CN116478862A - 一株降解黄曲霉毒素的菌株、制剂及降解黄曲霉毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株降解黄曲霉毒素的菌株、制剂及降解黄曲霉毒素的方法，属于黄曲霉毒素脱毒技术领域。本发明降解黄曲霉毒素的菌株为长野雷夫松氏菌(Leifsonia shinshuensis)AG29，该菌于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26548。使用该菌株AG29制备发酵液或发酵上清液，并将其添加到含黄曲霉毒素B1的样品中，37℃孵育72h能够降解92.3％的黄曲霉毒素B1，对花生粕样品中的黄曲霉毒素B1也具有较高的降解效率。
Description
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素脱毒技术领域，具体涉及一株降解黄曲霉毒素的菌株、制剂及降解黄曲霉毒素的方法。
背景技术
长野雷夫松氏菌是Leifsonia属的微生物，目前对于该菌株的研究较少，主要集中在对重金属离子的吸附和对植物的益生作用等方面，目前关于该菌对黄曲霉毒素的降解作用未见报道。
黄曲霉毒素(Aflatoxin)是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)等真菌产生的次级代谢物。具有极强的致畸、致癌、致突变性，广泛污染花生、玉米、棉籽、稻谷、干果、牛奶等农产品和食品。常用的脱除AFB1方法主要是物理法和化学法。物理法包括有挑拣、漂洗、高温加热、辐射法、溶剂萃取等方法，这些方法或者耗费大量人力物力效率不高，或者会破坏农产品的营养成分。微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1，该脱毒法对原料无污染，具有高度专一性，同时避免毒素重新产生，具有降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。筛选对黄曲霉毒素具有降解作用的微生物菌株，为黄曲霉毒素的安全、高效降解提供技术支持。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株降解黄曲霉毒素的菌株、制剂及降解黄曲霉毒素的方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株长野雷夫松氏菌，所述长野雷夫松氏菌为长野雷夫松氏菌(Leifsoniashinshuensis)AG29，该菌于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26548。
保藏编号为CGMCC No.26548的长野雷夫松氏菌AG29在黄曲霉毒素降解中的应用。
一种降解黄曲霉毒素的方法，是向待降解的样品中添加保藏编号为CGMCCNo.26548的长野雷夫松氏菌AG29的发酵液或发酵上清液，混匀后，孵育。
在一个具体的实施例中，所述长野雷夫松氏菌AG29的发酵液由以下方法制备而成：
将长野雷夫松氏菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.3×108cfu/mL，即得。
在一个具体的实施例中，所述长野雷夫松氏菌AG29的发酵液上清液由以下方法制备而成：
将长野雷夫松氏菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.3×108cfu/mL，经过5000g离心后获得发酵上清液。
在一个具体的实施例中，所述待降解样品为花生粕。
在一个具体的实施例中，所述的黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1。
在一个具体的实施例中，所述的孵育为37℃，孵育72h。
保藏编号为CGMCC No.26548的长野雷夫松氏菌AG29在制备黄曲霉毒素降解剂中的应用。
一种降解黄曲霉毒素的制剂，含有保藏编号为CGMCC No.26548的长野雷夫松氏菌AG29的发酵液或发酵上清液。
本发明技术方案的优点
本发明分离获得一株长野雷夫松氏菌(Leifsonia shinshuensis)AG29，该菌于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26548。使用该菌株AG29制备发酵液或发酵上清液，并将其添加到含黄曲霉毒素B1的样品中，37℃孵育72h能够降解92.3％的黄曲霉毒素B1，对花生粕样品中的黄曲霉毒素B1也具有较高的降解效率。
附图说明
图1菌株AG29的菌落形态。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1菌种的分离、纯化和鉴定
(1)分离纯化
2017年7月采集青岛地区的土壤样品，在超净台中取1g土壤悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取100μL悬浮液涂布在LB固体平板上，放置于37℃进行培养，3天后平板上长出多个菌落，根据颜色和形态不同，挑取菌落在LB固体平板上进行划线纯化，经过3次划线纯化后，分析降解AFB1的效率，其中编号为AG29菌株降解效率较高。
(2)菌株的鉴定
形态特征：菌株AG29在LB培养基上单菌落凸起，黄色，不透明(图1)，在37℃培养2天后，菌落约为4-6mm。
生物学特征：革兰氏染色为阳性，能水解利用淀粉、吐温40、吐温80。
16S rRNA基因分析：采用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，测序得到的基因序列(SEQ ID NO:1)。根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较，菌株AG29的16SrRNA基因与标准菌株Leifsonia shinshuensis JCM 10591T的16S rRNA基因同源性为超过99％，基因分析表明该菌为长野雷夫松氏菌(Leifsonia shinshuensis)。
SEQ ID NO:1(5’→3’)
基于形态特征、生物学生理生化特征和16S rRNA基因序列特征，将菌株AG29鉴定为长野雷夫松氏菌(Leifsonia shinshuensis)。该菌已于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.26548。
实施例2
长野雷夫松氏菌AG29对黄曲霉毒素B1的降解作用
一、黄曲霉毒素B1的配制
将1mg黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品溶解于20ml色谱级甲醇中，配制浓度为50ppm的AFB1贮存溶液。取0.5ml 50ppm的AFB1，加入4.5ml色谱级甲醇，配制浓度为5000ppb的AFB1工作母液。
二、长野雷夫松氏菌AG29对AFB1的降解
将菌株AG29接种于LB液体发酵培养基(g/L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，pH 7.0，在37℃的摇床上培养2天。取1.96mL的AG29菌液(菌浓度为3.3×108cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后10000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液；以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB1工作母液作为对照组，记作对照组溶液。
三、37℃条件下长野雷夫松氏菌AG29对AFB1的降解能力分析
采用黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒(北京华安麦科生物技术有限公司，批号20210609)检测试验组和对照组的AFB1含量，并计算菌株J15对AFB1降解效果。结果表明，试验组中AFB1含量为3.8ppb，对照组中AFB1含量为49.6ppb。经计算，37℃，72h条件下菌株AG29对AFB1降解效果较好，降解率为92.3％。
实施例3
长野雷夫松氏菌AG29对花生样品中黄曲霉毒素的降解作用
以黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品为对象，检测长野雷夫松氏菌AG29对花生粕中黄曲霉毒素的降解情况，具体步骤为：
对照组：取黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品20g，经过灭菌处理后，加入10mL的灭菌的LB培养基。
试验组1：取黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品20g，经过灭菌处理后，加入10mL的LB培养基发酵培养的AG29菌液(菌浓度为5.1×108cfu/mL)。AG29菌液制备方法：将菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥5.1×108cfu/mL。
试验组2：取黄曲霉毒素B1超标的花生粕样品20g，经过灭菌处理后，加入10mL的AG29发酵上清液。AG29发酵上清液制备方法：将AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥5.1×108cfu/mL，经过5000g离心后获得发酵上清液。
将上述三组避光37℃孵育72h后，采用黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒(北京华安麦科生物技术有限公司，批号20210609)检测三者样品中黄曲霉毒素含量。结果显示，对照组：花生粕样品中黄曲霉毒素B1的含量为146ppb；试验组1：加入菌株AG29菌液孵育后，黄曲霉毒素B1含量明显降至16ppb；试验组2：加入菌株AG29发酵上清液孵育后，黄曲霉毒素B1含量明显降至18ppb。经过菌株AG29菌液孵育处理，花生粕中的黄曲霉毒素B1可显著降低89.0％；经过菌株AG29菌液或发酵上清液孵育处理，花生粕中的黄曲霉毒素B1可显著降低87.7％。因而，本发明的菌株AG29菌液或发酵上清液能显著降解黄曲霉毒素超标的花生样品中的黄曲霉毒素B1。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一株长野雷夫松氏菌，其特征在于，所述长野雷夫松氏菌为长野雷夫松氏菌(Leifsonia shinshuensis)AG29，该菌于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26548。
2.保藏编号为CGMCC No.26548的长野雷夫松氏菌AG29在黄曲霉毒素降解中的应用。
3.一种降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，向待降解的样品中添加保藏编号为CGMCCNo.26548的长野雷夫松氏菌AG29的发酵液或发酵上清液，混匀后，孵育。
4.根据权利要求3所述降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述长野雷夫松氏菌AG29的发酵液由以下方法制备而成：
将长野雷夫松氏菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.3×108cfu/mL，即得。
5.根据权利要求3所述降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述长野雷夫松氏菌AG29的发酵液上清液由以下方法制备而成：
将长野雷夫松氏菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.3×108cfu/mL，经过5000g离心后获得发酵上清液。
6.根据权利要求3-5任一项所述降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述待降解样品为花生粕。
7.保藏编号为CGMCC No.26548的长野雷夫松氏菌AG29在制备黄曲霉毒素降解剂中的应用。
8.一种降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于，所述制剂含有保藏编号为CGMCCNo.26548的长野雷夫松氏菌AG29的发酵液或发酵上清液。
9.根据权利要求8所述降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于，所述长野雷夫松氏菌AG29的发酵液由以下方法制备而成：将长野雷夫松氏菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.3×108cfu/mL，即得。
10.根据权利要求8所述降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于，所述长野雷夫松氏菌AG29的发酵液上清液由以下方法制备而成：
将长野雷夫松氏菌AG29接种到LB液体发酵培养基中，37℃的振荡培养至菌浓度≥3.3×108cfu/mL，经过5000g离心后获得发酵上清液。
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