CN116515639A - 芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一株芽枝状枝孢霉及其在去除水环境中氟喹诺酮类抗生素污染和抗生素‑重金属复合污染中的应用。该芽枝状枝孢霉Cladosporiumcladosporioides 11，分离自恩诺沙星污染的池塘底泥，保藏编号CGMCC NO.40504。C.cladosporioides 11对水环境中的恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星等氟喹诺酮类抗生素具有良好的去除作用，同时C.cladosporioides11对水环境中的氟喹诺酮类抗生素—重金属复合污染也有良好的去除作用。可应用于水产养殖水体环境以及养殖尾水中氟喹诺酮类抗生素污染以及氟喹诺酮类抗生素‑重金属复合污染的去除。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一株芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11及其应用。
背景技术
当前水产养殖过程中广泛采用磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类等抗生素作为饲料添加剂。然而，大多数抗生素不能完全被生物体代谢，从而引发水产养殖环境以及水产品抗生素污染问题，威胁水体正常生态和人类身体健康。此外，抗生素的结构特点使其能够与Fe3+、Cu2+、Zn2+等二价、三价金属离子相互作用，形成稳定的、难以降解的配位配合物，进一步加剧水产养殖环境及水产品抗生素污染。
因此，如何高效处理水产养殖环境以及水产品中的抗生素及抗生素类复合污染(如抗生素-重金属复合污染)是如今亟待解决的一个重要问题。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提出一株芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11及其应用。
基于上述目的，本申请实施例提供了保藏编号为CGMCC NO.40504的C.cladosporioides 11。
本申请实施例还提供一种孢子悬液，所述孢子悬液由保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11制备得到。
一种如前所述的孢子悬液的制备方法，包括：
将保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11接种至第一培养基中进行培养至长出孢子；培养温度为20—26℃；
将培养后的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11的孢子与无菌玻璃珠配置为所述孢子悬液。
本申请实施例还提供一株芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11在去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的应用。
本申请实施例还提供一种去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的方法，采用所述的孢子悬液。
在其中一些实施例中，所述方法包括：
将所述孢子悬液接种于第二培养基中培养进行氟喹诺酮类抗生素的去除；其中，所述第二培养基中含有氟喹诺酮类抗生素；培养温度为20—26℃。
在其中一些实施例中，所述第二培养基中还含有重金属。
在其中一些实施例中，所述氟喹诺酮类抗生素选自恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星中的至少一种；所述重金属选自镉、锌、铜、铁、铅、汞和铬中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述方法包括：
将所述孢子悬液接种至第一培养基中进行培养，处理得到菌丝体；
将所述菌丝体接置于透析袋中，并投入具有氟喹诺酮类抗生素的水体中进行氟喹诺酮类抗生素的去除；所述透析袋能够透过所述具有氟喹诺酮类抗生素的水体中的氟喹诺酮类抗生素。
在其中一些实施例中，所述具有氟喹诺酮类抗生素的水体中还含有重金属。
本申请实施例提供的保藏编号CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11对水环境中的恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星等氟喹诺酮类抗生素具有良好的去除作用，同时芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11对水环境中的氟喹诺酮类抗生素—重金属复合污染也有良好的去除作用。本申请的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11可应用于水产养殖水体环境以及养殖尾水中氟喹诺酮类抗生素污染以及氟喹诺酮类抗生素-重金属复合污染的去除。
附图说明
为了更清楚地说明本申请或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1中A为本发明实施例提供的处理1-7天时C.cladosporioides 11对PDA液体培养基中恩诺沙星的去除率；B为本发明实施例提供的处理1-7天时C.cladosporioides 11对PDA液体培养基中环丙沙星的去除率；C为本发明实施例提供的处理1-7天时C.cladosporioides 11对PDA液体培养基中氧氟沙星的去除率；D为本发明实施例提供的处理1-7天时C.cladosporioides11对PDA液体培养基中诺氟沙星的去除率。
图2为本发明实施例提供的处理5天时C.cladosporioides 11对斑马鱼养殖水体中恩诺沙星的去除率。
图3为本发明实施例提供的处理1-7天时C.cladosporioides 11对PDA液体培养基中恩诺沙星和铜的去除率。
图4为本发明实施例提供的处理5天时C.cladosporioides 11对斑马鱼养殖水体中恩诺沙星和铜的去除率。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本申请进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本申请实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本申请所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。
本申请实施例提供了保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11，通过保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11能够去除水环境中氟喹诺酮类抗生素的污染物以及氟喹诺酮类抗生素—重金属复合的污染物。
生物保藏说明
芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11：分类命名为Cladosporiumcladosporioides 11已于2023年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学微生物研究所；保藏编号为CGMCC NO.40504。
该芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11通过通用引物ITS1和ITS4经PCR扩增得到的ITS区部分的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述SEQ ID NO.1为：
TCACTTGTAATGATCCCTCCGTAGGGTGACCTGCGGAGGGATCATT ACAAGTGACCCCGG 60
TCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGC CTCCGGGGCGACC 120
CTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCG TAACTTTGCAGTCTG 180
AGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGG TTCTGGCATCGAT 240
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该芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11具有以下生理生化特征：
(1)该芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11是一种丝状真菌；
(2)该芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11菌丝黑色穿透基质，生橄榄绿色霉层，平铺状，偶有点状突起；
(3)该芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11可在PDA培养基中培养。
本申请实施例还提供了保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11在去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素中的应用。
本申请实施例还提供了用于去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的孢子悬液。所述孢子悬液由保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11制备得到。
本申请实施例还提供了一种孢子悬液的制备方法，包括：
将保藏编号为CGMCC NO.40504的C.cladosporioides 11接种至第一培养基中进行培养至长出孢子。其中，第一培养基可以为PDA固体平板培养基。培养条件为20—26℃；培养时长可以为4—5天。
将培养后的C.cladosporioides 11的孢子与无菌玻璃珠配置为所述孢子悬液。其中，培养后的C.cladosporioides 11的孢子可以通过向固体平板培养基上加入无菌生理盐水冲洗得到。其中，可以采用无菌生理盐水冲洗至少一次。
在一些实施例中，可以采用无菌生理盐水冲洗多次。例如，两次。然后将多次冲洗得到的悬液混合。
在一些实施例中，可以在培养后的C.cladosporioides 11的孢子与无菌玻璃珠混合后，采用震荡和无菌脱脂棉过滤得到孢子悬液。孢子悬液的浓度可以为1*108—1*1010CFU/mL，该浓度用血球计数板检测得到。
一种去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的方法，采用如前所述的孢子悬液。其中，所述氟喹诺酮类抗生素选自恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的方法包括：将所述孢子悬液接种于第二培养基中培养进行氟喹诺酮类抗生素的去除；其中，所述第二培养基中含有氟喹诺酮类抗生素，例如含有氟喹诺酮类抗生素的PDA固体平板培养基(也即第一培养基)；培养温度可以为20—26℃。其中，孢子悬液接种后孢子的浓度可以为1*107—1*109CFU/mL。氟喹诺酮类抗生素的浓度可以为10μg/L—60mg/L。
在一些实施例中，所述第二培养基中还含有重金属。也即，第二培养基中含有氟喹诺酮类抗生素-重金属复合污染物。其中，所述重金属选自镉、锌、铜、铁、铅、汞和铬中的至少一种。此时，孢子悬液接种后孢子的浓度可以为1*107—1*109CFU/mL。重金属的浓度可以为5μg/L—100mg/L。
在一些实施例中，去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的方法包括：
将所述孢子悬液接种至第一培养基中进行培养，处理得到菌丝体。其中，孢子悬液的接种浓度可以为1*107CFU/mL—1*109CFU/mL。培养条件为20—26℃；培养时长可以为3—4天。
将所述菌丝体接置于透析袋中，并投入具有氟喹诺酮类抗生素的水体中进行氟喹诺酮类抗生素的去除；所述透析袋能够透过所述具有氟喹诺酮类抗生素的水体中的氟喹诺酮类抗生素。其中，透析袋可以为具有选择透过性的低孔径质膜，该透析袋能够选择性地透过金属离子(也即重金属离子)和化合物(也即氟喹诺酮类抗生素)，而不使菌丝体透过，这样可以避免菌丝体在水体中扩散。菌丝体的浓度可以为1—5g/L。氟喹诺酮类抗生素的浓度可以为10μg/L—60mg/L。
在一些实施例中，该水体可以为水产养殖水体。其中，水产养殖水体可以为斑马鱼养殖水体。
在一些实施例中，所述具有氟喹诺酮类抗生素的水体中还含有重金属，重金属的浓度可以为5μg/L-100mg/L。
在一些实施例中，在对具有氟喹诺酮类抗生素的水体进行水环境中的氟喹诺酮类抗生素或同时具有氟喹诺酮类抗生素和重金属的污染物进行去除时可以根据实际情况更换1—2次菌丝体。
下面结合具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11的分离筛选
采集存在恩诺沙星污染的环境样品斑点叉尾鮰池塘底泥。该底泥中的恩诺沙星污染物通过分析其中的抗生素残留确定。将采集的斑点叉尾鮰池塘底泥用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释液涂布在含氯霉素的PDA平板培养基上，28℃培养48h，将平板上长出的真菌菌株进一步在含氯霉素的PDA平板培养基纯化3次。最终从该斑点叉尾鮰池塘底泥中得到真菌菌株37株。
将分离得到的该37株真菌菌株接种到含20mg/L恩诺沙星的PDA液体培养基中，28℃静置培养72h，以未接种真菌的含20mg/L恩诺沙星的PDA液体培养基为阳性对照。以水产常见致病菌嗜水气单胞菌为指示菌，通过观察抑菌圈的方法筛选能够降解恩诺沙星的真菌菌株。将发酵液12000rpm离心1min，取2μL上清液滴加到已接种嗜水气单胞菌的LB固体平板培养基上，选取与对照相比被筛选菌株对应的抑菌圈消失或者变小的该被筛选菌株为具有降解恩诺沙星能力的目标菌株。经过初筛和复筛，最终从目标菌株中筛选出一株能够降解恩诺沙星的真菌菌株11。
用真菌基因组提取试剂盒提取真菌菌株11的基因组，通过通用引物ITS1/ITS4对该真菌的ITS区序列进行PCR扩增，对扩增片段进行测序，将序列片段通过BLAST进行比对以及系统进化树的构建，根据菌种鉴定结果将该菌株命名为Cladosporium cladosporioides11。
实施例2芽枝状枝胞霉C.cladosporioides 11菌丝体制备
将C.cladosporioides 11接种至PDA固体平板培养基上，25℃培养4—5天至长出孢子。于培养好的C.cladosporioides 11固体平板培养基上加入10mL无菌生理盐水，轻轻将表面的孢子刮下至该无菌生理盐中，将孢子悬液吸出，置于已灭菌的第一50mL锥形瓶中。再次向固体平板培养基上加入10mL无菌生理盐水，冲洗一遍，与前一次的孢子悬液混合。向前述的第一50mL锥形瓶中加入适量无菌玻璃珠，200rpm震荡1h，经无菌脱脂棉过滤后得到C.cladosporioides 11的孢子悬液。用血球计数板检测孢子浓度。
将孢子悬液接种至PDA培养基中，接种浓度为1*108CFU/mL。25℃、150rpm震荡培养3—4天，即可获得大量C.cladosporioides 11菌丝体。
实施例3利用芽枝状枝胞霉C.cladosporioides 11去除PDA培养基中的氟喹诺酮类抗生素
将C.cladosporioides 11孢子悬液接种至分别含有20mg/L恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的PDA液体培养基中。C.cladosporioides 11孢子悬液的接种浓度为1*108CFU/mL。25℃下静置培养1—7天，计算培养基中氟喹诺酮类抗生素的去除率。将不含C.cladosporioides 11孢子悬液的等体积无菌生理盐水接种至分别含有20mg/L恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的PDA液体培养基中为对照组。
试验结果：见表1和图1。
结果分析：由图1可知，培养基中的氟喹诺酮类抗生素的去除率随培养时间的延长而增加。
表1C.cladosporioides 11对PDA液体培养基中恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星的去除率(％)
实施例4利用芽枝状枝胞霉C.cladosporioides 11去除斑马鱼养殖水体中的恩诺沙星
将C.cladosporioides 11菌丝体放入透析袋中，投放量为每升水体投放3g菌体(湿重)。处理分别含有40μg/L和2mg/L恩诺沙星的斑马鱼养殖水体5天。将不含C.cladosporioides 11孢子悬液的等体积无菌生理盐水接种至分别含有40μg/L和2mg/L恩诺沙星的PDA液体培养基中为对应的对照组，进行相同的培养。
试验结果：见表2和图2。
结果分析：由表2和图2可知，C.cladosporioides 11孢子悬液对斑马鱼养殖水体的恩诺沙星去除率分别为76.37％和72.47％。
表2C.cladosporioides 11对斑马鱼养殖水体中恩诺沙星的去除率(％)
实施例5利用芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11去除PDA培养基中的恩诺沙星—铜复合污染
将C.cladosporioides 11孢子悬液接种至添加了30mg/L恩诺沙星和10mg/L Cu2+的PDA液体培养基中。25℃下静置培养3—9天。
试验结果：见表3和图3。
表3C.cladosporioides 11对PDA液体培养基中恩诺沙星和铜的去除率(％)
结果分析：由表3和图3可知，C.cladosporioides 11孢子悬液对PDA液体培养基中恩诺沙星和铜的去除率随培养时间的延长而增加。
实施例6利用芽枝状枝胞霉C.cladosporioides 11去除斑马鱼养殖水体中的恩诺沙星—铜复合污染
将C.cladosporioides 11菌丝体放入透析袋中，投放量为每升水体投放3g菌体(湿重)。处理同时添加了2mg/L恩诺沙星和10μg/L Cu2+的斑马鱼养殖水体5天。
试验结果：见表4和图4。
表4C.cladosporioides 11对斑马鱼养殖水体中恩诺沙星和铜的去除率(％)
结果分析：由表4和图4可知，恩诺沙星去除率为73.7％，铜去除率为60.3％。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
尽管已经结合了本公开的具体实施例对本公开进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉Cladosporiumcladosporioides 11。
2.一种孢子悬液，其特征在于，所述孢子悬液由保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11制备得到。
3.一种如权利要求2所述的孢子悬液的制备方法，其特征在于，包括：
将保藏编号为CGMCC NO.40504的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11接种至第一培养基中进行培养至长出孢子；培养温度为20—26℃；
将培养后的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11的孢子与无菌玻璃珠配置为所述孢子悬液。
4.根据权利要求1所述的芽枝状枝孢霉C.cladosporioides 11在去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的应用。
5.一种去除水环境中的氟喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，采用权利要求2或3所述的孢子悬液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
将所述孢子悬液接种于第二培养基中培养进行氟喹诺酮类抗生素的去除；其中，所述第二培养基中含有氟喹诺酮类抗生素；培养温度为20—26℃；所述孢子悬液接种后孢子的浓度为1*107—1*109CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二培养基中还含有重金属。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氟喹诺酮类抗生素选自恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星中的至少一种；所述重金属选自镉、锌、铜、铁、铅、汞和铬中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
将所述孢子悬液接种至第一培养基中进行培养，处理得到菌丝体；
将所述菌丝体接置于透析袋中，并投入具有氟喹诺酮类抗生素的水体中进行氟喹诺酮类抗生素的去除；所述透析袋能够透过所述具有氟喹诺酮类抗生素的水体中的氟喹诺酮类抗生素；其中，所述菌丝体在水体中的浓度为1—5g/L。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述具有氟喹诺酮类抗生素的水体中还含有重金属。
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