CN117721038A - 生防菌株e16及其在防治黄曲霉菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生防菌株E16及其在防治黄曲霉菌中的应用，属于微生物技术领域。本发明所述的生防菌株E16为毕节假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28246。该菌株对黄曲霉菌具有较好的抑制效果，其菌悬液或发酵上清液均能够显著降低贮存期黄曲霉菌对花生籽粒的侵染，延长花生的贮存期。除了对黄曲霉菌具有较好的拮抗和抑制作用外，本发明的生防菌株E16还能够高效降解黄曲霉毒素，从而在黄曲霉毒素的生物降解中具有较好的应用前景。

Description

生防菌株E16及其在防治黄曲霉菌中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及生防菌株E16及其在防治黄曲霉菌中的应用。

背景技术

黄曲霉属于半知菌类，是一种常见腐生真菌。多见于发霉的花生、玉米、饲料等粮油食品中。菌落生长较快，结构疏松，在不同培养基上颜色不同。菌体由许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗(一般为双层)，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。黄曲霉的有些菌系能产生黄曲霉毒(aflatoxins)，不仅可引起中毒性肝炎、肝硬化、肝癌，甚至导致死亡，严重危害人和动物健康。黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，黄曲霉毒素存在于土壤，动植物，各种坚果，特别是花生和核桃中。黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关。黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构，是产生毒性的重要结构。研究表明，黄曲霉毒素的细胞毒作用，是干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害。

目前对于黄曲霉菌的防治方法主要有物理法、化学法和生物法；生物方法因其安全、高效而受到广泛关注；目前已有现有技术通过分离纯化获得多种微生物如黄曲霉拮抗菌、不产毒黄曲霉等用于黄曲霉的生物防治。然而，现有微生物存在培养条件复杂，对黄曲霉的拮抗效果较差等问题。

对于黄曲霉菌污染所产生的黄曲霉毒素，目前常用的脱除方法主要是物理法和化学法。物理法包括有挑拣、漂洗、高温加热、辐射法、溶剂萃取等方法，这些方法不仅耗费大量人力物力效率不高，而且会破坏农产品的营养成分。化学法是利用一些氧化剂、氢氧化钠等化学试剂与毒素反应造成毒素降低，但有很大的局限性，很多试剂对操作人员的皮肤、眼睛、呼吸道造成伤害，并且化学试剂残留不易去除，影响农产品和食品的质量安全。相比之下，微生物脱毒法成为近年来的研究热点，该方法主要是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物去除食品中污染的黄曲霉毒素，该脱毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，降解条件温和、特异性强和脱毒效率高等优点，因此是一种高效、安全的去毒方法。此外，微生物不同，脱毒效率也存在明显不同，很多微生物对黄曲霉毒素的去除效率较低，因此，寻找一种脱毒效率较高的菌株具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种生防菌株E16，所述菌株为毕节假单胞菌(Pseudomonasbijiensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.28246。

本发明提供了上述生防菌株E16在黄曲霉菌防治中的应用。

本发明提供了上述生防菌株E16在降解黄曲霉毒素中的应用；所述黄曲霉毒素优选为黄曲霉毒素B₁、B₂中的至少一种。

本发明提供了上述生防菌株E16在制备防治黄曲霉菌和/或降解黄曲霉毒素的制剂中的应用。

一种防治黄曲霉菌和/或降解黄曲霉毒素的制剂，所述制剂含有上述生防菌株E16、其菌悬液、其全培养液培养物及其发酵上清液中的任何一种。

当所述制剂中含有生防菌株E16菌悬液或者全培养液培养物时，所述生防菌株E16的含量≥2.9×10⁸cfu/mL。

本发明提供了一种上述生防菌株E16全培养液培养物的制备方法，步骤如下：

将生防菌株E16接种到LB液体培养基中，活化菌株，然后向新的LB液体培养基中接入活化后的生防菌株E16菌液，培养至菌液浓度≥2.9×10⁸cfu/mL，获得生防菌株E16全培养液培养物。

本发明提供了一种上述生防菌株E16菌悬液的制备方法，步骤如下：

将上述生防菌株E16全培养液培养物离心，分离得到菌体，然后将菌体经无菌水洗涤后离心，再加入无菌水悬浮菌体，使菌浓度≥2.9×10⁸cfu/mL，获得生防菌株E16菌悬液。

本发明提供了一种上述生防菌株E16发酵上清液的制备方法，步骤如下：

将生防菌株E16全培养液培养物离心，分离得到上清液，再将上清液经过0.22μm滤膜过滤，获得生防菌株E16发酵上清液。

上述制剂能够防止黄曲霉菌侵染花生，基于此，本发明提供了上述制剂在延长花生贮存期中的应用。

本发明提供了一种延长花生贮存期的方法，步骤如下：向花生籽粒表面喷洒上述制剂，喷洒后阴凉晾干，置于室温下，通风干燥贮存，以延长花生贮存期。

上述制剂的喷洒量优选为4mL/40g花生籽粒。

本发明提供了一种降解黄曲霉毒素的方法，步骤如下：将生防菌株E16添加到待降解的样品中，在37℃条件下孵育72h，以实现黄曲霉毒素的降解。

上述待降解的样品，可选自花生粕。

本发明的有益效果为：

本发明提供的生防菌株E16，对黄曲霉菌具有较好的抑制效果，其菌悬液或发酵上清液均能够显著降低贮存期黄曲霉菌对花生籽粒的侵染，延长花生的贮存期。除了对黄曲霉菌具有较好的拮抗和抑制作用外，本发明的生防菌株E16还能够高效降解黄曲霉毒素，在37℃下对黄曲霉毒素B₁的降解率高达80％以上，从而在黄曲霉毒素的生物降解中具有较好的应用前景。

附图说明

图1为菌株E16菌落形态；

图2为菌株E16拮抗黄曲霉菌平板对峙结果。

具体实施方式

本发明所采用的材料如下：

黄曲霉NRRL 3357(Aspergillus flavus NRRL 3357标准菌株)，由中山大学贺竹梅教授提供。PDA固体培养基配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。LB液体发酵培养基(g/L)：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，pH 7.0。ELISA检测试剂盒：北京华安麦科生物技术有限公司，批号20230529。

菌种分离与鉴定：

2023年4月采集青岛地区的土壤样品，在超净台中取0.5g土壤悬浮在10mL无菌水中，震荡稀释制备土壤悬浊液，然后用无菌蒸馏水稀释100倍。取200μL稀释后的土壤悬浊液涂布在LB固体平板上，放置于28℃进行培养，2天后平板上长出多个菌落，根据颜色和形态不同，经过3次划线纯化后，筛选获得一株纯菌，编号为菌株E16。

按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株E16进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：

形态学特征：菌株E16在LB培养基上单菌落圆形，光滑，凸起，不透明，如图1所示。

生物学特征：革兰氏染色为阴性，具有明胶酶和过氧化氢酶。

基因学特征：

提取E16的细菌基因组DNA，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，引物序列如下所示：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:2)；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:3)。

25μL反应体系：10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，Taq聚合酶0.2μL，引物27F和1492R各1μL，菌株E16基因组模板1μL，ddH₂O 17.3μL。

反应条件：95℃预变性10min；95℃变性60s；50℃退火60s；72℃延伸90s；共35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物经测序获得1414bp基因序列，如SEQ ID NO:1所示：

16S rRNA(SEQ ID NO:1)：

ACACATGCAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGTCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCACGG

根据EzTaxon-eserver数据库标准菌株序列同源性比较，菌株E16的16S rRNA基因与标准菌株Pseudomonas silesiensis A3^T的16S rRNA基因同源性为100％，表明该菌为毕节假单胞菌。

基于形态特征、生物学生理生化特征和基因序列特征，最终将菌株E16鉴定为毕节假单胞菌(Pseudomonas bijiensis)。该菌已于2023年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.28246。

本发明所采用的其它材料，如无特殊声明，均可通过市售渠道获得。本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1黄曲霉菌抑菌试验

采用平板对峙培养法，测试菌株E16对黄曲霉菌的抑制作用，具体方法如下：

取10μL黄曲霉NRRL 3357孢子液(孢子液浓度为7.5×10⁵个/mL)接种于PDA培养基固体平板，将50μL菌株E16菌液(浓度2.9×10⁸cfu/mL)接种在黄曲霉菌周围；进行抑菌试验，在28℃培养箱中静置培养7天。

试验结果如图2所示：平板上方为菌株E16，下方为黄曲霉菌，靠近菌株E16的黄曲霉菌落明显被抑制。

实施例2黄曲霉毒素降解试验

在37℃条件下测试菌株E16对黄曲霉毒素B₁的降解作用，具体步骤如下：

(1)黄曲霉毒素B₁的配置

将1mg黄曲霉毒素B₁(AFB₁)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中，配置浓度为50ppm的AFB₁贮存溶液。取0.5mL 50ppm的AFB₁，加入4.5mL色谱级甲醇，配置浓度为5000ppb的AFB₁工作母液。

(2)菌株E16对AFB₁的降解

将菌株E16接种于LB液体发酵培养基，在37℃的摇床上培养2天。取1.96mL的E16菌液(菌浓度为2.9×10⁸cfu/mL)置于10mL样品管中，加入40μL 5000ppb的AFB₁工作母液至其终浓度为100ppb，颠倒混匀后37℃孵育72h，然后10000rpm离心5min获得上清，记作试验组溶液。以1.96mL不接菌的培养基加入40μL 5000ppb的AFB₁工作母液作为对照组，记作对照组溶液。

(3)37℃条件下菌株E16对AFB₁的降解能力分析

采用黄曲霉毒素B₁ ELISA检测试剂盒检测试验组和对照组的AFB₁含量，并计算菌株E16对AFB₁降解效果。

试验结果表明，试验组中AFB₁含量为17.6ppb，对照组中AFB₁含量为100ppb。经计算，在37℃、72h条件下菌株E16对AFB₁的降解率为82.4％。

实施例3花生侵染试验

菌株E16全培养液培养物：

取100μL菌株E16菌液接种到装有10mL的LB液体培养基试管中，培养12h活化菌株，向100mL LB液体培养基中接入活化的500μL菌液，在37℃震荡培养36-48h，菌液浓度为2.9×10⁸cfu/mL。

菌株E16菌悬液的制备：

取10mL的菌株E16全培养液培养物，菌液浓度为2.9×10⁸cfu/mL，经8000r/min离心10min后，分离得到菌体和上清液，将菌体经无菌水洗涤后离心，加入无菌水补齐至10mL，悬浮菌体获得菌株E16菌悬液。

取200g籽粒饱满、未被黄曲霉菌污染的花生，每100g一组，随机分为2组，每组设3个平行；向第一组花生表面喷洒灭过菌的LB培养基，喷洒量为2mL/20g，记为对照组；向第二组的花生表面喷洒培养的菌株E16菌悬液(浓度2.9×10⁸cfu/mL)，喷洒量为2mL/20g，记为试验组；上述各组花生于阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。每30天取样检测花生中黄曲霉菌的含量，共计90天，各组黄曲霉菌含量情况如表1所示。

表1黄曲霉菌含量(cfu/g)

天数	30d	60d	90d
				对照组	3.5×102	9.8×104	7.3×106
试验组	未检出	1.3	3.2×102

由表1可知，随着时间的增加，试验组中黄曲霉菌的含量远远少于对照组中的含量，因而，喷洒菌株E16菌悬液能够有效地防止花生被黄曲霉菌所污染，延长花生的贮存期。

实施例4发酵上清液抑菌试验

菌株E16发酵上清液：

取菌株E16菌液接种到LB液体培养基中，培养12h活化菌株；然后向新的LB液体培养基中接入活化的菌株E16菌液，在37℃震荡培养36-48h，至菌液浓度2.9×10⁸cfu/mL。菌液经过8000rpm离心10min后，再经过0.22μm滤膜过滤后，制备获得菌株E16发酵上清液。

取200g新收获、籽粒饱满、未被黄曲霉菌污染的花生，每100g一组，随机分为2组，每组设3个平行；向第一组花生表面喷洒灭过菌的LB培养基，喷洒量为2mL/20g，记为对照组；向第二组的花生表面喷洒培养的菌株E16发酵上清液，喷洒量为2mL/20g，记为试验组；上述各组花生于阴凉晾干后，置于室温下，通风干燥贮存。每30天取样检测花生中黄曲霉菌的含量，共计90天，各组黄曲霉菌含量情况如表2所示。

表2黄曲霉菌含量(cfu/g)

天数	30d	60d	90d
				对照组	3.6×102	3.1×105	2.7×107
试验组	未检出	102	5.2×102

由表2可知，随着时间的增加，试验组中黄曲霉菌的含量远远少于对照组中的含量；由此可见，喷洒菌株E16的发酵上清液也能够有效地防止花生被黄曲霉菌所污染，延长花生贮存期。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种生防菌株E16，其特征在于，所述菌株为毕节假单胞菌(Pseudomonas

bijiensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.28246。

2.权利要求1所述生防菌株E16在黄曲霉菌防治中的应用。

3.权利要求1所述生防菌株E16在降解黄曲霉毒素中的应用。

4.权利要求1所述生防菌株E16在制备防治黄曲霉菌和/或降解黄曲霉毒素的制剂中的应用。

5.一种防治黄曲霉菌和/或降解黄曲霉毒素的制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述生防菌株E16、其菌悬液、其全培养液培养物及其发酵上清液中的任何一种。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述生防菌株E16菌悬液或者全培养液培养物中生防菌株E16的含量≥2.9×10⁸cfu/mL。

7.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述全培养液培养物、菌悬液以及发酵上清液分别由如下方法制备而成：

全培养液培养物的制备方法，步骤如下：

将生防菌株E16接种到LB液体培养基中，活化菌株，然后向新的LB液体培养基中接入活化后的生防菌株E16菌液，培养至菌液浓度≥2.9×10⁸cfu/mL，获得生防菌株E16全培养液培养物；

菌悬液的制备方法，步骤如下：

将生防菌株E16全培养液培养物离心，分离得到菌体，然后将菌体经无菌水洗涤后离心，再加入无菌水悬浮菌体，使菌浓度≥2.9×10⁸cfu/mL，获得生防菌株E16菌悬液；

发酵上清液的制备方法，步骤如下：

将生防菌株E16全培养液培养物离心，分离得到上清液，再将上清液经过0.22μm滤膜过滤，获得生防菌株E16发酵上清液。

8.权利要求5所述制剂在延长花生贮存期中的应用。

9.一种延长花生贮存期的方法，其特征在于，步骤如下：向花生籽粒表面喷洒权利要求5所述的制剂，喷洒后阴凉晾干，置于室温下，通风干燥贮存，以延长花生贮存期。

10.一种降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤如下：将权利要求1所述的生防菌株E16添加到待降解的样品中，在37℃条件下孵育72h，以实现黄曲霉毒素的降解。