CN116496353A

CN116496353A - 一种多肽衍生物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116496353A
Application number: CN202310506192.2A
Authority: CN
Inventors: 邓鹏�; 毛龙飞; 孙苏军; 孙洲; 王斓; 王恒振; 王新坤; 赵文珊; 姬涛; 彭立增; 周磊
Original assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2023-07-28
Also published as: CN117567564A

Abstract

本发明涉及一种多肽衍生物及其制备方法与应用，属于多肽药物的技术领域所述多肽衍生物其分子结构通式如下式Ⅰ：X‑Asn‑Tyr‑Ser‑Lys‑Pro‑Thr‑Asp‑Arg‑Gln‑Tyr‑His‑Phe‑Y；所述式Ⅰ为链式化合物或环状化合物；其中，当式Ⅰ为链式化合物时，X为糖基，Y为H，所述糖基与N端连接；当式Ⅰ为环状化合物时，X和Y为半胱氨酸，且X和Y通过二硫键连接。本发明提供的多肽衍生物在对PDL1活性均达到比较良好的阻断效果，并且比DPPA‑1提高了溶解性。同时本发明的多肽衍生物能够有效抑制炎症的发生，对炎症产生的NO生成率有显著抑制。

Description

一种多肽衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及多肽药物的技术领域，具体涉及一种多肽衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

目前，用于预防、治疗和诊断疾病的多肽类药物主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、诊断用多肽以及其他药用小肽等。制备多肽药物的常规技术手段有化学合成、分离纯化及基因工程等，其中以化学合成为最主要制备方式。相比化学小分子药物，多肽药物生物活性更强、用药剂量更小、毒副作用更低且疗效显著，因此备受新药研发者的瞩目与青睐。一般而言，肽是能与特定细胞结合的选择性信号分子表面受体，例如G蛋白偶联受体(GPCR)或离子通道，能激活触发细胞内分子机制，这也是有别于化学小分子的重要特征。相比大分子蛋白药，肽的生产更简单，成本更低，又接近小分子的成本，所以处于化学小分子药和生物药之间的最佳平衡点。据统计，目前已鉴定发现了7000余种天然存在的肽，它们在人体内扮演着激素、神经递质、生长因子、离子通道配体、抗感染剂等角色。

由于天然肽具有化学、物理稳定性差等固有弱点，不适宜直接用作治疗制剂，所以研发多肽药物必须率先克服其半衰期短、不稳定、在体内易被降解等缺陷。通过糖基化对多肽进行改造，能够有效的提高多肽的溶剂性和稳定性。糖基化修饰对蛋白质功能和结构的形成具有重要作用。在机体内，细胞粘附、分子识别以及信号转导等过程均涉及糖基化蛋白质的参与，说明糖基化修饰对蛋白质行使生物学功能起着重要作用。研究蛋白质的糖基化修饰及其在不同生理病理条件下的变化有重要意义，也是糖蛋白质组学面临的主要问题和巨大挑战。

在免疫检查点中，PD-1/PD-L1多年来被认为是一种抗癌药物靶点，目前已有多种单克隆抗体通过靶向PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤治疗中取得了令人鼓舞的效果。DPPA-1对PD-L1有特异性抑制效果，在CT26异种移植小鼠模型中，肽显著抑制肿瘤生长。本发明通过对DPPA-1进行糖基化修饰，希望能够提高溶解性并提高PD-L1的抑制效果。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种多肽衍生物及其制备方法与应用，以提高多肽的溶解性并提高PD-L1的抑制效果，同时还能够有效抑制炎症的发生。

第一方面，本发明提供一种多肽衍生物，其分子结构通式如下式Ⅰ：

X-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe-Y；

Ⅰ

所述式Ⅰ为链式化合物或环状化合物；

其中，

当式Ⅰ为链式化合物时，X为糖基，Y为H，所述糖基与N端连接；

当式Ⅰ为环状化合物时，X和Y为半胱氨酸，且X和Y通过二硫键连接。

优选的，当式Ⅰ为链式化合物时，X为葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺和半乳糖胺。

优选的，式Ⅰ选自以下化合物：

T1：glu-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe；

T2；gal-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe；

T3：

第二方面，本发明提供一种制备式Ⅰ化合物的方法，包括以下步骤：

当式Ⅰ化合物为链式结构时，方法如下：

(1)合成CTC树脂

CTC Resin和Fmoc-Phe-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸，再加入DIPEA，反应3小时后，不抽滤溶液，直接加入甲醇，封端半小时，洗涤后得到Fmoc-Phe-CTC Resin备用；

(2)氨基酸对接

脱Fmoc：加3倍树脂体积的20％ PIP/DMF溶液，鼓氮气60分钟，然后用DMF洗涤得到H₂N-Phe-CTC Resin；

缩合：取Fmoc-His-OH加入到上述树脂里，加DMF溶解Fmoc-His-OH，再分别加入IPEA和HBTU；反应60分钟后，用DMF洗涤树脂得到Fmoc-His-Phe-CTC Resin；

(3)按照步骤(2)的方法依次将Tyr、Gln、Arg、Asp、Thr、Pro、Lys、Ser和Tyr连接至肽链上；

(4)多肽糖基化

将步骤(3)获得的多肽Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe与发生缩合反应获得式Ⅰ化合物粗品；式Ⅱ中X与式Ⅰ定义相同；

(5)用三氟乙酸、三异丙基硅烷、水和二硫苏糖醇的混合溶液从树脂中裂解肽，用冰冷的乙醚沉淀；将多肽溶解在乙腈：水＝1:1的溶液中，并通过反相高压液相色谱进行纯化，得式Ⅰ化合物。

优选的，步骤(5)中混合溶液比例为三氟乙酸：三异丙基硅烷：水：二硫苏糖醇＝90：5：2.5：2.5。

优选的，步骤(1)中，CTC Resin和Fmoc-Phe-OH的摩尔比为3:4。

优选的，步骤(2)中，Fmoc-Phe-CTC Resin、Fmoc-His-OH的摩尔比为1:7。

当式Ⅰ化合物为环状结构时，方法如下：

(1)合成CTC树脂

CTC Resin和Fmoc-Cys-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸，再加入DIPEA，反应3小时后，不抽滤溶液，直接加入甲醇，封端半小时，洗涤后得到Fmoc-Cys-CTC Resin备用；

(2)氨基酸对接

脱Fmoc：加3倍树脂体积的20％ PIP/DMF溶液，鼓氮气60分钟，然后用DMF洗涤得到H₂N-Cys-CTC Resin；

缩合：取Fmoc-Phe-OH加入到上述树脂里，加DMF溶解Fmoc-Phe-OH，再分别加入IPEA和HBTU；反应60分钟后，用DMF洗涤树脂得到Fmoc-Phe-Cys-CTC Resin；

(3)按照步骤(2)的方法依次将His、Tyr、Gln、Arg、Asp、Thr、Pro、Lys、Ser、Tyr、Asn和Cys连接至肽链上；

(4)用三氟乙酸、三异丙基硅烷、水和二硫苏糖醇的混合溶液从树脂中裂解肽，用冰冷的乙醚沉淀；将多肽溶解在乙腈：水＝1:1的溶液中，并通过反相高压液相色谱进行纯化，得多肽Cys-Arg-Arg-Lys-Lys-Trp-Leu-Val-Phe-Phe-Val-Ile-Phe-Tyr-Phe-Phe-Arg-Cys。

(5)将步骤(4)制备的多肽溶于水中，缓慢滴加溶有碘的甲醇溶液，HPLC监测反应结束。制备液相纯化后得式Ⅰ化合物。

第三方面，本发明提供一种式Ⅰ化合物在制备抑制PDL1活性药物中的应用。

第四方面，本发明提供一种式Ⅰ化合物在制备抑制炎症药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的多肽衍生物在对PDL1活性均达到比较良好的阻断效果。通过溶解度试验，化合物T1、T2、T3相比于DPPA-1在DMSO中的溶解性分别提高39.2％，33.8％和25.7％。同时本发明的多肽衍生物能够有效抑制炎症的发生，对炎症产生的NO生成率有显著抑制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是化合物T1的结构示意图。

图2是化合物T2的结构示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

T1化合物(glu-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe)的制备

(1)合成CTC树脂

称取代度为1.0mmol/g的0.3g CTC Resin和0.4mmol的Fmoc-Phe-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸，再加入树脂0.9mmol的DIPEA(Mw:129.1,d:0.740g/ml)，反应3小时后，不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次。得到Fmoc-Phe-CTC Resin备用。

(2)氨基酸对接

脱Fmoc：加3倍树脂体积的20％PIP/DMF溶液，鼓氮气60分钟，然后2倍树脂体积的DMF洗涤5次。得到H₂N-Phe-CTC Resin。(此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色)。

缩合：取2.8mmol Fmoc-His-OH，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解Fmoc-His-OH，再分别加入1.8mmol DIPEA，1.67mmol HBTU；反应60分钟后，用2倍树脂体积的DMF洗涤3次树脂。(洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备)。得到Fmoc-His-Phe-CTC Resin。

(3)按照步骤(2)的方法依次将Tyr、Gln、Arg、Asp、Thr、、Pro、Lys、Ser和Tyr连接至肽链上。

(4)多肽糖基化

将步骤(3)获得的多肽Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe与发生缩合反应获得T1化合物粗品。

(5)用比例为三氟乙酸：三异丙基硅烷：水：二硫苏糖醇＝90[v/v]：5[v/v]：2.5[v/v]：2.5[m/v]的混合溶液从树脂中裂解肽，用冰冷的乙醚沉淀。将多肽溶解在乙腈：水＝1:1的溶液中，并通过反相高压液相色谱进行纯化，得T1化合物，HPLC检测纯度＞95％。MS检测结果如下：

[M+4H]⁴⁺:M＝426.1；[M+3H]³⁺:M＝573.7；[M+2H]²⁺:M＝859.8。

实施例2

T2化合物(gal-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe)的制备

步骤(1)～步骤(3)同实施例1。

(4)多肽糖基化

将步骤(3)获得的多肽Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe与发生缩合反应获得T2化合物粗品。

(5)用比例为三氟乙酸：三异丙基硅烷：水：二硫苏糖醇＝90[v/v]：5[v/v]：2.5[v/v]：2.5[m/v]的混合溶液从树脂中裂解肽，用冰冷的乙醚沉淀。将多肽溶解在乙腈：水＝1:1的溶液中，并通过反相高压液相色谱进行纯化，得T2化合物，HPLC检测纯度＞95％。MS检测结果如下：

[M+4H]⁴⁺:M＝430.5；[M+3H]³⁺:M＝573.6；[M+2H]²⁺:M＝859.7。

实施例3

T3化合物的制备

步骤(1)～步骤(4)同实施例1，区别在于，先使用取代度为1.0mmol/g的CTC Resin和Fmoc-Cys-OH于反应器中反应，得到Fmoc-Cys-CTC Resin；然后脱掉Fmoc，再加入Fmoc-Phe-OH缩合；然后依次将His、Tyr、Gln、Arg、Asp、Thr、Pro、Lys、Ser、Tyr、Asn和Cys连接至肽链上。缩合反应结束后使用三氟乙酸：三异丙基硅烷：水：二硫苏糖醇＝90[v/v]：5[v/v]：2.5[v/v]：2.5[m/v]的混合溶液从树脂中裂解肽，制备液相纯化后得多肽Cys-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe-Cys。

(5)将步骤(4)制备的多肽溶于水中，缓慢滴加溶有碘的甲醇溶液，使多肽两端裸露的巯基发生脱氢氧化形成二硫键。HPLC监测反应结束。制备液相纯化后得T3化合物，HPLC检测纯度＞95％，MS检测结果如下：

[M+4H]⁴⁺:M＝440.9；[M+3H]³⁺:M＝587.5；[M+2H]²⁺:M＝881.2。

实施例4

阻断PDL1活性实验

收取CHOK1-hPD1细胞，取细胞3×10⁵/样；把合成的多肽溶解至200μM后倍比稀释，然后与50ng的hPD-L1蛋白共孵育30min；蛋白和肽混合液加到CHOK1-hPD1细胞中共孵育30min；加入anti-Fc PE抗体孵育30min；流式细胞仪检测多肽阻断hPD1/hPD-L1的能力。具体测试结果如下表1：

表1-阻断PDL1活性实验结果

化合物编号	IC₅₀
		T1	75.52μM
T2	101.9μM
		T3	89.81μM

由表1中实验结果可以看出，本发明制备的化合物T1、T2和T3对PDL1活性均达到比较良好的阻断效果。通过溶解度试验，化合物T1、T2、T3相比于DPPA-1在DMSO中的溶解性分别提高39.2％，33.8％和25.7％。

实施例5

抗炎症实验

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)致BV2细胞炎症模型：BV2细胞以2×10⁴个/孔接种于96孔培养板上，置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱内培养；培养24小时后，在给药组中加入相应浓度的待测化合物孵育2小时，随后在给药组与LPS模型组中分别加入终浓度为100ng/mlLPS；继续培养24小时，每孔取50μl上清与50μl Greiss buffer，室温反应15min。酶标仪(Biotek)检测各组在540nm的波长下的OD值。在NO生成率检测中，LPS模型组NO生成率设为100％(n＝3)。测试结果如下表2：

表2-化合物的NO生成率测试

表中数据表示为mean±S.E.M.。*P<0.05，**P<0.01相对于LPS组。

由实验结果可以发现，小胶质BV2细胞在脂多糖诱导其发生炎症的时候，化合物T8对能够有效抑制炎症的发生，对炎症产生的NO生成率有显著抑制。

实施例6

细胞存活率检测

BV2细胞以2×10⁴个/孔接种于96孔培养板上，置于含5％CO₂的37℃恒温培养箱内培养。培养24小时后，在给药组中加入相应浓度的待测化合物孵育2小时，随后在给药组与LPS模型组中分别加入终浓度为100ng/mlLPS。继续培养24小时，每孔加入5mg/ml MTT，进行活细胞染色，37℃孵育1小时后，弃去培养液，每孔加入100μl DMSO，在摇板机上振摇使之充分溶解，酶标仪(Biotek)检测各组在490nm的波长下的OD值。在细胞存活率检测中，LPS模型组细胞存活率设为100％(n＝3)。测试结果如下表3：

表3-细胞存活率实验结果

表中数据表示为mean±S.E.M.。*P<0.05，***P<0.001相对于LPS组。

由实验结果可以发现，化合物T8对小胶质BV2细胞没有毒性，而且在一定程度上能够促进细胞的分裂。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

Claims

1.一种多肽衍生物，其特征在于，其分子结构通式如下式Ⅰ：

X-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe-Y；

Ⅰ

所述式Ⅰ为链式化合物或环状化合物；

其中，

2.如权利要求1所述的多肽衍生物，其特征在于，当式Ⅰ为链式化合物时，X为葡萄糖、半乳糖、葡萄糖胺和半乳糖胺。

3.如权利要求1所述的多肽衍生物，其特征在于，式Ⅰ选自以下化合物：

T1：glu-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe；

T2；gal-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe；

T3：

4.一种制备如权利要求1所述的多肽衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

当式Ⅰ化合物为链式结构时，方法如下：

(1)合成CTC树脂

(2)氨基酸对接

脱Fmoc：加3倍树脂体积的20％PIP/DMF溶液，鼓氮气60分钟，然后用DMF洗涤得到H₂N-Phe-CTC Resin；

(4)多肽糖基化

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(5)中混合溶液比例为三氟乙酸：三异丙基硅烷：水：二硫苏糖醇＝90：5：2.5：2.5。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，CTC Resin和Fmoc-Phe-OH的摩尔比为3:4。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，Fmoc-Phe-CTC Resin、Fmoc-His-OH的摩尔比为1:7。

8.一种制备如权利要求1所述的多肽衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

当式Ⅰ化合物为环状结构时，方法如下：

(1)合成CTC树脂

(2)氨基酸对接

脱Fmoc：加3倍树脂体积的20％PIP/DMF溶液，鼓氮气60分钟，然后用DMF洗涤得到H₂N-Cys-CTC Resin；

(4)用三氟乙酸、三异丙基硅烷、水和二硫苏糖醇的混合溶液从树脂中裂解肽，用冰冷的乙醚沉淀；将多肽溶解在乙腈：水＝1:1的溶液中，并通过反相高压液相色谱进行纯化，得多肽Cys-Arg-Arg-Lys-Lys-Trp-Leu-Val-Phe-Phe-Val-Ile-Phe-Tyr-Phe-Phe-Arg-Cys；

(5)将步骤(4)制备的多肽溶于水中，缓慢滴加溶有碘的甲醇溶液，HPLC监测反应结束；制备液相纯化后得式Ⅰ化合物。

9.一种如权利要求1所述的多肽衍生物在制备抑制PDL1活性药物中的应用。

10.一种如权利要求1所述的多肽衍生物在制备抑制炎症药物中的应用。