抗体(或其他检测试剂)之间的交联，产生假的高信号。某些实施方式针对抗链霉亲合素和抗信号生成分子干扰物两者。
免疫测定法通常利用来自于非人类物种的抗血清、多克隆抗体或单克隆抗体。血清或其他测定样品可能含有识别这些异种抗体的干扰物，有时被称为人抗动物抗体(HAAA)。具体来说，人类产生针对广泛种类的动物物种的抗体。通常，它们是与其发生最多相互作用的物种例如小鼠、奶牛、马、狗、猫、山羊和绵羊。其中，来自于小鼠、山羊、兔和绵羊的抗体、特别是IgG，在临床免疫化学测定系统中非常常用。然而，在来自于非人类受试者的样品中可以引起相似的嗜异性干扰。此类抗抗体干扰物可以在不存在结合的分析物的情况下引起捕获和检测抗体之间的交联，或引起结合到分析物和未结合到分析物的检测抗体之间的交联，产生假的高信号或假的低信号。某些实施方式针对抗链霉亲合素和抗异种抗体干扰物两者。
存在两种应对免疫测定法干扰的方法，阻断和清洁。当在本文中使用时，阻断试剂存在于测定反应中，并通过它与干扰性物质的相互作用阻止或降低干扰。某些实施方式包括或利用可溶性的、生物素饱和的链霉亲合素，并适用于阻断抗链霉亲合素干扰物。在某些实施方式中，所述可溶性的、生物素饱和的链霉亲合素与易于被干扰性物质结合的第二分子(例如生物素、信号生成分子或异种抗体)偶联。包含或利用与第二干扰靶分子偶联的可溶性的、生物素饱和的链霉亲合素的实施方式适用于阻断抗链霉亲合素和抗第二分子干扰物两者。某些实施方式具体包括一个或多个属类或种类的第二干扰靶分子。某些实施方式具体排除了一个或多个属类或种类的第二干扰靶分子。阻断试剂可以在测定的分析阶段期间添加，或在分析前阶段添加并在分析阶段中保留。在某些实施方式中，阻断试剂也可以在区域式测定法例如侧向流测定法的分析阶段期间遇到，或者可以保留在这种测定法的特定区域中。当在本文中使用时，所述测定的分析阶段是指所述测定法或测定系统中发生分析物捕获、检测和定量的时间部分和/或物理部分。
应该指出，术语“阻断”在本文中以超过一个含义使用，尽管所述含义在概念上相关。在本文公开的试剂的制备中，“阻断”等用于描述阻碍或以其他方式降低化学反应性位点的反应性和特异性和/或非特异性结合位点的有效亲和性。这可以被称为制备性阻断。因此，本文中用于阻止反应和/或与本文公开的链霉亲合素包被的珠子的核心纳米粒子的非特异性结合或蛋白质的聚集的去污剂和聚合物阻断试剂，涉及“阻断”的这个含义。用生物素饱和链霉亲合素也可以被视为一种形式的制备性阻断，其中生物素是阻断试剂。制备性阻断不应与作为不同功能的阻止或降低测定干扰的阻断相混淆。
当在本文中使用时，清洁试剂被添加到血清或其他生物学样品或免疫测定反应混合物的其他组分，然后在将所述免疫测定反应混合物的各组分混合在一起之前从所述样品或其他组分中除去。也就是说，所述清洁试剂在测定的分析前阶段中使用并除去，并且不存在于分析阶段中。通过从所述样品和/或其他测定试剂中贫化或除去干扰性物质，阻止或减少了干扰。某些实施方式包含或利用了包被在磁性纳米粒子上的生物素饱和的链霉亲合素，即生物素饱和的链霉亲合素珠子。此类生物素饱和的链霉亲合素珠子适用于清洁链霉亲合素干扰。在某些实施方式中，所述珠子的生物素饱和的链霉亲合素与易于被干扰性物质结合的第二分子(例如生物素、信号生成分子或异种抗体或抗原)偶联。包含或利用其中链霉亲合素与第二干扰靶分子偶联的生物素饱和的链霉亲合素珠子的实施方式，适用于清洁抗链霉亲合素和抗第二分子干扰物两者。某些实施方式具体包括一个或多个属类或种类的第二干扰靶分子。某些实施方式具体排除了一个或多个属类或种类的第二干扰靶分子。
可以将所述生物素饱和的链霉亲合素珠子与它们的储存缓冲液磁性分离，除去所述储存缓冲液，然后向所述珠子添加待清洁的样品或试剂，使得与使用可溶性阻断试剂不同，所述样品或试剂在清洁过程中不被稀释。在其他实施方式中，通过过滤或沉降将所述珠子与流体相分离。
在测试设计、格式或制剂中使用链霉亲合素的测试不能简单地使用天然链霉亲合素作为测定缓冲液中的特异性阻断剂、添加剂或组分以减轻样品中的抗链霉亲合素物质干扰。如果在测试中用作阻断剂，链霉亲合素也可能竞争并结合生物素化的抗体、蛋白质、寡聚物或抗原，并产生假的低测定信号和假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。这对于链霉亲合素来说尤其令人担忧，因为它对生物素具有非常强的结合常数和亲和性。尽管某些测试可以通过提高在测试中使用的链霉亲合素的总量或总浓度来减轻较低滴度或浓度的抗链霉亲合素物质的干扰，但这是测试特异性的和测定格式特异性的，并增加测试成本。如果样品含有超过测试特异性链霉亲合素干扰阈值的高滴度或水平的抗链霉亲合素干扰物，这也可能不起作用。
本文公开的干扰阻断试剂是基于生物素饱和的链霉亲合素，也被称为淬灭的链霉亲合素(QSAv)。所述QSAv应该主要是非聚集的，即基于单体链霉亲合素蛋白。在某些情况下，主要非聚集的QSAv具有通过孔径排阻层析HPLC测量的<5％的聚集，<1％的二聚体或聚集体，其中单体峰的平均观察分子量为52至55KD。在其他情况下，所述QSAv至少80、90、95、97、98、99％为单体，或由这些值限定的任何范围。在某些实施方式中，所述链霉亲合素用例如去污剂或聚合物阻断试剂阻断，以便将它维持在单体、非聚集状态。QSAv可用于阻断抗链霉亲合素干扰物。在某些实施方式中，所述链霉亲合素在生物素饱和之前、期间或之后可以用一个或多个另外的捕获部分修饰。所述捕获部分可以在所述生物素饱和过程之前或之后共价偶联到所述链霉亲合素。或者，所述捕获部分可以在所述生物素饱和过程之前或期间被生物素化，并通过生物素-亲合素结合而被结合到链霉亲合素。然而，如果所述另外的捕获部分是生物素，例如通过使用双生物素连接物来实现，则它必须在过量的游离生物素存在下(即在饱和过程中)被结合到所述链霉亲合素。包含已用一个或多个另外的捕获部分修饰的链霉亲合素的实施方式，可用于阻断抗链霉亲合素物质干扰和由结合所述一个或多个捕获部分的试剂造成的干扰。
本文公开的干扰清洁试剂是基于与微粒(或纳米粒子)偶联的链霉亲合素，以形成链霉亲合素化珠子。珠子(特别是磁性珠子)的使用便于在没有损失或稀释的情况下清洁样品或测定试剂。在某些实施方式中，将所述链霉亲合素用生物素饱和，而在其他实施方式中不如此。包含已用生物素饱和的链霉亲合素的实施方式可用作清洁试剂，以除去或减少抗链霉亲合素干扰物。包含未用生物素饱和的链霉亲合素的实施方式可用作清洁试剂，以除去或减少生物素干扰物和抗链霉亲合素干扰物两者。在某些实施方式中，所述链霉亲合素在生物素饱和之前、期间或之后可以用一个或多个另外的捕获部分修饰。所述捕获部分可以在所述生物素饱和过程之前或之后共价偶联到所述链霉亲合素。或者，所述捕获部分可以在所述生物素饱和过程之前或期间被生物素化，并通过生物素-亲合素结合而被结合到链霉亲合素。包含已用一个或多个另外的捕获部分修饰的链霉亲合素的实施方式，可用于阻断抗链霉亲合素物质干扰和由结合所述一个或多个捕获部分的试剂造成的干扰。在那些利用生物素饱和的链霉亲合素的实施方式中，所述一个或多个捕获部分可以包括生物素。
所述另外的捕获部分可以是引起嗜异性或交叉反应性干扰的任何物质，例外的是如果所述链霉亲合素未用生物素饱和，则所述另外的捕获部分不能是生物素。在某些实施方式中，所述另外的捕获部分是钌(一种元素)；鲁米诺、吖啶酯、ABEI或环状ABEI(类似于生物素，小有机分子)；或蛋白质例如信号生成酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶；链霉亲合素；抗体，例如来自于非人类物种的抗体；或抗原。在某些实施方式中，所述抗原是可以被能够与将要用作免疫测定法的捕获部分的抗原交叉反应的抗体识别的抗原。在各种不同实施方式中，所述在清洁或阻断试剂中或在测定法中用作捕获部分的抗原是过敏原、来自于病原体的抗原或与疾病或障碍相关的抗原，例如花生过敏原、单纯性疱疹病毒抗原和自身免疫原，例如具有已知的自身抗体干扰问题的心肌肌钙蛋白I或TSH。在某些实施方式中，所述来自于病原体的抗原是病毒抗原、细菌抗原、原生生物抗原。在某些实施方式中，所述捕获部分移除针对MERS病毒、SARS病毒或SARS-CoV-2之外的其他冠状病毒的交叉反应性抗体。某些实施方式具体包括一个或多个这些属类或种类的捕获部分。某些实施方式具体排除了一个或多个这些属类或种类的捕获部分。
可以构建或购买具有不同连接物类型和长度的生物素连接物或偶联的生物素，并且可以使用不同的官能团将生物素共价附连到抗体、抗体片段、肽、寡聚物、抗原和小分子(偶联的生物素)。与生物素一起使用的常见连接物和官能团(例如NHS酯、TFP酯、酰肼、马来酰亚胺、硫醇等)是NHS-生物素、NHS-LC-生物素、TFP-LC-生物素、NHS-LC-LC-生物素、NHS-chromalink-生物素、NHS-PEO4-生物素、NHS-(PEO)n-生物素、TFP-(PEO)n-生物素、酰肼-生物素、酰肼-LC-生物素、酰肼-PEO4-生物素、马来酰亚胺-(PEO)n-生物素和SH-(PEO)n-生物素。生物素标记试剂可以是胺反应性、羧基反应性、羰基反应性、水溶性的和可切割的。实例包括胺反应性、羰基反应性、羧基反应性、可切割的生物素、点击化学、脱硫生物素、巯基反应性、四嗪连接、生物素醇、双生物素-PEG和D-生物素-PEG-沙利度胺。
如果样品含有对生物素特异性的干扰物，则所述抗生物素干扰物可以与测试设计或测定格式中使用的偶联的生物素结合，并在空间上阻断或损害所述偶联的生物素结合链霉亲合素固相或其他抗生物素捕获部分的可及性。如果偶联的生物素不再能够自由结合所述抗生物素捕获部分，就像生物素干扰物和抗链霉亲合素干扰物一样，抗生物素干扰物将引起假的低测定信号，并且可以引起假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。
在测试设计、格式或制剂中使用生物素偶联物的测试不能简单地使用生物素或偶联的生物素作为测定缓冲液中的特异性阻断剂、添加剂或组分以减轻样品中的抗生物素物质干扰。如果在测试中用作阻断剂，生物素也可能竞争并结合在所述测试中使用的链霉亲合素，并产生假的低测定信号和假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。尽管低于测试特异性生物素干扰阈值的低浓度生物素可用于阻断抗生物素干扰物，但如果患者样品也含有接近于所述干扰阈值的生物素干扰，则这可能是有问题的，其中样品生物素(内源生物素)和测试生物素(作为阻断剂的生物素)的组合或总量可能超过所述测试特异性生物素干扰阈值，并产生假的低测定信号和假的低剂量(夹心测定法)或假的高剂量(竞争性抑制测定法)。
链霉亲合素非常快速且非常强烈地结合生物素(在文献中报道的结合常数为10-14或10-15mol/L不等)。尽管某些研究表明存在蛋白质结构变化或生物素与4个结合位点的协作结合[28-29]，但其他研究的结论是生物素与四聚体的四个亚基的结合不存在协作结合[30-31]。如果将链霉亲合素暴露于摩尔过量的游离生物素，生物素与所有4个结合位点将发生非常快且强烈的结合相互作用，并导致所有生物素结合位点的100％生物素饱和(100BS)。由于具有自然界中已知的最强非共价结合相互作用以及在正常生理条件和pH下生物素从链霉亲合素非常缓慢的解离速率，因此100BS链霉亲合素结合诊断测试中的其他生物素或偶联的生物素例如生物素化的抗体、蛋白质、寡聚物和抗原的可能性非常低。当在本文中使用时，饱和是指用生物素阻断链霉亲合素上的生物素结合位点；这不是生物素化，即生物素与链霉亲合素的共价附连。饱和的链霉亲合素可以结合抗链霉亲合素物质，但是将不结合或交联带有生物素的物质。生物素饱和的链霉亲合素也可被称为淬灭的链霉亲合素(QSAv)。
可以将链霉亲合素用生物素(即D-生物素)饱和来制备100BS链霉亲合素，以用作阻断剂来减轻或管理抗链霉亲合素物质的干扰。在其他实施方式中，可以代之以将链霉亲合素暴露于溶解的生物素化试剂例如生物素-PEG(n)-COOH或生物素-PEG(n)-CH3或生物素-PEG(n)-OH或其他生物素-R-(非反应性末端化学基团)，来实现链霉亲合素活性生物素结合位点的淬灭，其中R是碳链或环结构。饱和涉及将链霉亲合素暴露于摩尔过量的生物素。在各种不同实施方式中，生物素与链霉亲合素的摩尔比在5:1至11:1或7:1至11:1或7:1至8:1的范围内。在某些实施方式中，所述摩尔比是7.4:1。在某些实施方式中，将链霉亲合素在单一批次中暴露于构成所陈述的摩尔比的所有饱和用生物素。在其他实施方式中，饱和通过迭代批次来进行，每个批次含有总生物素的一部分，批次的总和构成所陈述的摩尔比。例如，人们可以使用生物素:链霉亲合素比例为2:1的三个迭代批次来代替比例为6:1的单一批次；在所述迭代批次的每个批次中所述生物素:链霉亲合素比例不必相同。在某些实施方式中，将生物素溶液和链霉亲合素溶液通过经Y型连接器计量添加来合并。在某些实施方式中，在连接到Y型连接器出口的管路中存在在线混合器，以确保快速、即时和完全的混合。可以使用泵速和管路长度的组合来确定饱和过程中的总相互作用时间。在某些实施方式中，将9体积的生物素溶液与1体积的链霉亲合素溶液合并。在某些实施方式中，所述链霉亲合素和生物素溶液在pH 8.5的tris缓冲盐水中制备。在一种情况下，起始链霉亲合素浓度在0.1至10.0mg/mL的范围内，以便得到的QSAv溶液具有0.01至1.0mg/mL，但优选为0.02至0.05mg/mL范围内的链霉亲合素浓度。这样的条件促进生物素结合位点的饱和并减少生物素与链霉亲合素的非特异性结合。
在某些实施方式中，然后通过重复地浓缩并重新稀释QSAv，例如在中空纤维滤器中使用渗滤，对所述QSAv进行一系列热缓冲液清洗。所述清洗用于除去过量且非特异性结合的生物素，使其不会在将QSAv用作干扰阻断试剂时变成干扰源。在某些实施方式中，使用4-6次或更多次清洗，例如5次清洗，然后进行最终浓缩步骤以减小体积，达到例如0.1至30mg/mL或1至10mg/mL的所需浓度。在一种情况下，可以将体积减少到QSAv溶液的原始体积的5-20％，例如10％。在某些实施方式中，所述热清洗的温度是15℃至60℃，优选为40℃至55℃，但更优选为45℃至50℃。在某些实施方式中，所述热清洗缓冲液具有7.5至11或8至9范围内的pH，例如8.5。在某些实施方式中，所述热清洗缓冲液具有10至500mM或20至150mM或25至75mM范围内的NaCl浓度。在某些实施方式中，所述缓冲液是10mM tris，50-150mMNaCl。在清洗和最终的浓缩步骤后，游离生物素的浓度应该<1200pg/mL，例如<1000、<800、<700或<600pg/mL。在某些实施方式中，清洗过的QSAv溶液包含1-6pg游离生物素/μg链霉亲合素。在某些实施方式中，将来自于最终渗滤的流出物通过计量添加与PBS合并，适合地浓缩，以提供PBS中的QSAv。在某些实施方式中，为了清洁样品，向400μl样品添加一定体积的QSAv，使得所述体积将含有<480pg游离生物素。
在某些实施方式中，收集来自于饱和过程的流出物用于晚些时候的清洗，在其他实施方式中将来自于饱和过程的流出物直接进料到中空纤维过滤装置中。可以将所述来自于饱和过程的流出物分开进料到多个中空纤维滤器，以提高容量并避免过高背压。
这些链霉亲合素溶液是相对稀的并略微倾向于聚集，这是一个在使用珠子偶联的链霉亲合素时未遇到的问题。这是因为，为了产生QSAv，在饱和和清洗程序中使用了碱性缓冲液。(作为对比，在珠子偶联的链霉亲合素的类似清洗中使用水)。通过在清洗缓冲液中包含0.01-1％w/v TWEEN 20或另一种表面活性剂，可以进一步减轻聚集。通过在用生物素饱和之前用预备性阻断试剂共价修饰，例如通过链霉亲合素的PEG化，可以进一步减轻聚集。因此，在某些实施方式中，所述QSAv是阻断的、单体的、生物素饱和的链霉亲合素。在某些实施方式中，单体QSAv具有通过孔径排阻层析HPLC测量的<5％的聚集体；在其他实施方式中，所述单体QSAv具有<1％的聚集体。
在一个实施方式中，100BS链霉亲合素(QSAv)可以用作阻断试剂或蛋白质阻断剂，以靶向并贫化样品中的抗链霉亲合素干扰物。可以将100BS链霉亲合素添加到在测试制剂中使用的测定缓冲液、阻断缓冲液或测试组分(例如检测抗体)或其任何组合，以减轻测试对抗链霉亲合素干扰物的敏感性。在另一个实施方式中，将链霉亲合素共价偶联到微粒结合表面并随后与摩尔过量的生物素温育，以制备100BS链霉亲合素珠子。所述100BS链霉亲合素珠子可用于预处理样品，以在诊断测试之前靶向并贫化抗生物素干扰物。
本文公开的干扰清洁试剂是基于链霉亲合素偶联的珠子。在某些实施方式中，将所述链霉亲合素在附连到核心粒子后用生物素淬灭(饱和)。在某些实施方式中，将所述链霉亲合素在例如使用本文中描述的QSAv附连到核心粒子之前用生物素淬灭。在某些实施方式中，所述核心粒子是磁性的。在某些实施方式中，所述核心粒子的直径≥500nm或约半μm，并因此可以被称为纳米粒子或微粒。在某些实施方式中，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺化学将所述核心粒子共价偶联到链霉亲合素。为了除去被动吸附的链霉亲合素，并且为了在进一步的制备步骤中和在用作干扰清洁试剂时防止与珠子的非特异性结合，将所述珠子的表面用剥离试剂(盐、去污剂、低和高pH)调制并使用去污剂和聚合物阻断试剂阻断所述珠子。这也促进纳米粒子单分散和胶体稳定性。为了生产100BS链霉亲合素珠子，可以与上述10BS链霉亲合素(QSAv)的生产类似地进行链霉亲合素的生物素淬灭。饱和涉及将珠子偶联的链霉亲合素暴露于摩尔过量的生物素。如上所述，可以代之以通过将链霉亲合素暴露于溶解的生物素化试剂例如生物素-Peg(n)-COOH或生物素-Peg(n)-CH3或生物素-Peg(n)-OH或其他生物素-R-(非反应性末端化学基团)来实现链霉亲合素活性生物素结合位点的饱和，其中R是碳链或环结构。在各种不同实施方式中，生物素与链霉亲合素的摩尔比在4:1至6:1的范围内，例如5:1。生物素的有效摩尔过量略微高于该正式比率，因为由于核心粒子的空间位阻，某些生物素结合位点将不可接近。在某些实施方式中，所述链霉亲合素化珠子被悬浮并且生物素溶液被配制在pH 6.8的PBS中。在某些实施方式中，将所述生物素溶液和珠子悬液在容器中合并并例如在室温下混合1小时。在某些实施方式中，基本上如上文在QSAv的生产中所述通过计量添加来合并所述链霉亲合素化珠子悬液和生物素溶液。
在某些实施方式中，对所述生物素饱和的链霉亲合素化珠子进行热清洗，以除去被动吸附的生物素，使得它在使用中不脱离下来并变成干扰源。与上述100BS链霉亲合素不同，清洗所述100BS链霉亲合素珠子可以利用过滤、沉降或磁性分离作为渗滤的替选方案。清洗与100BS链霉亲合素清洗的差异也可以在于使用热的碱性(pH≥7.5)水代替缓冲液。也将清洗悬液超声处理。在某些实施方式中，清洗过的100BS链霉亲合素珠子的悬液的游离生物素浓度<1200pg/mL，例如<1000、<800、<600、<400或<200pg/mL。在某些实施方式中，清洗过的100BS链霉亲合素珠子的悬液包含5-30pg游离生物素/μg链霉亲合素。在某些实施方式中，为了清洁样品，向400μl样品添加一定体积的100BS链霉亲合素珠子，使得所述体积将含有<480pg的游离生物素。
也可以将游离生物素(即D-生物素)添加到100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子储存溶液、测定缓冲液或测试组分，以提高100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子的稳定性并确保所述链霉亲合素随时间仍被生物素100％饱和。在一个实施方式中，含有过量生物素的储存溶液、测定缓冲液或测试组分中的100BS链霉亲合素可以用作阻断试剂，以使用单一阻断试剂即可靶向抗链霉亲合素和抗生物素干扰机制两者。在一个实施方式中，所述阻断试剂可以在测试之前用于预处理样品，从而阻断抗链霉亲合素和/或抗生物素干扰机制。在一个实施方式中，所述阻断试剂可以在诊断测试或测定法设计中，例如在测定缓冲液或试剂缓冲液中使用，以在测试期间阻断和减轻干扰机制。在一个实施方式中，可以向100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子以高达1,100pg/mL的生理范围内的浓度添加游离生物素。在另一个实施方式中，可以向100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子以例如100,000pg/mL(100ng/mL)或1,000,000pg/mL(1,000ng/mL)的高浓度添加游离生物素。如果100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子被储存在含有游离生物素的溶液中，它将保持为100BS链霉亲合素，因为从链霉亲合素解离的任何生物素，由于链霉亲合素与生物素的非常强的结合常数和快速结合速率，将立即被来自于添加到储存溶液的生物素的另一个生物素代替。因此，100BS链霉亲合素或生物素淬灭的链霉亲合素可以作为阻断试剂用于基于链霉亲合素的测试或免疫测定法，其中将100BS链霉亲合素添加到所述也含有亚生理生物素浓度以获得稳定性的测定缓冲液。如果有任何生物素从所述链霉亲合素阻断剂解离，它将被添加到所述测定缓冲液的生物素代替，并且随后从该测定缓冲液添加到所述样品或测试反应的生物素的量将是最低的，并在生理生物素浓度范围之内。
IVD公司在它们的包装说明书(PI)或使用说明书(IFU)中为每个易受生物素干扰影响的测定法测试并提供了测试特异性生物素干扰阈值[9、14-15]。生物素干扰阈值<51ng/mL的测试，例如阈值为2.4ng/mL的Ortho Clinical Diagnostics Vitros心脏TnI测试，被认为是高风险测试或易受影响的免疫测量和竞争性方法[9]。尽管可以向100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子储存溶液添加生物素以提高稳定性并确保随时间100％饱和，但最终游离生物素浓度必须低于测试特异性生物素干扰阈值，以减轻添加到储存溶液的生物素的测试干扰。在一个实施方式中，将100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子储存在生物素浓度在生理范围之内或<1,100pg/mL的生物素溶液中，使得它在测试中不会干扰。在另一个实施方式中，将100BS链霉亲合素珠子储存在含有>1,100pg/mL生物素例如2、5、10、20、30、50、100、250或500ng/mL生物素的生物素溶液中。随后将所述100BS链霉亲合素珠子通过过滤、离心或磁性或其组合与样品分离，以在将样品添加到100BS链霉亲合素珠子之前从所述100BS链霉亲合素珠子除去生物素储存溶液。在100BS链霉亲合素珠子即将使用之前除去所述生物素储存溶液，将游离生物素浓度降低到低于1,100pg/mL、低于500pg/mL或优选地低于100pg/mL，并确保游离生物素浓度低于所述测试的生物素干扰阈值。
100BS链霉亲合素和100BS链霉亲合素珠子的伯胺(R-NH2)，可以使用胺反应性生物素标记试剂例如NHS-生物素、NHS-LC-生物素、NHS-LC-LC-生物素、NHS-chromalink-生物素、NHS-PEO4-生物素和NHS-(PEO)n-生物素、TFP-(PEO)n-生物素(胺反应性手段)共价偶联到生物素，并通过以摩尔过量的游离生物素进行生物素偶联以减少生物素标记试剂被链霉亲合素的生物素结合位点的结合和捕获。在一个实施方式中，将链霉亲合素共价偶联到微粒结合表面，所述微粒结合表面经过调制(阻断和剥离)使得仅保留共价附连的链霉亲合素，将所述链霉亲合素偶联的微粒结合表面暴露于摩尔过量的游离生物素(D-生物素)以制备100BS链霉亲合素珠子，将摩尔过量的游离生物素添加到所述100BS链霉亲合素珠子储存溶液例如PBS pH 7.4，并将所述100BS链霉亲合素的伯胺偶联到NHS-PEO4-生物素以制备生物素化的100BS链霉亲合素珠子。链霉亲合素偶联的珠子的生物素化是指生物素与磁性粒子(或其上的链霉亲合素)的共价偶联，并且不应与链霉亲合素的生物素结合位点的饱和混淆或等同。生物素化的链霉亲合素珠可以结合抗生物素物质(除了抗链霉亲合素物质之外)。用于饱和链霉亲合素的生物素通常不结合最成问题的抗生物素物质，因为所述生物素分子的必需部分与链霉亲合素接合。在另一个实施方式中，100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子具有通过链霉亲合素伯胺(R-NH2)使用本领域中已知的标准硫醇化化学物质的硫醇化而引入到链霉亲合素上的硫醇基团(巯基或R-SH)，所述标准硫醇化化学物质例如反-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺基酯(SPDP)、SPDP-PEG(4、6、8、12、24或36)-NHS酯、SPDP NHS酯、SPDP-C6-NHS酯、SPDP-C6-Sulfo-NHS酯、PC SPDP-NHS碳酸酯和SPDP-C6-Gly-Leu-NHS酯(硫醇化手段)。如果使用SPDP，则使用TCEP和EDTA切割偶联到链霉亲合素的SPDP，并将所述SPDP离去基团清洗、脱盐或透析掉，只留下SH-R偶联的100BS链霉亲合素。在用摩尔过量的生物素制备100BS硫醇化链霉亲合素后，可以使用硫醇反应性或巯基反应性生物素标记试剂例如马来酰亚胺-PEO(2、3、6或11)-生物素和生物素-SPDP(硫醇或巯基反应性手段)将100BS链霉亲合素和100BS链霉亲合素珠子的硫醇(R-SH)共价偶联到生物素。所述巯基反应性生物素标记在含有EDTA(至多2mM)、TCEP(<1mM)和摩尔过量的游离生物素的PBS pH 6.8缓冲液中进行，以1)还原硫醇并减少二硫键或桥接，并且2)减少所述生物素标记试剂被链霉亲合素的生物素结合位点的结合和捕获。由于在pH 6.5至7.5下马来酰亚胺基团对游离巯基的反应性比胺高1000倍，并且在pH>8.5下马来酰亚胺基团偏好于伯胺，因此马来酰亚胺偶联在pH 6.8下进行，以最小化对伯胺的反应。作为SPDP的替代，可以使用基于N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)的类似试剂。
在另一个实施方式中，100BS链霉亲合素或100BS链霉亲合素珠子具有使用本领域中已知的标准的酯-马来酰亚胺异双功能交联化学例如4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸马来酰亚胺基酯(SMCC)、马来酰亚胺-PEG-NHS酯、马来酰亚胺-PEO(1、2、3、4、5、6、8或12)-NHS酯或马来酰亚胺-PEG(1、2、3、4、5或6)-PFP(马来酰亚胺化手段)引入到链霉亲合素伯胺(R-NH2)上的马来酰亚胺基团。在使用摩尔过量的D-生物素制备100BS马来酰亚胺链霉亲合素后，可以使用马来酰亚胺反应性生物素标记试剂例如生物素-PEG-SH或生物素-PEG-硫醇将100BS链霉亲合素和100BS链霉亲合素珠子的马来酰亚胺共价偶联到生物素，其中所述PEGn或PEOn可以具有不同长度，例如n＝1、2、3、4、5、6、8或12。所述马来酰亚胺反应性生物素标记在含有EDTA(至多2mM)、TCEP(<1mM)和摩尔过量的游离生物素的PBS pH 6.8缓冲液中进行，以1)还原硫醇并减少所述生物素标记试剂的二硫键或桥接，并且2)减少所述生物素标记试剂被链霉亲合素的生物素结合位点的结合和捕获。由于在pH 6.5至7.5下马来酰亚胺基团对游离巯基的反应性比胺高1000倍，并且在pH>8.5下马来酰亚胺基团偏好于伯胺，因此马来酰亚胺生物素偶联在pH 6.8下进行。
类似的酯、硫醇或马来酰亚胺化学也适用于其中链霉亲合素未被生物素饱和的实施方式。例如，可以将钌酯与链霉亲合素的伯胺反应。
在特定实施方式中，1)将链霉亲合素共价偶联到微粒结合表面，2)对所述微粒结合表面进行调制，使得在所述微粒结合表面上仅保留共价附连的链霉亲合素，并且所述表面具有非常低的非特异性结合，3)将所述链霉亲合素偶联的微粒结合表面暴露于摩尔过量的游离生物素(D-生物素)，以制备100BS链霉亲合素珠子，4)在摩尔过量的游离生物素存在下，使用生物素标记试剂将100BS链霉亲合素珠子共价偶联到生物素，5)将生物素化的100BS链霉亲合素珠子过滤、离心或磁性分离，以除去缓冲液和过量的生物素，6)将所述生物素化的100BS链霉亲合素珠子用多轮50℃的水清洗并重悬浮在储存溶液中，以得到成品试剂。
在特定实施方式中，1)将生物素化的100BS链霉亲合素珠子过滤、离心或磁性分离，以除去储存溶液，2)将含有抗链霉亲合素干扰物、抗生物素干扰物或两种干扰物的样品添加到所述生物素化的100BS链霉亲合素珠子，以预处理所述样品，7)将样品干扰贫化或降低到低于测定阻断阈值(ABT)或测试干扰阈值，8)将所述生物素化的100BS链霉亲合素珠子过滤、离心或与所述样品磁性分离，并且9)吸出基本上不含珠子的样品上清液并通过所述诊断测试进行测试，以报告准确的测试结果。
在特定实施方式中，在诊断测试之前，将100BS链霉亲合素珠子用于预处理样品，以结合抗链霉亲合素干扰物并将所述抗链霉亲合素干扰物贫化至低于测定阻断阈值(ABT)或低于测试干扰阈值。在另一个实施方式中，在诊断测试之前，将生物素化的100BS链霉亲合素珠子用于预处理样品，以结合抗生物素干扰物并将所述抗生物素干扰物贫化至低于测定阻断阈值(ABT)或低于测试干扰阈值。在另一个实施方式中，在诊断测试之前，将生物素化的100BS链霉亲合素珠子用于预处理样品，以从同一样品同时结合抗链霉亲合素和抗生物素干扰物两者，并将两种干扰物贫化至低于测定阻断阈值(ABT)或测试干扰阈值。
目前不存在可用于检测、表征和减少患者样品中的生物素、抗生物素和抗链霉亲合素干扰物的快速且易于使用的产品解决方案。在特定实施方式中，链霉亲合素珠子(珠子1)、100BS链霉亲合素珠子(珠子2)和生物素化的100BS链霉亲合素珠子(珠子3)可以系统性地或顺序地用于检测和确定样品中存在哪种或哪些干扰机制。将怀疑具有干扰的样品纯净地(不添加珠子)测试，并作为对照结果。将样品的三个不同等分试样分别用珠子1(等分试样1)、珠子2(等分试样2)和珠子3(等分试样3)处理。将所述三个预处理过的等分试样重新测试，并将每个珠子类型的测试结果与对照测试结果进行比较(表1)。如果对照的测试结果与来自于珠子1、2和3预处理的测试结果相近，则样品干扰不太可能，可以被排除。然而，如果珠子1预处理结果与对照结果显著不同，则生物素干扰和/或抗链霉亲合素物质干扰是可能的，并且样品干扰可以被计入。如果珠子2预处理结果与对照结果显著不同，则抗链霉亲合素物质干扰是可能的，并且样品干扰可以被计入。如果珠子3预处理结果与对照结果显著不同，则抗链霉亲合素物质干扰和/或抗生物素物质干扰是可能的，并且样品干扰可以被计入。如果珠子1预处理结果与对照结果显著不同，但珠子2和珠子3预处理结果与对照相近，则生物素干扰可以被计入。如果珠子1和珠子2预处理结果与对照结果相近，但珠子3结果与对照结果显著不同，则抗生物素物质干扰可以被计入。如果珠子1、珠子2和珠子3预处理结果均与对照结果显著不同，则抗链霉亲合素物质干扰可以被计入。
表1.
通过使用3种不同的样品预处理试剂珠子1、珠子2和珠子3并将结果与对照进行比较得到的可能结果；相近(-)和不同(+)。珠子1+、珠子2-并且珠子3+是不大可能的，因为抗生物素干扰物将结合游离生物素，除非它只识别偶联的生物素。珠子1-、珠子2+并且珠子3-是不可能的，因为抗链霉亲合素干扰物将被珠子1和珠子2两者贫化。正如在结果4中所示，如果偶联的生物素空间阻断或干扰抗链霉亲合素抗体或蛋白质结合，则珠子3可能不贫化抗链霉亲合素干扰物(-)。
产生游离的(或可溶的)生物素饱和的链霉亲合素(淬灭的链霉亲合素；QSAv)非常类似于产生生物素饱和的链霉亲合素偶联的珠子。此外，可以将链霉亲合素偶联到另外的部分，以充当捕获部分或阻断可以促进链霉亲合素聚集的位点。这样的偶联可以在淬灭之前或之后进行(除非所述另外的捕获部分是生物素，在这种情况下它只能在淬灭后进行)。使用比在珠子的最低饱和程序中使用的5:1的比例略微更高的约为7至8的生物素与链霉亲合素的摩尔比。这些因为所述珠子偶联的链霉亲合素上的某些生物素结合位点将被空间阻碍，使得有效比率略微高于正式比率。
所述QSAv优选地主要是单体。在各种不同实施方式中，所述QSAv至少为80、90、95、97、98、99％单体，或由这些值限定的任何范围。为了确保所述试剂是并且仍然是单体且不形成聚集体，可以将链霉亲合素用去污剂或聚合物阻断试剂阻断。阻断可以包括PEG化。存在大量种类的具有各种不同尺寸和化学修饰的可商购PEG化试剂，例如来自于ThermoFisher Scientific、Broadpharm、Quanta Biodesign和Creative Pegworks。一个实例是NHS-酯-PEG(4)-OH。其他实例包括TFP-(PEO)n-OH或TFP-(PEG)n-OH(QuantaBiodesign)。它们可以通过NHS-酯化学共价附连到链霉亲合素上的任何暴露的赖氨酸残基。或者，可以通过EDC化学将TFP-(PEG)n-COOH或NHS-(PEG)n-COOH附连到赖氨酸残基。许多其他替选方案对于本领域技术人员来说是熟悉的。单体QSAv的制备也可以通过在含有亲液试剂例如脲、咪唑、海藻糖等的缓冲液中进行生物素淬灭来实现。
具体实施方式
下面的非限制性实施例仅仅出于说明目的而提供，以便于更完整地理解目前设想的代表性实施方式。这些实施例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方式。
实施例1
制备生物素化的链霉亲合素包被的磁性纳米粒子或生物素化的100BS链霉亲合素
珠子的方法
使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)化学将550-600nm的磁性羧酸纳米粒子共价偶联到链霉亲合素，将珠子表面用剥离试剂(盐、去污剂、低和高pH)调制以除去被动吸附的链霉亲合素，并使用去污剂和聚合物阻断试剂阻断所述珠子，以减少非特异性结合并促进纳米粒子单分散和胶体稳定性。使用改良的微量BCA总蛋白测定法确定的共价偶联到珠子的链霉亲合素的总浓度为17.69微克每毫克(μg/mg)。最终的珠子浓度通过重量法测定，并在含有2mM EDTA的pH 6.8的PBS中调整到每毫升10.0毫克珠子(mg/mL)。
如下所述制备D-生物素(Sigma，零件号B4601-100MG，批号SLBS8478，MW 244.31)在pH 7.4的PBS中的10.0mg/mL储用溶液：制备D-生物素在DMSO(Baker，零件号9224-01，批号0000217025)中的100mg/mL浓储用溶液，或将10mg D-生物素添加到100μLDMSO并混合。在D-生物素完全并均匀溶解在DMSO中后，添加900μL pH 7.4的PBS并混合，以制备1.0mL 90:10(PBS:DMSO)的10.0mg/mL D-生物素储用溶液。
将总共2.5mL链霉亲合素磁性纳米粒子分成等分试样并分配到反应管中，其对应于总共442.25μg链霉亲合素：[(25mg珠子)x(17.69μg链霉亲合素/mg珠子)]。总共442.25μg链霉亲合素对应于0.00804μM链霉亲合素：[(442.25μg链霉亲合素)/(55,000μg链霉亲合素/μM链霉亲合素)]。
制备与链霉亲合素的总摩尔数相比1000倍摩尔过量的D-生物素：将1,964.475μgD-生物素添加到25mg含量为17.69μg链霉亲合素/mg珠子的链霉亲合素偶联的磁性粒子或添加到442.25μg链霉亲合素：[(0.00804μMx1000)x(244.31μg生物素/μM)]。为了向0.00804μmol链霉亲合素添加1000倍摩尔过量的D-生物素，将200μL的10.0mg/mL D-生物素储用溶液或2,000μg D-生物素添加到含有2mM EDTA的pH6.8的PBS中的25mg含量为17.69μg链霉亲合素/mg珠子的链霉亲合素磁性纳米粒子。将链霉亲合素磁性纳米粒子与D-生物素在室温混合温育1小时，以用生物素饱和100％的链霉亲合素生物素结合位点并制备100BS链霉亲合素珠子。
为了在摩尔过量的D-生物素中将100BS链霉亲合素珠子共价偶联到生物素，将100倍摩尔过量的NHS-PEG4-生物素(Broadpharm，零件号20566，批号B93-039，MW 588.7)或500μg NHS-PEG4-生物素添加到25mg含量为17.69μg链霉亲合素/mg珠子的链霉亲合素偶联的磁性粒子或442.25μg链霉亲合素或0.00804μM链霉亲合素。向100μLDMSO添加5mg NHS-PEG4-生物素并混合，以制备NHS-PEG4-生物素在DMSO中的50.0mg/mL储用溶液。如下将100倍摩尔过量的NHS-PEG4-生物素或473.315μg NHS-PEG4-生物素[(0.804μMNHS-PEG4-生物素)x100)x(588.7μg生物素/μM)]添加到100BS链霉亲合素珠子：将10.0μL NHS-PEG4-生物素在DMSO中的50.0mg/mL储用溶液添加到从饱和步骤获得的具有1000倍摩尔过量的D-生物素的在含有2mM EDTA的pH 6.8的PBS中的25mg含量为17.69μg链霉亲合素/mg珠子的100BS链霉亲合素珠子，并在室温混合1小时。将所述生物素化的100BS链霉亲合素珠子用pH 7.4的PBS清洗4次，以洗掉过量的NHS-PEG4-生物素。
为了验证100BS链霉亲合素珠子被成功偶联到生物素并且没有由不同珠子上的偶联生物素的链霉亲合素介导的结合(即珠子的交联)引起的任何珠子聚集，使用Anton PaarLitesizer 500分析仪通过粒度测量对所述生物素化的100BS链霉亲合素珠子进行分析。平均尺寸分布为883.9nm(图1)。
为了证实生物素被成功偶联到100BS链霉亲合素珠子上的链霉亲合素，将有限量的天然链霉亲合素添加到生物素化的100BS链霉亲合素珠子，以促进由链霉亲合素介导的珠子交联引起的珠子聚集。将总共50μg链霉亲合素添加到25mg生物素化的100BS链霉亲合素珠子，并在室温温育4小时。在链霉亲合素添加后30分钟珠子表现出聚集，峰位于1,441.3nm和6,641nm并且多分散指数为173.3％(图2A)，峰位于1,512.6nm和14,536nm并且多分散指数为242.8％(图2B)。
使用以与链霉亲合素相似的亲和性识别偶联的生物素，但以比链霉亲合素低百万倍的亲和性识别游离生物素的抗生物素偶联物单克隆抗体，或特异性结合生物素偶联物的生物素并对生物素偶联物的生物素具有比对游离生物素更高的亲和性的抗体(WO2020/028776；VeraBind BiotinTM,Veravas)，进行了类似的珠子聚集。将所述抗体添加到生物素化的100BS链霉亲合素珠子并在室温温育过夜。所述珠子表现出聚集，峰位于2,148nm，多分散指数为316.2％(图3)。
实施例2
使用生物素化的链霉亲合素包被的磁性纳米粒子或生物素化的100BS链霉亲合素
珠子从样品贫化抗生物素抗体的方法
为了证实100％生物素饱和的链霉亲合素偶联的磁性纳米粒子或100BS链霉亲合素珠子的成功生物素化，使用Melon凝胶纯化试剂盒(ThermoFisher，零件号45214)和腹水调制缓冲液(ThermoFisher，零件号45219，批号TB263120)纯化冷冻干燥的含有对偶联的生物素具有特异性的单克隆抗生物素抗体的小鼠腹水，并使用Zeba Spin脱盐柱40K MWCO(ThermoFisher，零件号87770)在pH 7.2的PBS中脱盐。抗生物素抗体的终浓度为0.205mg/mL，并将50μL抗生物素抗体或10.25μg抗生物素抗体添加到玻璃HPLV管中的950μL pH 7.4的PBS，以制备10.25μg/mL抗生物素抗体储用溶液。将100μL、50μL、25μL和10μL所述抗生物素抗体储用溶液顺序进样到Phenomenex s4000SEC HPLC柱上，流速为1.0mL/min，流动相为pH 7.4的PBS，并确定每个进样的抗体浓度的峰面积，以产生峰面积(Y-轴)相对于抗体浓度(X-轴)的校准曲线：y＝6.6466x+21.4286，R2＝1.0000(图4A)。
接下来，通过下述步骤将750μL 0.205mg/mL的抗生物素抗体用生物素化的100BS链霉亲合素珠子预处理：
1.从储存处取出生物素化的100BS链霉亲合素珠子试剂管，并以中速涡旋振荡至少10秒。
2.将空的2mL Sarstedt Micro管置于VeraMag 400TM磁性分离器中，直至管的颈部接触磁铁框架。
3.将750μL或含量为10.0mg/mL的7.5mg珠子的充分混合的试剂分配到2mLSarstedt Micro管中。
4.等待至少30秒，小心地吸出并舍弃所有上清液而不扰动磁性纳米粒子沉积物。
5.分配750μL充分混合的含量为0.205mg/mL的抗生物素抗体。
6.盖上管盖，并将样品以中速涡旋振荡至少10秒。
7.将管放置在以中速运行的旋转混合器上，并在RT温育30分钟。
8.拧开螺旋盖，并将管放置在VeraMag 400中，直至管的颈部接触磁铁框架。
9.允许纳米粒子与样品磁性分离5分钟。
10.小心地吸出样品而不扰动磁性纳米粒子沉积物，并分配到干净的管中。如果这个步骤小心地进行，可以吸出所有样品。注：如果意外吸出任何磁性纳米粒子，则简单地将混合物放回管中，盖上管盖并回到步骤9。
11.调制过的样品现在准备好用于分析。
12.使用0.2微米醋酸纤维素注射式滤器过滤样品。使用该滤器的平均蛋白质损失为16.5μg。
13.将100μL样品进样到Phenomenex s4000 SEC HPLC柱上，流速为1.0mL/min，流动相为(50mM磷酸钾，250mM氯化钾，pH 6.8)，并确定保留时间为～9.6至9.9分钟处的峰面积。
14.在校准曲线方程的基础上，使用抗体峰的峰面积(y)解出x(μg/mL抗体)。
100μL抗生物素Ab样品的峰面积为1,384(图4B)，并且该峰面积在校准曲线上对应的浓度为205μg/mL(图4A)。100μL预处理且贫化过的抗生物素抗体样品的峰面积为318(图4C)，并且该峰面积在校准曲线上对应的浓度为44.62μg/mL(图4A)。由于用贫化试剂预处理的抗体的起始体积是750μL，这对应于33.465μg抗体：[44.62μg/mLx0.750mL]。由于在0.2微米醋酸纤维素注射式滤器上损失16.5μg抗体，因此在样品预处理后总的剩余抗体为49.965μg抗体：[33.465μg+16.5μg]。预处理的抗生物素抗体的起始量为153.75μg抗体：[205μg/mLx0.750mL]。被生物素化的100BS链霉亲合素珠子捕获并贫化的抗生物素抗体的％为67.5％：[((153.75μg-49.965μg)/153.75μg)x100％]。
本研究证实了生物素化的100BS链霉亲合素珠子能够贫化103.785μg抗体：(153.75μg-49.965μg)。这对应于每mg生物素化的100BS链霉亲合素珠子13.838μg抗生物素抗体的结合能力：[(103.785μg抗体)/(7.5mg珠子)]。
实施例3
使用低摩尔过量的生物素制备生物素化的100BS链霉亲合素珠子
使用1000倍摩尔过量的游离生物素对链霉亲合素包被的珠子进行生物素饱和可以导致生物素与链霉亲合素或珠子的非特异性结合。在使用中，尽管成功地贫化了抗生物素物质和抗链霉亲合素物质，但所述非特异性结合的生物素可以从100BS链霉亲合素珠子上浸出或解离，并可能在测定中引起生物素干扰。调查了几种移除或减少这种非特异性生物素结合的方法，包括在偶联到磁性纳米粒子之前饱和所述链霉亲合素，饱和后的各种不同清洗程序；使用较低摩尔过量的生物素；和各种不同的生物素-连接物摩尔过量。最终，低摩尔过量的生物素和特定清洗条件的组合产生了没有游离生物素浸出问题的产品。
在将链霉亲合素偶联到磁性纳米粒子之后但在生物素化之前，将链霉亲合素珠子暴露于5倍摩尔过量的游离生物素(也就是说5:1的生物素:链霉亲合素摩尔比或5:4的生物素:生物素结合位点比例)。然后将饱和的珠子用水在50℃下并用超声清洗。(生物素与生物素结合位点的有效比例略微更高，因为链霉亲合素与珠子的偶联导致某些生物素结合位点的空间位阻)。
生物素化使用4、25和50倍摩尔过量的生物素化试剂(生物素-PEG4-NHS连接物)来进行。发现50倍摩尔过量给出最佳结果。
按照下述方案测试完成的珠子的中性，以证实所述珠子本身在用于预处理血清样品时不引起干扰：
1.从储存处取出生物素化的100BS链霉亲合素珠子试剂管，并以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并重悬浮所述试剂。
2.将试剂管插入到泡沫管架中。
3.将空的2ml Micro管(SARSTEDT货号72.694)插入到VeraMagTM磁铁(Veravas)中，直至管的颈部接触磁铁框架。
4.将200μL充分混合的试剂(珠子)分配到空管中，在磁铁上分离所述试剂>30秒，以形成试剂沉积物。
5.小心地吸出并舍弃所有储存缓冲液上清液(～200μL)而不扰动试剂沉积物。
6.将400μL充分混合的血清或血浆样品分配到含有试剂沉积物的管中。
7.拧紧管上的螺旋盖，将管从磁铁取下，以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并将试剂重悬浮在样品中。
8.将管放置在以中速运行的实验室混合器上，并在室温温育10分钟。
9.拧开并除去螺旋盖，将管插入到磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
10.将试剂磁性分离>4分钟，以形成试剂沉积物。
11.小心地吸出样品上清液而不扰动试剂沉积物，并将样品分配到用于测试的转移管中。注：如果这个步骤小心地进行，可以吸出所有的样品上清液(～400μL)。如果意外吸出任何试剂，则简单地将样品/试剂混合物放回到管中并返回到步骤10。
12.样品现在准备好用于测试。
然后将预处理过的样品用于作为夹心免疫测定法的实例的Roche Elecsys TSH测定和作为竞争免疫测定法的实例的Roche Elecsys FT4测定(参见表2)。对于通过两种测定法测试的所有样品来说，处理相比于未处理的结果没有显著的分析或临床差异。
表2
实施例4
验证批次的制备
使用不同来源的链霉亲合素，基本上如实施例3中所述制备了三个批次的珠子，即使用5:1的生物素与链霉亲合素的摩尔比进行饱和，50倍摩尔过量的生物素-PEG4-NHS连接物和50℃超声清洗。一个批次FSAv使用新鲜的链霉亲合素；一个批次RSAv使用从以前的珠子包被反应回收的链霉亲合素；一个批次MSAv使用80％回收的链霉亲合素和20％新鲜链霉亲合素的混合物。三个批次的链霉亲合素含量对于FSAv批次来说是35μg/mg珠子，对于RSAv来说是30μg/mg珠子，对于MSAv来说是19μg/mg珠子。然后将所述三个批次用于在下文实施例5-8中描述的验证研究中。
链霉亲合素与磁性纳米粒子的偶联使用过量的链霉亲合素。未消耗的试剂不被丢弃，而是可以通过过滤、脱盐和浓缩进行回收。已发现，这种回收的链霉亲合素可以被掺入到有功能的产品中，对稳定性或性能没有影响。
实施例5
作为制造过程中的聚集的指标的粒度
作为最初的质量控制，对成品珠子进行尺寸分析以检查制造过程中的聚集。将5uL珠子与1mL diH2O在一次性比色皿中混合，并在简短涡旋振荡(5-10秒)、混合(在混合器上10分钟)和30-60秒超声处理(如果使用的话)后通过Anton Paar LitesizerTM100粒度分析仪读数。在超声处理之前或之后，三个批次均不显示出来自于生产的聚集(表3和4)。平均而言，聚集体的多分散性大于单体的多分散性。
表3.粒度分析-在制备中无超声处理
| <u>批次</u> | <u>流体力学直径</u> | <u>峰1</u> | <u>多分散指数</u> |
| MSAv | 2355 | 2314 | 23.10％ |
| FSAv | 1584.6 | 1025.8 | 142.80％ |
| RSAv | 1449 | 1106.9 | 18.80％5 |
表4.粒度分析-在制备中使用超声处理
| <u>批次</u> | <u>流体力学直径</u> | <u>峰1</u> | <u>多分散指数</u> |
| MSAv | 732 | 674.2 | 11.60％10 |
| FSAv | 703 | 631.5 | 4.30％ |
| RSAv | 713 | 683.4 | 25.70％ |
实施例6
生物素浸出的测试
为了测试生物素浸出的潜在问题水平，将生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子(生物素化的100BS链霉亲合素珠子)悬浮在生物素浓度低于100pg/ml的血清中。将400μL血清在RT下在混合器上用0.5mg珠子(200μL-2.5mg/mL)处理10分钟，按照下述方案磁性分离：
1.从储存处取出生物素化的100BS链霉亲合素珠子批次MSAv、FSAv或RSAv试剂管，以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并重悬浮所述试剂。
2.将试剂管插入到泡沫管架中。
3.将空的2ml Micro管(SARSTEDT货号72.694)插入到VeraMag磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
4.将200μL充分混合的试剂(珠子)分配到空管中，在磁铁上分离所述试剂>30秒，以形成试剂沉积物。
5.小心地吸出并舍弃所有储存缓冲液上清液(～200μL)而不扰动试剂沉积物。
6.将400μL充分混合的血清或血浆样品分配到含有试剂沉积物的管中。
7.拧紧管上的螺旋盖，将管从磁铁取下，以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并将试剂重悬浮在样品中。
8.将管放置在以中速运行的实验室混合器上，并在室温温育10分钟。
9.拧开并除去螺旋盖，将管插入到磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
10.将试剂磁性分离>4分钟，以形成试剂沉积物。
11.小心地吸出样品上清液而不扰动试剂沉积物，并将样品分配到用于测试的转移管中。注：如果这个步骤小心地进行，可以吸出所有的样品上清液(～400μL)。如果意外吸出任何试剂，则简单地将样品/试剂混合物放回到管中并返回到步骤10。
12.样品现在准备好用于测试。
将处理过的血清在IDK生物素ELISA测定法(Immundiagnostik AG)上进行测试。所述IDK生物素ELISA是竞争免疫测定法；样品中的生物素将降低生成的信号。通过与校准曲线进行比较来确定生物素浓度。使用三个测试批次中的每一者运行校准曲线。在所有情况下，生物素以低于1200pg/ml的水平被检测到，表明生物素从珠子的任何浸出在不会引起标准免疫测定法中的嗜异性干扰的水平下(表5)。
表5.处理过的血清中生物素的定量
实施例7
HPLC贫化测定法
将三个批次的生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子用于贫化测定法中，以评估它们特异性移除抗链霉亲合素和抗生物素干扰物但不移除其他干扰物的能力。为此目的，运行了一系列4个HPLC贫化研究：
1)使用亲和纯化的山羊IgG和与生物素偶联的亲和纯化的山羊IgG的HPLC贫化测定法，以便评估所述产品对仅仅抗SAv和抗Bt抗体的特异性。
2)使用抗链霉亲合素抗体的HPLC贫化测定法，以定量所述试剂的结合能力。
3)使用抗生物素抗体进行HPLC贫化测定法，以定量所述试剂的结合能力。
4)使用A)抗生物素抗体与抗链霉亲合素抗体和B)抗链霉亲合素抗体与亲和纯化的山羊IgG的混合物的HPLC贫化测定法，以证实所述试剂的多路复用能力和特异性。
确定了各种不同抗体(Ab)和抗体-生物素(Ab-Bt)偶联物在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的浓度。对于每种样品来说，将200μl生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子悬液(2.5mg/ml)在管中分成等分试样，磁性分离，并除去储存缓冲液。将400μl每种Ab或Ab-Bt偶联物添加到含有珠子的管中，涡旋振荡，并在混合器上温育10分钟。将所述珠子再次磁性分离，抽出处理过的样品的上清液并载样到用于HPLC管的微量管插板上，用于孔径排阻层析(SEC)分析。
用于预处理的详细方案如下：
1.从储存处取出生物素化的100BS链霉亲合素珠子批次MSAv、FSAv或RSAv试剂管，并以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并重悬浮所述试剂。
2.将试剂管插入到泡沫管架中。
3.将空的2ml Micro管(SARSTEDT货号72.694)插入到VeraMag磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
4.将200μL充分混合的试剂(珠子)分配到空管中，在磁铁上分离所述试剂>30秒，以形成试剂沉积物。
5.小心地吸出并舍弃所有储存缓冲液上清液(～200μL)而不扰动试剂沉积物。
6.将400μL充分混合的血清或血浆样品分配到含有试剂沉积物的管中。
7.拧紧管上的螺旋盖，将管从磁铁取下，以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并将试剂重悬浮在样品中。
8.将管放置在以中速运行的实验室混合器上，并在室温温育10分钟。
9.拧开并除去螺旋盖，将管插入到磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
10.将试剂磁性分离>4分钟，以形成试剂沉积物。
11.小心地吸出样品上清液而不扰动试剂沉积物，并将样品分配到用于测试的转移管中。注：如果这个步骤小心地进行，可以吸出所有的样品上清液(～400μL)。如果意外吸出任何试剂，则简单地将样品/试剂混合物放回到管中并返回到步骤10。
12.样品现在准备好用于测试。
未处理的抗体也在SEC上运行作为对照。SEC缓冲液是50mM磷酸钾，250mM氯化钾，pH 6.8，并以1ml/min的流速在G4000柱7.8mm x 30cm上泵送20分钟，使用5μg/100μl的进样量。监测在220nm和280nm处的吸光值，并将A280用于峰分析。结果示出在表6中。
将亲和纯化的山羊IgG作为对照运行以建立背景贫化，因为所述珠子打算对非特异性抗生物素或抗链霉亲合素的抗体中性。所有三个批次显示出对该对照的极少至没有结合(92.56％-96.78％的抗体在处理后仍存在；图5A描绘了使用MSAv批次的结果)。
将与生物素偶联的亲和纯化的山羊IgG作为另一个对照运行以建立背景贫化，因为所述珠子同样打算对非特异性抗生物素或抗链霉亲合素的抗体中性，即使被生物素化。所有三个批次显示出对该对照的极少至没有结合(98.91％-100％的抗体在处理后仍存在；图5B描绘了使用MSAv批次的结果)。
所有三个批次均显示出每mg珠子大于10μg的抗生物素抗体贫化(12、34.4和21μg/mg贫化；参见表6；图5C描绘了使用MSAv批次的结果)。所有三个批次均显示出每mg珠子大于20μg的抗SAv抗体贫化(31、33.5和27.6μg/mg贫化；参见表6；示例性曲线示出在图5D中，其描绘了使用MSAv批次的结果)。
使用MSAv批次的珠子测试了抗链霉亲合素抗体和抗生物素抗体的混合物，以证实生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子的多路复用能力。也测试了抗链霉亲合素抗体和AP山羊IgG抗体的混合物，以证实所述试剂的结合特异性。数据表明，生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子贫化抗链霉亲合素和抗生物素抗体两者(当它们串联存在时)(存在的23.4μg中贫化掉19.1μg)，并且所述产品仅仅特异性除去抗链霉亲合素抗体(当它与AP山羊IgG混合时)(存在的23.8μg中贫化掉10.9μg)。由于以前的数据显示出对单独的AP山羊IgG没有结合(97％的Ab在处理后仍然存在)，因此可以安全地推断贫化大约一半的混合物(46％)说明只有抗链霉亲合素Ab被贫化。
实施例8
处理对分析物检测的影响
在用于血清甲状旁腺激素的可商购测定中测试了生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子(生物素化的100BS链霉亲合素珠子)的中性。DRG PTH Intact ELISA(DRGInternational,Inc.，零件号EIA3645)是一种夹心ELISA测定法，其使用识别所述激素的不同部分的两种不同的山羊抗PTH多克隆抗体。一种抗体被生物素化并充当捕获试剂，另一种抗体被偶联到辣根过氧化物酶并充当检测试剂。
按照下述方案将两种血清样品(QC1和QC3)各400μl用0.5mg珠子(200ul，2.5mg/mL)在RT下在混合器上处理10分钟，磁性分离：
1.从储存处取出生物素化的100BS链霉亲合素珠子批次SAv、FSAv或RSAv试剂管，并以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并重悬浮所述试剂。
2.将试剂管插入到泡沫管架中。
3.将空的2ml Micro管(SARSTEDT货号72.694)插入到VeraMag磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
4.将200μL充分混合的试剂(珠子)分配到空管中，在磁铁上分离所述试剂>30秒，以形成试剂沉积物。
5.小心地吸出并舍弃所有储存缓冲液上清液(～200μL)而不扰动试剂沉积物。
6.将400μL充分混合的血清或血浆样品分配到含有试剂沉积物的管中。
7.拧紧管上的螺旋盖，将管从磁铁取下，以中速涡旋振荡至少10秒，以充分混合并将试剂重悬浮在样品中。
8.将管放置在以中速运行的实验室混合器上，并在室温温育10分钟。
9.拧开并除去螺旋盖，将管插入到磁铁中，直至管的颈部接触磁铁框架。
10.将试剂磁性分离>4分钟，以形成试剂沉积物。
11.小心地吸出样品上清液而不扰动试剂沉积物，并将样品分配到用于测试的转移管中。注：如果这个步骤小心地进行，可以吸出所有的样品上清液(～400μL)。如果意外吸出任何试剂，则简单地将样品/试剂混合物放回到管中并返回到步骤10。
12.样品现在准备好用于测试。
然后将处理过的血清在DRG PTH ELISA测定法上进行测试。QC1是自制QC样品，具有少于100pg/mL的生物素(其不影响PTH测定机制)和大约190pg/mL PTH。QC3是自制的QC样品，具有约250,000pg生物素/mL(其将影响PTH测定机制-测定产生被严重降低的结果)和大约190pg/mL PTH。用不同批次中的每一者处理的QC1血清在PTH结果中没有显著出显著偏差(100.6、101.2和106.1％检测)，并且QC3样品正如预期全都产生被严重降低的结果，因为100BS链霉亲合素珠子将不结合游离生物素(表7)。这些数据证实了100BS链霉亲合素珠子珠子的中性。
表7.PTH ELISA的中性数据
| 样品 | 平均A450 | 剂量pg/mL | 样品/未处理的纯净物 |
| QC1未处理的 | 0.9395 | 173.2 | 基线 |
| QC1 v MSAv | 0.9445 | 174.3 | 100.6％ |
| QC1 v FSAv | 0.9495 | 175.4 | 101.2％ |
| QC1 v RSAv | 0.989 | 183.8 | 106.1％ |
| QC3未处理的 | 0.299 | 21.7 | 12.5％ |
| QC3 v MSAv | 0.2895 | 19.4 | 11.2％ |
| QC3 v FSAv | 0.297 | 21.2 | 12.2％ |
| QC3 v RSAv | 0.3095 | 24.1 | 13.9％ |
在处理含有抗链霉亲合素抗体和抗生物素抗体干扰物的样品后确定了分析物检测。这通过在血清QC1中掺入亲和纯化的抗链霉亲合素和抗生物素山羊抗体，并比较来自于处理和未处理的样品的分析物检测结果来实现。
将每种血清样品(QC1和掺入抗生物素抗体至16.5μg/mL的QC1)的400μl等分试样用不同量的来自于所有三个批次的珠子(100至400μl，2.5mg/mL)在RT下在混合器上处理10分钟，磁性分离，并将处理过的血清在DRG PTH ELISA测定法上测试。QC1是一种自制QC样品，具有少于100pg/mL的生物素(其不影响PTH测定机制)和大约190pg/mL PTH。掺入到QC1中的抗生物素抗体的浓度干扰PTH测定机制，导致严重降低的结果。
每200μl样品(具有16.5μg/mL的抗Bt Aby浓度)使用1mg珠子时，MSAv珠子能够成功地贫化所有抗Bt抗体(抗Bt Aby)并恢复正确的PTH结果。FSAv和RSAv能够使用远远更少的量实现相同的结果：对于FSAv来说0.25mg，对于RSAv来说0.375mg。掺有抗Bt Aby并且未用生物素化的100BS链霉亲合素珠子处理的QC1样品产生严重降低的结果，只有对照的2.7％，这与预期相符(表8和9)。MSAv批次的较低的结果与在实施例7(上文)中观察到的结果相一致。
表8.掺有抗生物素Ab并用来自于批次MSAv的珠子处理的血清中的分析物检测
表9.掺有抗Bt Aby并用来自于FSAv和RSAv批次的珠子处理的血清中的分析物检测
同样地，将每种血清样品(QC1和掺入抗链霉亲合素Aby(抗SAv Aby)至16.5μg/mL或抗SAv Aby/抗Bt Aby多重混合物至16.5μg/mL(各8.25μg/mL)的QC1)的200μl等分试样用100μl 2.5mg/mL的珠子在RT下在混合器上处理10分钟，磁性分离，并将处理过的血清在DRGPTH ELISA测定法上测试。正如以前提到的，QC1是一种自制QC样品，具有少于100pg/mL的生物素(其不影响PTH测定机制)和大约190pg/mL PTH。抗SAv Aby和抗Bt Aby干扰PTH测定机制，造成严重降低的结果。
在使用的浓度(16.5μg/mL)下，抗SAv Aby正如预期造成严重降低的结果(基线的29％)。多重混合物也是如此(基线的21％)。每200μl样品使用0.25mg珠子时，来自于批次RSAv的珠子能够成功地贫化抗SAv Aby并开始恢复PTH检测，产生高达基线值的82％的读数。将在处理中使用的珠子的量提高到每200μl该样品0.5mg，将所述值恢复到基线的104％。每200μl样品0.25mg珠子的来自于批次FSAv的珠子将PTH水平恢复到基线的91％。每200μl该样品0.375mg珠子的来自于批次MSAv的珠子将PTH值恢复到基线的92％。使用0.5mg珠子，所有批次均能成功地恢复正确的PTH结果(RSAv-104％；FSAv-101％；MSAv 100％)(表10)。
表10.掺有抗SAv Aby或抗SAvAby和抗BtAby并用来自于所有三个批次的珠子处理 的血清中的分析物检测
上述使用批次MSAv的PTH检测实验的结果概述呈现在图6中。当不使用干扰物时或当生物素是干扰物时，生物素化的100BS链霉亲合素珠子没有影响，但有效地除去单独的或混合在一起的抗生物素和抗链霉亲合素干扰物。
具体来说，在图6中标记为“无”的最左侧一组条中，未向干扰物掺杂样品添加干扰物，也就是说，它是基线样品的重新运行，并且检测到的PTH浓度仅相差-0.1％。用生物素饱和且偶联的链霉亲合素包被的珠子处理不含任何干扰物的基线样品(无)，与基线样品相差仅仅+1.3％，并且与重新运行的基线样品(无干扰掺杂物)相差仅仅+1.4％。这些结果完全在该PTH ELISA的精确度曲线内，并证实了试剂的中性，并且样品的处理不引入任何稀释或基质效应。生物素掺杂在该PTH ELISA测定法中引起显著干扰，并导致检测降低87％。当将生物素掺杂的样品用珠子处理时，结果没有显著改变并且仅相差-2.3％，也比基线结果低88％。这是符合预期的，因为生物素化的100BS链霉亲合素珠子不结合游离生物素，并且将不减轻这种干扰机制。抗Bt Aby掺杂在该PTH ELISA测定法中引起显著干扰，并导致检测降低97％。当抗Bt Aby掺杂物经过处理时，结果显著改变并相差+3,546％，但与基线结果仅相差-1.5％。这是符合预期的，因为生物素化的100BS链霉亲合素珠子被设计用于结合和贫化抗生物素干扰物，并报告与没有抗生物素干扰物的基线结果相近的准确结果。抗SAv Aby掺杂物也在该PTH ELISA测定法中引起显著干扰，并导致检测降低74％。当抗SAv Aby掺杂物经过处理时，结果显著改变并相差+253％，但与基线结果仅相差-8.2％。这是符合预期的，因为生物素化的100BS链霉亲合素珠子被设计用于结合和贫化抗链霉亲合素干扰物，并报告与没有抗SAv Aby干扰物的基线结果相近的准确结果。最后，抗SAv Aby和抗Bt Aby掺杂物的1:1混合物在该PTH ELISA测定法中引起显著干扰，并导致检测降低81％。当抗SAv Aby和抗Bt Aby掺杂物经过处理时，结果显著改变并相差+379％，但与基线结果仅相差-9.9％。这些结果仍在该PTH ELISA的精确度曲线内。这是符合预期的，因为生物素化的100BS链霉亲合素珠子被设计用于结合和贫化抗生物素和抗链霉亲合素干扰物两者，并报告与没有抗生物素和抗链霉亲合素干扰物的基线结果相近的准确结果。这些数据也证实了生物素化的100BS链霉亲合素珠子同时结合和贫化来自于同一样品的两种干扰机制的能力。
实施例9
可溶性链霉亲合素的生物素饱和
以大约200μg SAv/mL的浓度制备链霉亲合素(SAv)(或修饰的SAv或阻断的SAv)在pH 8.5的tris缓冲盐水(TBS)中的稀溶液。也以大约0.50–1.00μg生物素/mL的浓度制备生物素在TBS中的稀溶液。将两种溶液一起计量并以1体积SAv/TBS比9体积生物素/TBS的比例在线混合，例如泵送通过硅胶管(例如PN 96440-13(Cole Parmer))，在Y型连接器(例如Masterflex PN 30614-08(Cole Parmer))处交汇，并立即用在出口管中的在线混合器(例如在线混合器PN HT-40-3.18-12-PP(StaMixCo))混合(图7)。所述SAv溶液可以以2mL/min泵送，所述生物素溶液可以以18mL/min泵送，使用例如蠕动泵(例如Masterflex EZload207522-20型(Cole Parmer))。将所述含有生物素和链霉亲合素的溶液混合30至120分钟。
可以使用其他的生物素和SAv浓度、其他的缓冲体系和其他的泵速，但生物素浓度与SAv浓度之比和计量添加比例应该维持。对于SAv溶液中的每摩尔链霉亲合素来说，9体积的生物素溶液应该含有7.4摩尔生物素。注意这是比在用于珠子偶联的SAv的最低饱和程序中使用的略微更高的生物素与链霉亲合素比例。取链霉亲合素的分子量为52000，300mL的200μg/ml SAv溶液含有1.1538μmoles的链霉亲合素。取生物素的分子量为244.31，8.53072μmoles的生物素(对于7.4:1摩尔比来说)是2084μg生物素，使得在所述9体积中生物素浓度为772ng/mL。
为了除去未结合和非特异性结合的生物素，对生物素饱和的链霉亲合素进行渗滤和清洗。将热水浴装入纯水并加热至50℃。将第二热水浴装入10mM tris、50-150mM NaCl的缓冲液并加热至50℃。(或者，该缓冲液也可以含有0.01-1％w/v TWEEN 20或其他表面活性剂)。将含有生物素饱和的链霉亲合素的储液器置于第一热水浴中。使用中空纤维滤器例如截留分子量为10kD的MiniKros Sampler中空纤维滤器(Repligen；PN S04-E010-05-N；mPes；0.5mm)，将管路附连到在线流动端口(顶部和底部)和一个侧端口。将第二侧端口盖紧。侧端口管路将滤液导向废液容器。从储液器引出的管路通过蠕动泵前进到中空纤维滤器。从在线流动出口端口引出的管路将渗余液送回到储液器(图8)。当水浴和储液器达到50℃时，将蠕动泵打开，并向渗余液管路施用夹子以产生背压，使得过滤发生，减小生物素饱和的链霉亲合素溶液的体积并浓缩所述蛋白质。渗余液流速约为360ml/min，滤液流速约为95ml/min。当储液器达到其原始体积的约15％(或更小)时，将来自于第二水浴的缓冲液添加到储液器以恢复原始体积。(在即将恢复体积之前获取用于质量控制的样品)。将过滤和体积恢复重复总共至少5次；如果需要，可以添加额外的清洗循环。在最后一次恢复体积后，将渗余液浓缩至原始体积的约10％(如果需要，可以使用其他体积)。最终渗余液中的游离生物素应该低于1200pg/ml。将所述经过浓缩的生物素饱和的链霉亲合素通过0.2μm滤器过滤。
在存在溶解的链霉亲合素的情况下，游离生物素被认为是生物素淬灭过程完成的证据。然而，游离生物素本身可以造成干扰，因此在用于阻断链霉亲合素和其他干扰的阻断试剂中是不合乎需要的，并因此需要被除去。使用ELISA生物素测定法(Immundiagnostik，PN KR8141)测定每次清洗后的渗余液和最终渗余液(一式两份)的游离生物素含量，以获得表11中示出的结果。
表11.QSAv制备质量控制样品中游离生物素的定量(和校准)
最终渗余液含有少于700pg/mL的游离生物素，显著低于1200pg/mL的要求。最终渗余液具有201μg链霉亲合素/mL的浓度，因此它含有～3.16-3.33pg游离生物素/μg链霉亲合素。
可以添加另一个步骤以除去任何未完全淬灭的链霉亲合素。偶联到琼脂糖的2-亚氨基生物素(Sigma Aldrich PN I4507-5ML)可用于此目的。2-亚氨基生物素在碱性条件下与SAv可逆结合。在pH 10至11下结合最强。在酸性条件例如pH 4.0下，SAv将被释放。已经用生物素淬灭的SAv应该不结合。因此，淬灭的SAv从碱性2-亚氨基生物素-琼脂糖柱的穿流液应该仅含生物素淬灭的SAv。未被生物素淬灭的SAv应该附着到柱上。所述柱可以用pH 4的缓冲液再生，用于随后重新使用。
实施例10
用偶联有小鼠IgG的链霉亲合素珠子除去山羊抗小鼠抗体
将直径为500至600nm的磁性纳米粒子(珠子)用链霉亲合素包被。将两种亲和纯化的小鼠IgG制备物用NHS酯-Peg(4)-生物素共价生物素化。小鼠IgG#1是一种多克隆非特异性小鼠IgG。小鼠IgG#2是一种单克隆小鼠IgG。当将珠子暴露于所述生物素化的小鼠IgG时，大约30μg IgG附着到每mg珠子。珠子仅用多克隆小鼠IgG、仅用单克隆小鼠IgG和用两种小鼠IgG制备物的混合物制造。这些小鼠抗体充当它们将被暴露到的任何特异性亲和纯化或嗜异性的抗小鼠IgG抗体的捕获部分。然后将这些小鼠IgG偶联的链霉亲合素珠子用于清洁已掺有亲和纯化的山羊抗小鼠抗体(Lampire Biological Laboratories)的样品(在这种情况下是缓冲液)。然后通过HPLC孔径排阻层析分析所述样品的等分试样以获得IgG含量。
使用生物素化将捕获试剂锚定在链霉亲合素上的一个可能的顾虑，在于所述生物素的亲和性可能低于游离生物素的亲和性，使得在清洁程序过程中捕获试剂从链霉亲合素解离。为了检查这一点，正常地和在20μg/mL游离生物素(相比于链霉亲合素>200倍摩尔过量)存在下进行清洁程序。如果生物素化的IgG从链霉亲合素包被的珠子解离，它在过量游离生物素存在下将不能重新结合，因此使用所述珠子除去的山羊抗小鼠抗体的量将会减少。或者，如果生物素化的IgG的解离不以显著的程度发生，则在含有和不含游离生物素的样品之间山羊抗小鼠IgG的量将不会显著变化。
具体来说，将三种小鼠IgG偶联的链霉亲合素珠子(含有IgG#1、IgG#2和两者的混合物)中的每一者的一个等分试样与储存缓冲液(TBS)磁性分离，并与含有20μg/ml生物素的TBS混合。将山羊抗小鼠IgG在a)TBS和b)含有20μg/ml生物素的TBS中稀释到200μg/mL。将三种小鼠IgG偶联的链霉亲合素珠子中的每一者的两个等分试样(一个暴露于生物素，另一个未暴露)与它们的缓冲液磁性分离。每mL山羊抗小鼠IgG抗体使用2.5mg珠子，将TBS中的山羊抗小鼠IgG抗体添加到未暴露于生物素的珠子，并将含有20μg/ml生物素的TBS中的山羊抗小鼠IgG抗体添加到已暴露于生物素的珠子。将这些混合物涡旋振荡10秒以悬浮所述珠子并混合过夜。将得到的混合物进行珠子的磁性分离，然后通过HPLC-SEC，使用对应于山羊IgG的峰在280nm下的吸光值的曲线下面积来分析上清液样品。结果示出在表12中。
表12.山羊抗小鼠IgG抗体的去除
这些数据证实，小鼠IgG偶联的链霉亲合素珠子能够每mg珠子除去26.0-60.1μg抗小鼠抗体。这些数据还证实，生物素化的捕获试剂(小鼠IgG)的附连在清洁程序的条件下是稳定的，即使在大过量的游离生物素存在下。最后，这些数据证实，使用作为多克隆和单克隆抗体以及两者的混合物的捕获部分时，这些程序是有效的。
实施例11.使用偶联有小鼠IgG的链霉亲合素珠子除去生物素
也测试了上文在实施例10中描述的三种小鼠IgG偶联的链霉亲合素珠子制备物(多克隆小鼠IgG、单克隆小鼠IgG以及多克隆和单克隆小鼠IgG的混合物)从样品中除去游离生物素的能力。使用与上述基本上相同的方案，将0.75mg珠子与200μL QC3这种含有约250,000pg生物素/mL、50ng生物素的自制QC样品合并，温育10分钟，磁性分离5分钟，并收集样品上清液。将所述处理的样品在IDK生物素ELISA测定法上测试(Immundiagnostik AG；参见实施例6)。在这些条件下，所有三种珠子制备物均能从0.200mL 250ng生物素/mL的QC3(总共50ng生物素)除去至少49.7ng生物素，或66.3ng生物素/mg珠子，并将生物素浓度从250,000pg/mL降低到低于300pg/ml。
最后，应当理解，尽管本说明书的各个方面通过参考特定实施方式来突出显示，但本领域技术人员将会容易地认识到，这些公开的实施方式仅说明本文公开的主题内容的原理。因此，应当理解，所公开的主题内容绝不限于本文描述的特定方法、方案和/或试剂等。因此，可以根据本文的教导对所公开的主题内容做出各种不同的修改或改变或替代方案，而不背离本说明书的精神。最后，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。因此，本发明不限于完全如所示和所描述的那样。
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除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的所有表示特性、条目、数量、参数、性质、项目等的数字都应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。当在本文中使用时，术语“约”意味着如此限定的特性、条目、数量、参数、性质或项目包括在所陈述的特性、条目、数量、参数、性质或项目的值之上或之下正负10％的范围。因此，除非有相反的说明，否则在本说明书和权利要求书中提出的数值参数是可以变化的近似值。至少，并且不是试图将等效原理的应用限制在权利要求书的范围内，每个数字指示至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的宽泛范围的数值范围和数值是近似值，但在具体实施例中阐述的数值范围和数值尽可能准确地报道。然而，任何数值范围或值都固有地含有由它们相应的测试测量中存在的标准偏差必然地导致的某些误差。本文对数值范围的叙述仅意在用作单独地指称落入所述范围内的每个单独数值的速记方法。除非本文中另有说明，否则数值范围的每个单独的值都并入在本说明书中，如同它在本文中被单独地叙述。
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在下述权利要求书的上下文中)使用的术语“一个”、“所述”和类似的指称应该被解释为涵盖单数和复数两者。除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何适合的顺序执行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅仅旨在更好地阐明本发明，而不是对另外要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。
本文公开的具体实施方式可以在权利要求书中使用由……组成或基本上由……组成的语言进一步限制。当在权利要求书中使用时，无论是提交的还是修正的，过渡性术语“由……组成”不包括在权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡性术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤以及那些不实质影响基本和新颖特征的材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方式在本文中被固有或明确地描述和启用。
在本说明书中引用和指定的所有专利、专利出版物和其他出版物都单独并明确地整体通过引用并入本文，用于描述和公开例如在此类出版物中描述的可能与本发明相结合使用的组合物和方法。提供这些出版物仅是因为它们的公开先于本申请的提交日期。就此而言，任何内容都不应被解释为承认发明人无权因在先发明或任何其他原因而先于此类公开。关于这些文件的日期的所有陈述或关于这些文件的内容的描述均基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
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Claims (43)
1.一种减少来自于液体生物样品的干扰物的方法，所述方法包括：
a)将所述样品与包含链霉亲合素的粒子合并提供混合物；
b)将所述混合物混合以促进所述干扰物与所述链霉亲合素的结合；以及
c)从所述样品分离所述粒子；
从而除去所述干扰物或降低所述干扰物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述链霉亲合素上的生物素结合位点空置，以便除去或降低由抗链霉亲合素物质、生物素或两者造成的干扰。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述链霉亲合素上的生物素结合位点被生物素饱和，以便除去或降低由抗链霉亲合素物质造成的干扰。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述链霉亲合素被生物素化，以便除去或降低由抗链霉亲合素物质、抗生物素物质或两者造成的干扰。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将所述链霉亲合素与另外的非生物素捕获部分偶联，以便还除去或降低由结合所述捕获部分的物质造成的干扰。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述粒子是磁性的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中从所述样品分离所述粒子包括将所述混合物暴露于磁铁下并收集所述液体样品。
8.一种减少来自于液体生物样品的干扰物的方法，所述方法包括：
a)将所述样品与用生物素饱和的链霉亲合素(QSAv)合并提供混合物；
b)将所述混合物混合以促进所述干扰物与所述链霉亲合素的结合；
从而阻断抗链霉亲合素干扰物或降低所述抗链霉亲合素干扰物的量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述QSAv被生物素化，以便阻断或降低由抗链霉亲合素物质、抗生物素物质或两者造成的干扰。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述QSAv与另外的非生物素捕获部分偶联，以便还阻断或降低由结合所述捕获部分的物质造成的干扰。
11.根据权利要求4、5、9或10中任一项所述的方法，其中所述生物素化或偶联是共价的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物素化包括使用酯衍生化的生物素。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述酯衍生化的生物素选自NHS-生物素、NHS-LC-生物素、NHS-LC-LC-生物素、TFP-LC-生物素、NHS-chromalink-生物素、NHS-PEO4-生物素、TFP-(PEO)n-生物素和NHS-(PEO)n-生物素。
14.根据权利要求4、5、9或10中任一项所述的方法，其中所述生物素化或偶联由非共价结合到所述链霉亲合素上的生物素结合位点的生物素-连接物介导。
15.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述QSAv主要是单体的。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述QSAv或包含链霉亲合素的粒子已被阻断。
17.根据权利要求16所述的方法，其中包含链霉亲合素的QSAv或粒子已通过PEG化被阻断。
18.一种在诊断测定期间减少干扰物的方法，所述方法包括：
a)将液体生物样品与用生物素饱和的链霉亲合素合并提供混合物；
b)将所述混合物混合，以促进所述干扰物与所述链霉亲合素的结合；以及
c)进行所述诊断测定；
从而在所述诊断测定中阻断所述干扰物或降低所述干扰物的量。
19.一种在诊断测定期间减少干扰物的方法，所述方法包括：
a)将样品与包含链霉亲合素的粒子合并提供混合物；
b)将所述混合物混合，以促进所述干扰物与所述链霉亲合素的结合；
c)从所述样品分离所述粒子；以及
d)进行所述诊断测定；
从而除去所述干扰物或降低所述干扰物的量。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述合并、混合以及如果存在的分离步骤，发生在所述诊断测定的分析阶段之前。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述诊断测定是夹心免疫测定。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述诊断测定是竞争免疫测定。
23.根据权利要求5或10所述的方法，其中所述另外的捕获部分阻断、除去或减少另外的嗜异性干扰物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述另外的捕获部分是异种抗体，并且所述嗜异性干扰物是人抗动物抗体干扰物。
25.根据权利要求5或10所述的方法，其中所述另外的捕获部分阻断、除去或减少交叉反应性干扰物。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述另外的捕获部分是病毒抗原或其抗原性部分。
27.根据权利要求26所述的方法，其中病毒抗原或其抗原性部分包含来自于SARS-CoV-2之外的冠状病毒的冠状病毒表位。
28.通过一种方法制备的用生物素饱和的链霉亲合素(QSAv)，所述方法包括将链霉亲合素暴露于5:1至11:1摩尔过量的生物素下的步骤。
29.根据权利要求28所述的QSAv，其中所述摩尔过量是7:1至8:1。
30.根据权利要求28或29所述的QSAv，所述方法还包括热碱性缓冲液清洗以除去非特异性结合的生物素。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的QSAv，所述方法还包括阻断所述链霉亲合素以减轻聚集的步骤。
32.根据权利要求31所述的QSAv，其中阻断包括在热碱性缓冲液清洗中纳入表面活性剂。
33.根据权利要求31或32所述的QSAv，其中阻断包括用预备性阻断试剂进行共价修饰。
34.根据权利要求33所述的QSAv，其中阻断包括PEG化。
35.通过一种方法制备的用生物素饱和的且与链霉亲合素偶联的微粒(QSAv珠子)，该方法包括将链霉亲合素暴露于4:1至6:1摩尔过量的生物素下的步骤。
36.根据权利要求35所述的QSAv珠子，其还包括热水清洗以除去非特异性结合的生物素。
37.根据权利要求28-36中任一项所述的QSAv或QSAv珠子，所述方法还包括将另外的捕获部分偶联到所述QSAv或QSAv珠子。
38.一种与链霉亲合素偶联的微粒，其中所述链霉亲合素被偶联到另外的捕获部分。
39.根据权利要求37或38所述的QSAv、QSAv珠子或与链霉亲合素偶联的微粒，其中在生物素饱和步骤之前或期间将所述另外的捕获部分生物素化并暴露于所述链霉亲合素或与链霉亲合素偶联的微粒。
40.根据权利要求37或38所述的QSAv、QSAv珠子或与链霉亲合素偶联的微粒，其中在生物素饱和步骤之前、期间或之后将所述另外的捕获部分共价偶联到所述链霉亲合素或与链霉亲合素偶联的微粒下。
41.根据权利要求28-36中任一项所述的QSAv或QSAv珠子，所述方法还包括将所述QSAv或QSAv珠子储存在包含<1200pg/mL游离生物素的缓冲液中。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的QSAv珠子或与链霉亲合素偶联的微粒，其中所述微粒是磁性的。
43.一种QSAv溶液或QSAv珠子悬液，其中游离生物素与链霉亲合素之比不超过1ng游离生物素:50μg链霉亲合素。
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