CN105400701A

CN105400701A - 一种枝状枝孢霉菌株及其应用

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Publication number: CN105400701A
Application number: CN201510750702.6A
Authority: CN
Inventors: 胡军华; 姚廷山; 王娟; 刘浩强; 李鸿筠; 冉春
Original assignee: CITRUS RESEARCH INSTITUTE OF CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: CITRUS RESEARCH INSTITUTE OF CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-03-16

Abstract

一种枝状枝孢霉菌株（<i>Cladosporium？cladosporioides</i>）CQBBW3，保藏编号为CGMCC？No.11439，该菌的rDNA-ITS序列和<i>Cladosporium？cladosporioides</i>的相应序列同源性高达95%。本发明从自然感染的柑桔全爪螨直接分离筛选的枝状枝孢霉菌株CQBBW3，产孢能力强、14天时产孢量可达4.3×10⁸个/mL、其生产性状好、生长迅速，14天时菌落直径为6.6125cm；同时对柑桔全爪螨杀虫活性强、杀虫效果好，对柑桔全爪螨雌成螨的LC₅₀和LT₅₀分别为4.66×10⁸个孢子/mL和6.2353天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了柑桔全爪螨种群数量。

Description

一种枝状枝孢霉菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株，具体涉及一种杀虫枝状枝孢霉菌株及其应用，属于生物农药领域。

技术背景

自发明化学农药之后，化学农药以每年5％惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业作为增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的“3R”问题(即抗药性Resistance，农药残留Residence，再猖獗Resurgence)，也带来了一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、叶螨类等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。

叶螨造成全球许多园艺植物、观赏性植物和农作物显著的产量损失，是造成蔬菜严重破坏的主要原因，导致7～48％的产量损失，一个控制叶螨的主要问题是许多重要杀螨剂在应用不久后都能快速产生抗药性。为了规避杀螨剂抗性的问题，也使农民和种植者能够回应消费者对农药残留问题，需要一个有效的方法来控制植食性叶螨而不涉及化学药品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对柑桔全爪螨杀灭效果好、生产性状好的枝状枝孢霉菌株CQBBW3。

本发明菌株是通过采集自然感染的柑桔全爪螨体直接分离筛选出的一株生产性状好、对柑桔全爪螨具有高毒力的枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)CQBBW3，已于2015年09月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.11439。

本发明枝状枝孢霉菌株CQBBW3接种在PDA平板上，25℃培养观察菌落形态特征，在PDA平板上生长菌落呈圆形凸起，呈灰白色，有黄色外圈；菌丝具有分隔和分支；孢子呈椭圆形，单胞，无色。

本发明技术方案是经过采集自然感染的柑桔全爪螨体表→分离纯化菌株→鉴定菌株的分类地位→确定菌株的培养条件→液体和固体发酵→干孢子粉收集→室内、室外杀虫效果测定等步骤，反复筛选出的一株对柑桔全爪螨具有高杀虫活性、生产性状好的枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)菌株CQBBW3。

为了进一步提高本发明菌株的产孢性状、以便更适于孢子批量生产，对本发明菌株发酵优选的培养基为淀粉琼脂糖培养基(pH7.0)，121℃高压湿热灭菌30min；自然冷却后按1∶10(菌液：淀粉琼脂糖培养基，V/W)比例接种枝状枝孢霉菌株CQBBW3并拌匀，25℃培养3天后与大米培养基(比如为了降低成本、可以采用低值陈米培养基)混合25℃静置培养10天后产孢量可达4.3×10⁸个/克。

一种杀菌、杀螨农药组合物，其特征在于：其包含氧化亚铜、嘧菌酯、醚菌酯中一种或多种任意组合，与枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)CQBBW3的分生孢子粉。

一种杀螨农药组合物，其特征在于：其包含噻螨酮、四螨嗪、丁氟螨酯、甲氰菊酯中一种或多种任意组合，与枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)CQBBW3的分生孢子粉。

本发明枝状枝孢霉菌株CQBBW3具体如下的有益效果：

本发明从自然感染的柑桔全爪螨直接分离筛选的枝状枝孢霉菌株CQBBW3，产孢能力强、20天培养产孢量可达4.3×10⁸个/克、其生产性状好、生长迅速，14天之后的菌落直径为6.6125cm；同时对柑桔全爪螨杀虫活性强、杀虫效果好，对柑桔全爪螨幼虫的LC₅₀和LT₅₀分别为4.66×10⁸个孢子/mL和6.2353天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了柑桔全爪螨种群数量。

附图说明

图1：枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)CQBBW3菌株产孢结构与分生孢子形态；

图2：枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)CQBBW3菌落形态；

图3(a)：不同碳源对CQBBW3菌株菌丝生长的影响；

图3(b)：不同碳源对CQBBW3菌株产孢量的影响；

图4(a)：不同氮源对CQBBW3菌株菌丝生长的影响；

图4(b)：不同氮源对CQBBW3菌株产孢量的影响；

图5(a)：不同温度对CQBBW3菌株菌丝生长的影响；

图5(b)：不同温度对CQBBW3菌株产孢量的影响；

图6(a)：不同pH对CQBBW3菌株菌丝生长的影响；

图6(b)：不同pH对CQBBW3菌株产孢量的影响；

图7(a)：不同培养基上CQBBW3菌株菌丝速率比较；

图7(b)：不同培养基上CQBBW3菌株产孢量比较。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菌株的分离

将采集到的自然感染的柑桔全爪螨体表用70％酒精表面消毒，放入25℃培养箱中保湿培养3～5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取微量新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的PDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于25℃恒温箱中培养；3～4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用接种针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，25℃恒温培养7天。

实施例2菌株的鉴定

(1)、形态鉴定

将分离到的CQBBW3菌株接种在PDA平板上，25℃培养观察菌落形态特征，结果显示CQBBW3菌株在PDA平板上生长菌落呈圆形凸起，呈灰白色，有黄色外圈；菌丝具有分隔和分支；孢子呈椭圆形，单胞，无色。参见图1、2。

(2)、CQBBW3菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定

以ITS1和ITS4为引物(参加表1)，从该菌株基因组DNA中扩增出1条约600bp的序列，PCR产物经测序后所得序列通过Blast与GenBank中已有的核酸序列进行对比，结果表明，该菌株的rDNA-ITS序列测序结果见SEQIDNo.1，和Cladosporiumcladosporioides的相应序列同源性高达95％。

表1枝状枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)CQBBW3菌株的扩增条件及体系

实施例3CQBBW3菌株对柑桔全爪螨杀虫活性的测定

刮取生长于PDA平板上生长7天的CQBBW3菌丝溶于0.02％吐温的无菌水中，震荡过滤收集孢子悬浮液，分别配置成6个孢子浓度梯度：1.7×10³个/mL、1.7×10⁴个/mL、1.7×10⁵个/mL、1.7×10⁶个/mL、1.7×10⁷个/mL、1.7×10⁸个/mL；每个浓度的孢子悬液10mL均匀喷洒在5片、每片叶子上接50头柑桔全爪螨，对照组喷洒10mL含0.02％吐温-80的无菌水，逐日统计死亡率。CQBBW3菌株对柑桔全爪螨杀虫活性测定结果参见表2、3。枝状枝孢霉杀柑桔全爪螨的LC₅₀为4.66×10⁸个孢子/mL，LT₅₀为6.2353天。

表2CQBBW3菌株对柑桔全爪螨的毒力回归方程

菌种	毒力回归方程	LC₅₀/(个孢子/mL)	相关系数(r)
				枝状枝孢霉	Y＝3.1183+0.2171*X	4.66×10⁸	0.9336

表3CQBBW3菌株对柑桔全爪螨的毒力回归方程

菌种	毒力回归方程	LT₅₀/(d)	相关系数(r)
				枝状枝孢霉	Y＝3.5374+1.8401*X	6.2353	0.9606

实施例4CQBBW3菌株产孢特性

最佳碳源筛选：无碳基础培养基配方：硝酸钾3g，琼脂20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，pH自然。选取8种供试碳源：可溶性淀粉、甘露醇、果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、甘油，分别称取30g加入到无碳基础培养基中制成不同碳源的供试培养基。将在PDA培养基上生长7天的菌落以菌饼的方式分别转接到不同碳源的培养基中央，每个处理5个重复，于25℃培养箱中培养，7天、10、15时采用十字交叉法测量菌落的直径。用SPSS软件分析数据，得到生长最佳碳源。

结果(参见图3(a)、图3(b))：此菌在以甘露醇为碳源的平板上生长最快，生长15天之后的菌落直径为4.38cm，故最适碳源为甘露醇；其次为麦芽糖和淀粉，在以蔗糖为碳源的平板上生长最差，为3.06cm。在以乳糖为碳源的培养基上产孢量最大，为4.07×10⁸个/mL；在以淀粉为碳源的培养基上产孢量最小，为7.23×10⁷个/mL。

最佳氮源筛选：无氮基础培养基配方：蔗糖30g，琼脂20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，pH自然。选取6种供试氮源：硝酸钾，尿素、硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、赖氨酸。分别称取3g加入到无氮基础培养基中制成不同氮源的供试培养基。将在PDA培养基上生长7天的菌株以菌饼的方式分别转接到不同氮源的培养基中央，每个处理5个重复，于25℃培养箱中培养，7天、14天时采用十字交叉法测量菌落的直径。用SPSS软件分析数据，得到生长最佳氮源。

结果(参见图4(a)、图4(b))：此菌在以甘氨酸为氮源的平板上生长最快，七天之后的菌落直径为2.37cm，14天之后的菌落直径为3.82cm，故最适氮源为甘氨酸；其次为硝酸铵和赖氨酸，在以尿素为氮源的平板上生长最慢，为1.338cm。在以赖氨酸为氮源的培养基上产孢量最大，为1.317×10⁸个/mL；在以尿素为氮源的培养基上产孢量最小，为1.01×10⁷个/mL。

最佳生长温度筛选：选取7个供试温度：10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，进行对比试验从中选出最适生长温度。将在PDA培养基上生长7天的CQBBW3菌株以菌饼的方式分别转接到PDA培养基中央，每个处理5个重复，于7个不同温度的培养箱中培养，7天、14天时采用十字交叉法测量菌落的直径。用SPSS软件分析数据，得到最佳生长温度。

结果(参见图5(a)、图5(b))：此菌在温度为25℃条件下生长最快，5天之后的菌落直径为2.37cm，10天之后的菌落直径为4.18cm，在35℃和40℃条件下不生长。在25℃条件下的产孢量最大，为3.22X10⁸个/mL。

最佳生长pH筛选：选取7个供试pH：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，进行对比试验从中选出最适生长pH。将在PDA培养基上生长7天的CQBBW3菌株以菌饼的方式分别转接到7个不同pH的PDA培养基中央，每个处理5个重复，于25℃培养箱中培养，5天、10天时采用十字交叉法测量菌落的直径。用SPSS软件分析数据，得到最佳生长pH。

结果(参见图6(a)、图6(b))：此菌在以pH6的平板上生长最快，5天之后的菌落直径为1.89cm，10天之后的菌落直径为3.91cm；在pH11时生长最慢，第10天的菌落直径为3.39cm。在pH为7时产孢量最大，为1.94×10⁸个/mL，在pH为10时产孢量最低，为2.04×10⁷个/mL。

实施例5与枝状枝孢霉相容性杀菌剂、杀螨剂筛选

相容性杀菌剂筛选：总共选取了11种田间常用的杀菌剂作为供试杀菌剂：86.2％氧化亚铜WP、40％氟硅唑EC(美国杜邦公司)、80％代森锰锌WP、10％苯醚甲环唑DP(海南博士威农用化学有限公司)、43％戊唑醇SC(拜尔作物科学中国有限公司)、20％甲基硫菌灵SC(深圳诺普信农化股份有限公司)、50％喹啉铜WP(浙江海正化工股份有限公司)、70％丙森锌WP(拜尔作物科学中国有限公司)、25％嘧菌酯SC(英国先正达有限公司)、80％代森锌WP(四川国光农化股份有限公司)、50％醚菌酯WDG(江苏龙威药物化工有限公司)。分别制成所设定的农药浓度的培养基，并利用生长速率法测定杀菌剂的毒力。根据所有杀菌剂的性质，分别设定不同的供试浓度。

培养基配置：取1g(1mL)原农药用无菌水配制成100mL的农药母液，取对应浓度所需体积的农药母液(无菌水作为对照)与100mL已融化好的PDA培养基混合均匀制成不同浓度的培养基，平均倒入3个(即3次重复)直径为9cm且无菌的培养皿中。用直径为5mm的打孔器在枝状枝孢霉菌的菌落上打取带菌培养基柱(菌饼)，并用无菌或消毒的接种针或金属镊子将菌饼接入冷凝后培养平板中央。接种培养皿置于25℃恒温培养箱中培养，7天时用十字交叉法测量菌落直径。运用DPS软件对各药剂试验结果进行统计分析，获得各药剂对菌株的毒力回归方程、抑制中浓度(EC₅₀)和相关系数(r)。

从表4可以看出，10％苯醚甲环唑DP的EC₅₀值最小为0.0186mg/mL，故枝状枝孢霉与苯醚甲环唑的相容性最差。而86.2％氧化亚铜WP的EC₅₀值最大为143.4369mg/mL，故枝状枝孢霉与氧化亚铜的相容性最好，可以复配使用，减少化学农药所造成的“3R”问题。其他杀菌剂与枝状枝孢霉的相容性处于两者之间。

表411种杀菌剂对芽枝状枝孢霉Cladosporiumcladosporioides的毒力回归方程

药剂	毒力回归方程	EC₅₀/(mg./mL)	相关系数(r)
				86.2％氧化亚铜WP	Y＝0.9218+1.8910*X	143.4369	0.9753
40％氟硅唑EC	Y＝5.4475+0.3552*X	0.055	0.9385
				80％代森锰锌WP	Y＝4.1020+1.1172*X	6.3643	0.9777
10％苯醚甲环唑DP	Y＝5.7014+0.4052*X	0.0186	0.9639
				43％戊唑醇SC	Y＝5.1610+0.5511*X	0.5103	0.9135
20％甲基硫菌灵SC	Y＝3.3583+1.5128*X	12.1677	0.9462
				50％喹啉铜WP	Y＝4.3416+2.0923*X	2.0639	0.9727
70％丙森锌WP	Y＝3.2804+1.3024*X	20.9087	0.9898
				25％嘧菌酯SC	Y＝4.5948+0.2424*X	46.9470	0.9433
80％代森锌WP	Y＝3.6495+1.4829*X	8.1414	0.9883
				50％醚菌酯WDG	Y＝1.9375+1.5870*X	85.0544	0.9297

备注：剂型代码：可湿性粉剂为WP，水分散粒剂为WDG，水乳剂为EW，悬浮剂为SC，乳油为EC，粉剂为DP，水剂为AS。

相容性杀螨剂筛选：总共选取了5种田间常用的杀螨剂作为供试杀螨剂：5％噻螨酮EC、20％四螨嗪SC、20％丁氟螨酯SC、20％甲氰菊酯EC、240g/L螺螨酯SC。根据杀螨剂的性质，每种杀螨剂设定6个供试浓度。20％四螨嗪SC、20％丁氟螨酯、20％甲氰菊酯EC：5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L，5％噻螨酮：1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L，240g/L螺螨酯SC：6mg/L、12mg/L、24mg/L、48mg/L、96mg/L、192mg/L。

培养基配置：取1g(1ml)原农药用无菌水配制成1OOmL的农药母液，取对应浓度所需体积的农药母液(无菌水作为对照)与1OOmL已融化好的PDA培养基混合均匀制成不同浓度的培养基，平均倒入3个(即3次重复)直径为9cm且无菌的培养皿中。用直径为5mm的打孔器在枝状枝孢霉菌的菌落上打取带菌培养基柱(菌饼)，并用无菌或消毒的接种针或金属镊子将菌饼接入冷凝后培养平板中央。接种培养皿置于25℃恒温培养箱中培养，7天时用十字交叉法测量菌落直径。运用DPS软件对各药剂试验结果进行统计分析，获得各药剂对菌株的毒力回归方程、抑制中浓度(EC50)和相关系数(r)。

从表5可以看出除240g/L螺螨酯SC外，5％噻螨酮EC、20％四螨嗪SC、20％丁氟螨酯SC、20％甲氰菊酯EC这4种杀螨剂对枝孢霉的抑制中浓度都很高，说明这4种杀螨剂与枝孢霉的相容性很好，可以在田间组合使用，以增加对抗性柑桔全爪螨的种群控制作用。

表55种杀螨剂对枝状枝孢霉Cladosporiumcladosporioides的毒力回归方程

药剂	毒力回归方程	EC₅₀/(mg/l)	相关系数(r)
				20％丁氟螨酯SC	Y＝3.2056+0.3448*X	159928.0625	0.7341
5％噻螨酮EC	Y＝3.9882+0.1379*X	21749514.0000	0.4918
				20％四螨嗪SC	Y＝3.3461+0.2697*X	1358695.0000	0.5824
240g/L螺螨酯SC	Y＝3.8331-0.0673*X	0.0000	0.2057
				20％甲氰菊酯EC	Y＝3.0909+0.4265*X	29953.0723	0.7394

实施例6CQBBW3菌株固体发酵产孢率

最佳培养基筛选：选取6种供试培养基：淀粉琼脂糖，PDA，L-borth，SEA，SDAY，查氏培养基，分别配置6种不同培养基并制成平板。将在PDA培养基上生长7天的CQBBW3菌落以菌饼的方式分别转接到不同的培养基中央，每个处理5个重复，于25℃培养箱中培养，7天、14天时采用十字交叉法测量菌落的直径。用SPSS软件分析数据，得到最佳生长培养基。参见图7(a)、图7(b)。

在淀粉琼脂糖平板上生长最快，七天时菌落直径为3.375cm，14天时菌落直径为6.6125cm；其次为SEA培养基，在SDAY平板上生长最慢，第14天的菌落直径为1.85cm。在淀粉琼脂糖培养基上产孢量最大，为4.3×10⁸个/mL，在SDAY培养基上产孢量最少，为3.85×10⁸个/mL。

Claims

1.一种枝状枝孢霉菌株，其特征在于：所述菌株为枝状枝孢霉菌株（Cladosporiumcladosporioides）CQBBW3，保藏编号为CGMCCNo.11439。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述菌株的TIS1-ITS4序列为SEQIDNO.1。

3.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：该菌株的适宜产孢温度为25℃，适宜产孢pH为7.0左右。

4.如权利要求1或2所述的菌株，其特征在于：所述菌株适宜产孢培养基为淀粉琼脂糖培养基。

5.如权利要求1或2所述菌株在制备防治柑桔全爪螨的真菌制剂中的应用。

6.一种杀菌、杀螨农药组合物，其特征在于：其包含氧化亚铜、嘧菌酯、醚菌酯中一种或多种任意组合，与枝状枝孢霉（Cladosporiumcladosporioides）CQBBW3菌株的分生孢子粉。

7.一种杀螨农药组合物，其特征在于：其包含噻螨酮、四螨嗪、丁氟螨酯、甲氰菊酯中一种或多种任意组合，与枝状枝孢霉（Cladosporiumcladosporioides）CQBBW3菌株的分生孢子粉。