CN116478238B

CN116478238B - 用于促进根瘤生长的脂肽组合物

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Publication number: CN116478238B
Application number: CN202310266693.8A
Authority: CN
Inventors: 陈博; 马玉超; 王苗苗; 李亚涛; 董玥; 郭雪梅; 翟柯尧; 石伶俐; 吕镇
Original assignee: Beijing Yanwei Technology Co ltd; Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Yanwei Technology Co ltd; Beijing Forestry University
Priority date: 2023-03-15
Filing date: 2023-03-15
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2043-03-15
Also published as: WO2024188048A1; CN116478238A

Abstract

本发明涉及一种用于农业，特别是促进根瘤生长的组合物，所述组合物包含0.001‑100 g/L的脂肽。本发明还涉及所述组合物用于促进根瘤生长的用途。具体地，与不施用所述组合物的对照组相比，施用了本发明的组合物的每种植株的根瘤数量和根瘤重量都有显著的增加。

Description

用于促进根瘤生长的脂肽组合物

技术领域

本发明涉及生物技术和生物化工领域，具体地涉及脂肽组合物及其用于促进根瘤生长的用途。

背景技术

脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一类由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸链以内酯键连接而成的两性物质，主要由芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)等微生物合成，具有抗菌、抗病毒等生物活性。

根据肽环中氨基酸种类、数目以及成环基团不同，芽孢杆菌脂肽可分为表面活性素、芬芥素（也称作丰原素）、伊枯草菌素等。典型的，表面活性素由长度为12-17个碳原子的β-羟基脂肪酸与7个α-氨基酸组成。芬芥素由长度为14-17个碳原子的β-羟基脂肪酸与10个氨基酸组成。伊枯草菌素由长度为14-17个碳原子的β-氨基脂肪酸与七元肽的肽链组成。

共生固氮是自然界植物与微生物互作的特殊现象，对于农业生产意义重大。目前在豆科、大麻科植物或者其他通过与微生物共生来固氮的植物的栽培管理中，主要通过改善植物的生长环境来增加根瘤的数量，从而提高根瘤的固氮能力，主要分为化学、农业和生物措施：化学措施是指在栽培过程中增施化工氮肥；农业措施包括增施有机肥料、增加中耕次数、适当灌水、合理补施微肥和调整土壤酸碱度等；生物措施一般指用根瘤菌剂拌种栽培，研发工程固氮微生物，使其协助植物进行固氮作用，促进植物生长。

在上述措施中，长期使用化工氮肥除影响氮肥利用率外，过量使用会破坏环境并产生大量碳排放。农业措施跟进得当会使根瘤数量少量增加，但容易受到气候不可控和管理时机的把控不精准等影响，这些因素会导致根瘤形成时机不当及植物固氮能力弱等结果。

根瘤菌剂拌种(根瘤菌发酵液与基质混拌)方法在从未种植过豆科作物的土壤上使用可以具有增产效果。但拌种过程中，草炭等基质灭菌复杂，易染杂菌，根瘤菌含量不稳，无法保障菌剂拌种质量，农业广泛使用受限。面对这一问题，很多地区豆科种子播种前，使用杀虫剂和杀菌剂作为种衣剂进行种子处理，而大多数农药对根瘤菌有毒害作用，直接导致拌种根瘤菌剂和杀虫杀菌两种种衣功能相冲突，这也是当前根瘤菌剂广泛应用的瓶颈问题。

为了解决目前促进植物及其固氮共生体生长中的各种问题，本领域亟需一种既能够促进植物根瘤形成数量以及根瘤重量，又对环境友好、能够尽量减少化学污染和生物污染、长期使用无危害的新型组合物。

[参考文献]

1. CN201580077068.2；

2. IN201717025497；

3. ARP20150103136；

4. CN201310561701.8。

发明内容

具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。

1. 一种用于促进根瘤生长的组合物，其含有：

(i) 0.001-100 g/L的脂肽；和

(ii) 助剂。

2. 根据项1所述的组合物，其中所述脂肽为环状或线形脂肽，优选所述环状脂肽具有下式(I)-(III)之一：

(I)

(II)

(III)

其中R表示脂肪酸链的碳链，A₁、A₂、A₃…A_m分别表示肽链上的第1、第2、第3…第m个氨基酸，脂肪酸的羧基与A₁的N-端相连，A_m的C-端羧基又与脂肪酸或者肽链上其他氨基酸的羟基或氨基相连形成环状结构；

所述线形脂肽为所述环状脂肽开环后得到的线形产物。

3. 根据项1或2所述的组合物，其中所述脂肽为选自下组的一种或多种：表面活性素家族、伊枯草菌素家族和芬芥素家族；优选地所述脂肽为选自下组的一种或多种：表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬芥素(fengycin)、地衣素(lichenysin)、巴比伦素(bamylocin)、帕米拉素(pumilacidin)、芽孢菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipastatin)、杀镰孢菌素(fusaricidin)、库尔斯塔克素(kurstakin)、类芽孢杆菌素(paenibacterin)、多粘菌素(polymyxin)、八肽霉素(octapeptin)、杆农素(bacaucin)和多肽菌素(polypeptin)。

4. 根据项1-3中任一项所述的组合物，其中所述脂肽是由细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生的，优选所述细菌是野生菌或基因工程菌，更优选所述细菌选自下组：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)，更优选所述放线菌选自下组：链霉菌属(Streptomycetaceae)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)和微杆菌属(Microbacterium)，更优选所述真菌选自下组：曲霉属(Aspergillus)，微囊菌属(Microascus)，孢霉属(Stachylidium)，漆斑菌属(Myrothecium)，帚枝霉属(Sarocladium)，线孢小球腔菌属(Ophiosphaerella)和冠芒孢霉属 (Clavariopsis)，更优选所述蓝细菌选自下组：海洋蓝细菌属(Okeania)、石蕊属(Cladonia)和青菌属(Moorea)，更优选所述脂肽是通过培养芽孢杆菌或假单胞菌得到，更优选所述脂肽是通过培养芽孢杆菌并调控脂肽合成相关基因的表达而得到的脂肽，更优选所述脂肽合成相关基因选自下组：脂肽合成基因、跨膜运输蛋白基因ycxA、生物素羧化酶基因yngH、芽孢合成基因spoIVA/ B/C/F、spoVA/B/D/E和亮氨酸合成途径基因leuABCD/ilvK。

5. 根据项4所述的组合物，其中所述脂肽合成基因选自下组：表面活性素合成基因srfA、芬芥素合成基因fen、地衣素合成基因lic、芽孢菌霉素合成基因bam、抗霉枯草菌素myc、伊枯草菌素合成基因itu、制磷脂菌素合成基因pps、杀镰孢菌素fus、库尔斯塔克素krs、多粘菌素pmx和八肽霉素oct。

6. 根据项1-5中任一项所述的组合物，其进一步含有0.01-99.99重量%的选自下组的一种或多种组分：多糖、寡糖、糊精、氨基酸、寡肽、蛋白质、类脂、脂肪酸或其衍生物、无机盐、分散剂、润湿剂、聚合物和警戒色试剂。

7. 根据项1-6中任一项所述的组合物，其中所述组合物为培养能够产生脂肽的细菌得到的培养液。

8. 根据项1-7中任一项所述的组合物，所述根瘤是通过与植物共生的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生的，其中所述细菌优选选自α、β或γ-变形菌纲，更优选选自下组：根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、剑菌属(Ensifer)、申氏杆菌属(Shinella)、新根瘤菌属(Neorhizobium)、伴根瘤菌属(Pararhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、叶瘤杆菌属(Phyllobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微枝形杆菌属(Microvirga)、苍白杆菌属(Ocrhobactrum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、德沃斯氏菌属(Devosia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、贪铜菌属(Cupriavidus)和假单胞菌属(Pseudomonas)；所述放线菌优选为弗兰克氏菌(Frankia)；所述真菌优选为子囊菌(Ascomycetes)和担子菌(Basidiomycetes)；所述蓝细菌优选为念珠菌属(Candida)和鱼腥属(Anabaena)。

9. 根据项8所述的组合物，其中所述根瘤是通过与植物共生的细菌产生的，所述植物为豆科或大麻科植物，优选选自下组：大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、赤豆、豇豆、菜豆、扁豆、木豆、黑豆、鹰嘴豆、落花生、紫云英、苜蓿、翘摇、合欢、黄檀、皂角、格木、槐、马棘、木蓝、苏木、阿拉伯胶树、黄芪、柯伯胶树、菽麻、葛藤、山黄麻、山豆麻。

10. 根据项8所述的组合物，所述根瘤是通过与植物共生的弗兰克氏菌、蓝细菌或真菌产生的，所述植物选自下组：桦木科、木麻黄科、杨梅科、鼠李科、胡颓子科、野麻科、马桑科、蔷薇科、苔藓类、蕨类和苏铁类植物、念珠藻属、共球藻属、橘色藻属、伪枝藻属和真枝藻属藻类。

11. 一种制备项1-10中任一项所述的组合物的方法，其包括：

在适于产生脂肽的条件下培养能够产生脂肽的细菌以得到含有0.001-100 g/L脂肽的培养液，并将所述培养液作为所述组合物；或者

将纯化或部分纯化的脂肽配制成含有0.001-100 g/L脂肽的溶液或固体混合物，并将所述溶液或固体混合物作为所述组合物。

12. 根据项11所述的方法，进一步包括：在所述培养液、溶液或固体混合物中添加0.01-99.99重量%的选自下组的一种多种成分：多糖、寡糖、糊精、氨基酸、寡肽、蛋白质、类脂、脂肪酸或其衍生物、无机盐、分散剂、润湿剂、聚合物和警戒色试剂，并将所得到的产物作为所述组合物。

13. 根据项11或12所述的方法，进一步包括：

对所述培养液、溶液、固体混合物或产物进行浓缩和/或干燥和/或部分纯化，并将浓缩和/或干燥和/或部分纯化的产物作为所述组合物。

14. 一种使用项1-10中任一项所述的组合物促进根瘤生长的方法，其包括：

(1) 将所述组合物直接施用于与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的培养物中；

(2) 培养并收获所述植物；

(3) 任选地测量所述根瘤的参数，并将其和不施用所述组合物的对照组进行比较，优选地所述参数选自下组：每个植株的根瘤数目和根瘤重量。

15. 根据项14所述的方法，所述根瘤生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：

(1) 施用所述组合物培养的所述植物的每个植株的根瘤数目是所述对照组的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少6倍、更优选至少7倍；和/或

(2) 施用所述组合物培养的所述植物的每个植株的根瘤重量是所述对照组的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少6倍、更优选至少7倍。

16. 根据项14或15所述的方法，其同时促进与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的生长，优选所述植物生长的促进是通过地上部分植株高度、地上部分鲜重、地下部分鲜重、植物产品的数目或重量表征的，更优选是通过选自下组的一项或多项表征的：

(1) 施用所述组合物培养的植物的地上部分植株高度比所述对照组增加10%以上、优选15%以上、更优选20%以上、更优选25%以上、更优选30%以上、更优选35%以上、更优选36%以上；

(2) 施用所述组合物培养的植物的地上部分鲜重比所述对照组增加15%以上、优选20%以上、更优选25%以上、更优选30%以上、更优选35%以上、更优选40%以上、更优选45%以上、更优选47%以上；

(3) 施用所述组合物培养的植物的地下部分鲜重比所述对照组增加5%以上、优选8%以上、更优选10%以上、更优选12%以上；和/或

(4) 施用所述组合物培养的植物产品的数目或重量是所述对照组的至少1.1倍、优选至少1.3倍、更优选至少1.6倍、更优选至少1.9倍、更优选至少2.3倍、更优选至少3.0倍，优选所述植物产品选自下组：植物的果荚、果针和种子。

17. 根据项14-16中任一项所述的方法，其中所述施用选自下组：种子包被、浸种处理、鳞茎处理、灌根处理、滴灌处理和叶面喷施。

18. 根据项1-10中任一项所述的组合物用于促进根瘤生长的用途。

19. 根据项1-10中任一项所述的组合物用于农业肥料、农用助剂或农药中的用途。

20. 根据项1-10中任一项所述的组合物用于同时促进根瘤生长和与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的生长的用途。

为使本发明所述的技术方案更加清晰，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步的说明。

附图说明

图1所示为黄豆盆栽种植地上部分生长图；

图2所示为黄豆盆栽种植地下部分生长图；

图3所示为黄豆大田种植根系生长图；

图4所示为绿豆大田种植地上部分生长图；

图5所示为绿豆大田种植根瘤采摘图；

图6所示为赤豆产量对照图；和

图7所示为花生大田种植植物生长图。

发明详述

1. 定义

本发明使用的术语“脂肽(lipopeptide, peptidolipid)”，又名脂酰肽(acylpeptide)，通常指由脂肪酸和肽链以酯键或者酰胺键连接而成的肽，可分为环状脂肽(cyclic lipopeptide)和线形脂肽(linear lipopeptide)。环状脂肽是指具有环状结构的脂肽，脂肪酸的羧基与肽链上氨基酸的N-端相连，而肽链上氨基酸的C-端羧基又与脂肪酸或者肽链上其他氨基酸的羟基或氨基相连形成环状结构。环状脂肽的成环形式包括：脂肪酸羟基成环、脂肪酸氨基成环、脂肪酸接环或离环三种，其分别具有下式：

(I) 脂肪酸羟基成环

(II) 脂肪酸氨基成环

(III) 脂肪酸接环(A_m与A₁成环)或脂肪酸离环(A_m与除A₁之外的氨基酸成环)

线形脂肽为环状脂肽开环后得到的线形产物。

脂肽主要由细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生，优选由细菌产生，更优选由芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)或节杆菌属(Arthrobacter)等产生(参见Janek等, 2010)。已知的三大脂肽家族为表面活性素(surfactin)家族、伊枯草菌素(iturin)家族和芬芥素(fengycin)家族。脂肽可为选自下组的一种或多种：表面活性素、伊枯草菌素、芬芥素、地衣素、巴比伦素、帕米拉素、芽孢菌霉素、抗霉枯草菌素、制磷脂菌素、杀镰孢菌素、库尔斯塔克素、类芽孢杆菌素、多粘菌素、八肽霉素、杆农素和多肽菌素。它们之间的主要差别在于脂肪酸侧链长度、异构方式以及肽环的氨基酸种类、数目与连接顺序等。

表面活性素家族包含了超过20 种不同的分子，是由C_12-16的β-羟基脂肪酸与7个氨基酸缩合多肽通过内酯键形成的环肽(Bonmatin等, 2003)。七肽部分具有LLDLLDL的手性序列，并且第3、6位的D-Leu与第4位L-氨基酸的手性是严格保守的，在肽链闭合时起关键作用(Peypoux等, 1999)，而在第2、4 和7 位可发现Leu、Val、Ile、Ala 等氨基酸替换现象(Bonmatin等, 1995; Peypoux等, 1991; Peypoux等, 1994)，表面活性素的分子结构如下式(IV)所示：

(IV) 表面活性素的氨基酸序列和连接方式

伊枯草菌素家族至今已有6个主要成员：伊枯草菌素A、C，芽孢菌霉素D、F、L以及抗霉枯草菌素(Bonmatin等, 2003)。它们都是由C_14-17的β-氨基脂肪酸与7个氨基酸缩合多肽通过内酰胺键形成的环肽。伊枯草菌素家族的所有分子都严格遵从LDDLLDL的手性构象并且包含一段共同的氨基酸序列 β-氨基脂肪酸-L-Asx-D-Tyr-D-Asn (Peypoux等, 1978)。伊枯草菌素的分子结构如下式(V)所示：

(V) 伊枯草菌素的氨基酸序列和连接方式

芬芥素（也称为丰原素）家族继表面活性素家族与伊枯草菌素家族之后的第三大脂肽家族。芬芥素家族成员是由C_14-17的β-羟基脂肪酸通过酯键与十肽环肽的第1位Glu 连接形成，内酯键是由第3位Tyr的羟基与第10位Ile的碳末端形成(Nishikiori等, 1986)。芬芥素的分子结构如下式(VI)所示：

(VI) 芬芥素的氨基酸序列和连接方式

本发明中使用的术语“基因”、“表达增强”、“启动子”、“重组(菌)”、“培养液”等均为分子生物学领域使用的常规术语，具有与本领域技术所理解的相同的含义。

本发明使用的术语“根瘤”是指植物根系上生长的瘤状突起，其通过与植物共生的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生。所述细菌指与植物共生形成根瘤并能固氮的细菌，优选选自α、β和γ-变形菌纲，更优选选自下组：根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、剑菌属(Ensifer)、申氏杆菌属(Shinella)、新根瘤菌属(Neorhizobium)、伴根瘤菌属(Pararhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、叶瘤杆菌属(Phyllobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微枝形杆菌属(Microvirga)、苍白杆菌属(Ocrhobactrum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、德沃斯氏菌属(Devosia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)和贪铜菌属(Cupriavidus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。所述细菌在植物的根内定居，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈生长，使根的局部膨大形成根瘤，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供含氮养料，而植物又为根瘤提供养料和能源，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现出共生关系。根瘤在豆科植物生长过程中的固氮作用是其他任何技术或措施无法替代的。所述放线菌优选为弗兰克氏菌(Frankia)，其广泛分布在非豆科植物的根瘤内而与植物共生。弗兰克氏菌可包括以下四个类群：(1)与桦木科(桤木属)、木麻黄科(异木麻黄属和木麻黄属)和杨梅科共生的弗兰克氏菌(F. alni、F. casuarinae、F. Canadensis)；(2)与马桑科、野麻科、蔷薇科(仙女木亚科)，鼠李科(鼠李属)共生的弗兰克氏菌(Candidatus Frankia datiscae、Candidatus Frankia californiensis)；(3)与胡颓子科、鼠李科(腊质果族)、杨梅科，木麻黄科(Gynmmostoma)共生的弗兰克氏菌(F. elaeagni、F. irregularis)；和(4)其他弗兰克氏菌菌株(F. inefficax、F. asymbiotica、F. saprophytica)。所述真菌为子囊菌(Ascomycetes)和担子菌(Basidiomycetes)，能与藻类共生形成地衣。所述蓝细菌又名蓝藻，是一类进化历史悠久、革兰氏染色阴性、无鞭毛、含叶绿素a，但不含叶绿体(区别于真核生物的藻类)、能进行产氧性光合作用的大型单细胞原核生物。

本发明使用的术语“与根瘤菌共生的植物”包括豆科植物(Leguminosae)，其为双子叶植物纲、蔷薇目下的一科，可为乔木、灌木、亚灌木或草本，直立或攀援，常伴生有能固氮的根瘤菌。豆科植物是重要的经济作物，它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源。豆科植物包括但不限于：大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、赤豆、豇豆、菜豆、扁豆、木豆、黑豆、鹰嘴豆、落花生、紫云英、苜蓿、翘摇、合欢、黄檀、皂角、格木、槐、马棘、木蓝、苏木、阿拉伯胶树、黄芪、柯伯胶树、菽麻和葛藤。

本发明使用的术语“与根瘤菌共生的植物”包括大麻科植物(Cannabaceae)，其为双子叶植物纲、是蔷薇目下的一科。大麻科植物包括但不限于：白颜树属、糙叶树属、大麻属、非洲朴属、葎草属、朴属、青檀属、山赤麻属、山豆麻属和山黄麻属。

本发明使用的术语“与放线菌共生的植物”包括桦木科(Betulaceae)、木麻黄科(Casuarinaceae)、杨梅科(Myricaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、野麻科(Datiscaceae)、马桑科(Coriariaceae)和蔷薇科(Rosaceae)植物。

本发明所用的术语“与真菌共生的植物”包括念珠藻属(Nostoc)，共球藻属(Coccidium)、橘色藻属(Trentepohlia)、伪枝藻属(Scytonema)和真枝藻属(Eucladia)藻类等。

本发明所用的术语“与蓝细菌共生的植物”包括苔藓(Bryophytes)、槐叶萍科蕨类(Salviniaceae)或苏铁类(Cycadaceae)植物等。

本发明所用的术语“助剂”包括但不限于：固体制剂中的分散剂、润湿剂、粘合剂、警戒色、成膜剂和填料等，液体混合物中的溶剂、助溶剂、分散剂、润湿剂、乳化剂、成膜剂、防腐剂、抗氧化剂、矫味剂、芳香剂、警戒色等。

2. 本发明的脂肽

本发明的脂肽为环状脂肽或线形脂肽。在一个实施方案中，本发明的脂肽为具有下式(I)-(III)之一的环状脂肽：

(I)

(II)

(III)

其中R表示脂肪酸链的碳链，A₁、A₂、A₃…A_m分别表示肽链上的第1、第2、第3…第m个氨基酸，脂肪酸的羧基与A₁的N-端相连，A_m的C-端羧基又与脂肪酸或者肽链上其他氨基酸的羟基或氨基相连形成环状结构。在一个实施方案中，m为6-20的整数。在一个实施方案中，本发明的脂肽选自下组：表面活性素家族、伊枯草菌素家族和芬芥素家族。在一个实施方案中，本发明的脂肽为选自下组的一种或多种：表面活性素、伊枯草菌素、芬芥素、地衣素、巴比伦素、帕米拉素、芽孢菌霉素、抗霉枯草菌素、制磷脂菌素、杀镰孢菌素、库尔斯塔克素、类芽孢杆菌素、多粘菌素、八肽霉素和多肽菌素。在一个实施方案中，本发明的脂肽为表面活性素。在一个实施方案中，本发明的脂肽为伊枯草菌素。在一个实施方案中，本发明的脂肽为芬芥素。在一个实施方案中，本发明的脂肽为通过本发明的环状脂肽开环而形成的线形脂肽。

在一个方面，本发明涉及的脂肽是由细菌、放线菌、真菌和蓝细菌产生的。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由细菌产生的。在一个实施方案中，所述细菌是野生菌或基因工程菌。在一个实施方案中，所述细菌选自下组：芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和节杆菌属(Arthrobacter)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei)或类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei)产生的。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)产生的。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)或藤黄节杆菌(Arthrobacter luteus)产生的。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由放线菌产生的。在一个实施方案中，所述放线菌选自下组：链霉菌属(Streptomycetaceae)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)和微杆菌属(Microbacterium)。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由真菌产生的。在一个实施方案中，所述真菌选自下组：曲霉属(Aspergillus)、微囊菌属(Microascus)、孢霉属(Stachylidium)、漆斑菌属(Myrothecium)、帚枝霉属(Sarocladium)、线孢小球腔菌属(Ophiosphaerella)和冠芒孢霉属 (Clavariopsis)。在一个实施方案中，本发明的脂肽是由蓝细菌产生的。在一个实施方案中，所述蓝细菌选自下组：海洋蓝细菌属(Okeania)、石蕊属(Cladonia)和青菌属(Moorea)。

在一个实施方案中，本发明的脂肽是通过培养芽孢杆菌或假单胞菌得到的。在一个实施方案中，本发明的脂肽是通过培养芽孢杆菌并调控脂肽合成相关基因的表达而得到的。在一个实施方案中，所述脂肽合成相关基因选自下组：脂肽合成基因srfA、跨膜运输蛋白基因ycxA、生物素羧化酶基因yngH、芽孢合成基因spoIV A/B/C/F、spoV A/B/D/E和亮氨酸合成途径基因leuABCD/ilvK。在一个实施方案中，所述脂肽合成基因选自下组：表面活性素合成基因srfA、芬芥素合成基因fen、地衣素合成基因lic、芽孢菌霉素合成基因bam、抗霉枯草菌素myc、伊枯草菌素合成基因itu、制磷脂菌素合成基因pps、杀镰孢菌素fus、库尔斯塔克素krs、多粘菌素pmx和八肽霉素oct。在一个实施方案中，调控脂肽合成相关基因的表达选自下组：过表达脂肽合成基因(例如srfA基因)、过表达ycxA、过表达yngH、敲除spoIVA/B/C/F、敲除spoV A/B/D/E、过表达leuABCD和过表达ilvK。在一个实施方案中，过表达srfA基因是通过将天然启动子PsrfA被替换为Pg3启动子而获得。在一个实施方案中，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA。

3. 本发明的组合物

在一个方面，本发明涉及一种用于促进根瘤生长的组合物，其含有(i) 0.001-100g/L的脂肽和(ii)助剂。在一个实施方案中，所述助剂选自下组：溶剂、分散剂、润湿剂、聚合物和警戒色。在一个实施方案中，所述助剂为水。在一个实施方案中，所述组合物含有0.001g/L、0.002 g/L、0.003 g/L、0.004 g/L、0.005 g/L、0.006 g/L、0.007 g/L、0.008 g/L、0.009 g/L、0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L、0.06 g/L、0.07 g/L、0.08g/L、0.09 g/L、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L、60 g/L、65 g/L、70 g/L、75 g/L、80 g/L、85 g/L、90 g/L、95 g/L或100 g/L的脂肽。在一个实施方案中，所述组合物含有0.001-0.005 g/L、0.001-0.01 g/L、0.001-0.05 g/L、0.001-0.1 g/L、0.001-0.5 g/L、0.001-1.0 g/L、0.001-1.5 g/L、0.001-2.5 g/L、0.001-5 g/L、0.001-8 g/L、0.001-12g/L、0.001-18 g/L、0.001-20 g/L、0.001-30 g/L、0.001-40 g/L、0.001-50 g/L、0.001-60g/L、0.001-70 g/L、0.001-80 g/L或0.001-90 g/L的脂肽。在一个实施方案中，本发明的组合物进一步含有0.01-99.99重量%的选自下组的一种多种组分：多糖、寡糖、糊精、氨基酸、寡肽、蛋白质、类脂、脂肪酸或其衍生物、无机盐、分散剂、润湿剂、聚合物和警戒色试剂。在一个实施方案中，所述多糖选自下组：肽聚糖、纤维素、糖原、淀粉、壳多糖、多聚果糖、多聚半乳糖和糖胺聚糖。在一个实施方案中，所述氨基酸为常见α-氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸选自下组：丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，所述寡肽为2-10个氨基酸组成的肽、2-8个氨基酸组成的肽、2-6个氨基酸组成的肽。在一个实施方案中，所述寡肽选自下组：寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5和寡肽-6。在一个实施方案中，所述类脂选自下组：脂类化合物、磷脂、糖脂和胆固醇及其酯。在一个实施方案中，所述脂肪酸选自下组：饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，所述脂肪酸或其衍生物选自下组：硬脂酸、动物油脂和植物油脂。在一个实施方案中，所述无机盐选自下组：硫酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、磷酸盐、硝酸盐和过磷酸盐。在一个实施方案中，所述无机盐选自下组：钠盐、钾盐、钙盐、铁盐和铵盐。在一个实施方案中，所述无机盐选自下组：Na₂SO₄、K₂SO₄、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、K₃PO₄、CO(NH₂)₂、NH₄NO₃、NaNO₃、CaCl₂、FeCl₂、NH₄Cl、MnSO₄、FeSO₄、Ca(H₂PO₄)₂及其水合物。在一个实施方案中，所述分散剂选自下组：萘磺酸盐、木质素磺酸盐、聚羧酸盐及聚羧酸酯、淀粉、牛血清白蛋白、环糊精。在一个实施方案中，所述润湿剂选自下组：十二烷基磺酸盐、辛基琥珀酸盐、醇醚硫酸盐。在一个实施方案中，所述聚合物选自下组：聚乙二醇、聚丙烯酸乳液、聚丙烯酸聚乙烯醇乳液、黄原胶、聚谷氨酸。在一个实施方案中，所述警戒色试剂选自下组：胭脂红或果绿。在一个实施方案中，本发明的组合物为培养能够产生脂肽的细菌得到的含有0.001-100 g/L脂肽的培养液。在一个实施方案中，本发明的组合物为将纯化或部分纯化的脂肽配制成含有0.001-100 g/L脂肽的溶液或固体混合物。在一个实施方案中，本发明的组合物为含有脂肽的水溶液、浓缩物或干粉制剂。

在一个实施方案中，本发明所述的根瘤是通过与植物共生的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生的。在一个实施方案中，本发明所述的根瘤是通过与植物共生的细菌产生的。在一个实施方案中，所述细菌选自α、β或γ-变形菌纲，更优选选自下组：根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、剑菌属(Ensifer)、申氏杆菌属(Shinella)、新根瘤菌属(Neorhizobium)、伴根瘤菌属(Pararhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、叶瘤杆菌属(Phyllobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微枝形杆菌属(Microvirga)、苍白杆菌属(Ocrhobactrum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、德沃斯氏菌属(Devosia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、贪铜菌属(Cupriavidus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个实施方案中，本发明所述的根瘤是通过与植物共生的放线菌产生的。在一个实施方案中，所述放线菌优选为弗兰克氏菌(Frankia)，更优选选自下组：F. alni、F. casuarinae和F. Canadensis。在一个实施方案中，本发明所述的根瘤是通过与植物共生的真菌产生的。在一个实施方案中，所述真菌选自下组：子囊菌(Ascomycetes)和担子菌(Basidiomycetes)。在一个实施方案中，本发明所述的根瘤是通过与植物共生的蓝细菌产生的。在一个实施方案中，所述蓝细菌选自下组：念珠菌属(Candida)、鱼腥属(Anabaena)、伪枝藻属(Scytonema)和真枝藻属(Stigonema)。

在一个实施方案中，本发明的根瘤是通过与植物共生的细菌产生的。在一个实施方案中，所述植物为豆科或大麻科植物。在一个实施方案中，所述植物优选选自下组：大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、赤豆、豇豆、菜豆、扁豆、木豆、黑豆、鹰嘴豆、落花生、紫云英、苜蓿、翘摇、合欢、黄檀、皂角、格木、槐、马棘、木蓝、苏木、阿拉伯胶树、黄芪、柯伯胶树、菽麻、葛藤、山豆麻属和山黄麻属。

在一个实施方案中，本发明的根瘤是通过与植物共生的弗兰克氏菌或蓝细菌产生的。在一个实施方案中，所述植物选自下组：桦木科、木麻黄科、杨梅科、鼠李科、胡颓子科、野麻科、马桑科、蔷薇科、苔藓类、蕨类和苏铁类植物。在一个实施方案中，本发明的根瘤是通过与植物共生的真菌产生的。在一个实施方案中，所述植物为藻类。在一个实施方案中，所述藻类选自下组：念珠藻属、共球藻属和橘色藻属藻类。

4. 制备本发明的组合物的方法

在一个方面，本发明涉及一种制备本发明用于促进根瘤生长的组合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：在适于产生脂肽的条件下培养能够产生脂肽的细菌以得到含有0.001-100 g/L脂肽的培养液，并将所述培养液作为本发明的组合物；或者将纯化或部分纯化的脂肽配制成含有0.001-100 g/L脂肽的溶液或固体混合物，并将所述溶液或固体混合物作为本发明的组合物。在一个实施方案中，所述溶液为水溶液。在一个实施方案中，所述水溶液中的溶剂为去离子水或自来水。在一个实施方案中，所述方法进一步包括：在所述培养液、溶液或固体混合物中添加0.01-99.99重量%的选自下组的一种多种成分：多糖、寡糖、糊精、氨基酸、寡肽、蛋白质、类脂、脂肪酸或其衍生物、无机盐、分散剂、润湿剂、聚合物和警戒色试剂，并将所得到的产物作为本发明的组合物。在一个实施方案中，所述方法进一步包括：对所述培养液、溶液、固体混合物或产物进行浓缩和/或干燥和/或部分纯化，并将浓缩和/或干燥和/或部分纯化后的产物作为本发明的组合物。

5. 本发明用于促进根瘤生长的方法

在一个方面，本发明涉及一种使用本发明的组合物促进根瘤生长的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(1)将所述组合物直接施用于与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的培养物中，优选所述培养物为土壤；(2)培养并收获所述植物；(3)任选地测量所述根瘤的参数，并将其和不施用所述组合物的对照组进行比较。在一个实施方案中，所述参数选自下组：每个植株的根瘤数目和根瘤重量。在一个实施方案中，所述根瘤生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：(1)施用所述组合物培养的植物的每个植株的根瘤数目是不施用所述组合物的对照组的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、更优选至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少6.6倍、至少6.7倍、至少6.8倍、至少6.9倍、更优选至少7倍；和/或(2)施用所述组合物培养的植物的每个植株的根瘤重量是不施用所述组合物的对照组的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、更优选至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少6.6倍、至少6.7倍、至少6.8倍、至少6.9倍、更优选至少7倍。

在一个实施方案中，本发明的组合物在促进根瘤生长的同时还能够促进与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的生长。在一个实施方案中，所述植物生长的促进是通过选自下组的参数表征的：地上部分植株高度、地上部分鲜重、地下部分鲜重、植物产品的数目和重量。在一个实施方案中，所述植物生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：(1)施用所述组合物培养的植物的地上部分植株高度比所述对照组增加10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上、16%以上、17%以上、18%以上、19%以上、20%以上、21%以上、22%以上、23%以上、24%以上、25%以上、26%以上、27%以上、28%以上、29%以上、30%以上、31%以上、32%以上、33%以上、34%以上、35%以上、更优选36%以上；(2)施用所述组合物培养的植物的地上部分鲜重比所述对照组增加10%以上、11%以上、12%以上、13%以上、14%以上、15%以上、16%以上、17%以上、18%以上、19%以上、20%以上、21%以上、22%以上、23%以上、24%以上、25%以上、26%以上、27%以上、28%以上、29%以上、30%以上、31%以上、32%以上、33%以上、34%以上、35%以上、36%以上、37%以上、38%以上、39%以上、40%以上、优选45%以上、更优选47%以上；(3)施用所述组合物培养的植物的地下部分鲜重比所述对照组增加3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、11%以上、更优选12%以上；和/或(4)施用所述组合物培养的植物产品的数目或重量是所述对照组的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.5倍、优选至少3.0倍。在一个实施方案中，所述植物产品选自下组：植物的果荚、果针和种子。

在一个实施方案中，本发明所述的施用选自下组：种子包被、浸种处理、鳞茎处理、灌根处理、滴灌处理和叶面喷施。

6. 本发明的用途

在一个方面，本发明涉及本发明的组合物用于促进根瘤生长的用途。在一个实施方案中，本发明的组合物用于同时促进根瘤生长和与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的生长。在一个实施方案中，本发明的组合物用于农业肥料、农用助剂或农药中的用途。在一个实施方案中，所述肥料为含氨基酸水溶肥料、有机水溶肥料、化学肥料、微生物肥料或腐殖酸肥料。

7. 本发明的优势

本发明具有如下技术优势：

(1) 本发明的组合物可显著促进根瘤形成，使根瘤数量增多、根瘤体积增大、且根瘤重量增加。而且与对照相比，使用所述组合物处理的植物植株的地上和地下部分更发达、植物产品数量更多和/或产量更高；

(2) 本发明的组合物中使用的脂肽可生物降解，无污染，绿色环保，长期使用无危害；和

(3) 本发明的组合物中使用的脂肽稳定性强，受温度和湿度影响较小，制备和使用方法简单、管理方便。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施例并不能被理解为是对本发明保护范围的限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对这些具体实施例做出多种变更或修改，所述变更和修改后的实施方案仍落入本发明的保护范围。

仪器、材料与试剂

超净工作台、摇床、培养箱、摇瓶、糖类、无机氮源、有机氮源、植物油、KH₂PO₄、Na₂HPO₄·12H₂O、CaCl₂、MnSO₄·H₂O、FeSO₄·7H₂O等均为商购产品。

菌株

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) THY-7/Pg3-srfA获得自专利ZL201510654218.3；枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA(yngH)获得自专利ZL 2018108652957；枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfAΔspoIVA、THY-7/Pg3-srfAΔspoIVB、THY-7/Pg3-srfAΔspoIVC、THY-7/Pg3-srfAΔspoIVF、THY-7/Pg3-srfAΔspoVA、THY-7/Pg3-srfAΔspoVB、THY-7/Pg3-srfAΔspoVD和THY-7/Pg3-srfAΔspoVE获得自专利ZL 201811465067.7；枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA(leuABCD-ilvK)获得自专利ZL 201910549289.5。

实施例1. 脂肽组合物的获得

1. 含表面活性素的组合物的获得

挑取枯草芽孢杆菌THY-7/Pg3-srfA单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养16小时，得到种子液，以5%的比例接入发酵培养基摇瓶中，37℃、200rpm条件下培养2-6小时时加入1 mM IPTG，继续培养至2天，即得到含表面活性素的发酵液。

所使用的发酵培养基的组成为：糖类30-100 g/L、无机氮源10-50 g/L、有机氮源0.5-3 g/L、KH₂PO₄ 0.1-1 g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 0.5-0.3 g/L、CaCl₂0.002-0.01 g/L、MnSO₄·H₂O 0.002-0.01 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.002-0.01 g/L, pH 6.5-7.5，发酵添加剂(硅类消泡剂、多糖、氨基酸或其衍生物、寡肽、磷脂、糖脂、和/或脂肪酸或其衍生物) 0.01-20重量%。

发酵液中表面活性素含量检测采用CN105400784A中公开的方法。具体为：取1 mL发酵液在12000 rpm条件下离心1分钟，取100 μL上清液加入1900 μL去离子水，混匀，经0.22 μm滤膜过滤后用HPLC分析。HPLC分析的流动相为甲醇和水，其比例为85/15，流速为1mL/分钟，色谱柱为C18-ODS反相色谱柱，柱温40°C，紫外检测器，检测波长205 nm。

通过检测可知，发酵液中的表面活性素的含量约为0.001-90g/L。所述发酵液即为本发明的含表面活性素的组合物1。从发酵液中提取出表面活性素，并通过冷冻干燥获得粉末产物(其也可以作为本发明的组合物直接施用)，并将所述粉末配制成0.001-100 g/L的水溶液，作为本发明的组合物2。

2. 含伊枯草菌素和芬芥素的组合物的获得

伊枯草菌素和芬芥素购自MedChemExpress。将其分别溶解于水中，配制成0.001-100 g/L的水溶液，分别作为本发明的组合物3和4。

在组合物2-4中分别加入0.01-99.99重量%的多糖或其衍生物(肽聚糖、纤维素、糖原、淀粉、壳多糖、多聚果糖、多聚半乳糖和糖胺聚糖中的一种或多种)、氨基酸(常见α-氨基酸)、寡肽(寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5和寡肽-6中的一种或多种)、类脂(酯类化合物、磷脂、糖脂和胆固醇及其酯中的一种或多种)、脂肪酸或其衍生物(硬脂酸、动物油脂和植物油脂中的一种或多种)、无机盐(Na₂SO₄、K₂SO₄、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、K₃PO₄、CO(NH₂)₂、NH₄NO₃、NaNO₃、CaCl₂、FeCl₂、NH₄Cl、MnSO₄、FeSO₄、Ca(H₂PO₄)₂中的一种或多种)、分散剂(萘磺酸盐、木质素磺酸盐、聚羧酸盐及聚羧酸酯、淀粉、牛血清白蛋白、环糊精中的一种或多种)、润湿剂(十二烷基磺酸盐、辛基琥珀酸盐、醇醚硫酸盐聚合物中的一种或多种)、聚合物(聚乙二醇、聚丙烯酸乳液、聚丙烯酸聚乙烯醇乳液、黄原胶、聚谷氨酸中的一种或多种)、或者警戒色试剂作为本发明的组合物5-7 (参见表1) (上述组合物1-7也可以粉末混合物形式作为本发明的组合物直接施用)。

表1.

实施例2. 脂肽组合物促进黄豆根瘤和植株的生长

将装土花盆浇水后种入黄豆，每盆6颗，出苗后间苗至4棵/盆，出苗后2周内浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，处理15天后观察盆栽地上部分生长情况，测量植株高度。经测定，组合物处理组的植株的平均高度为21-25cm，对照组的植株的平均高度为17.9 cm。可知，组合物处理组比对照组增加17.3-39.7% (见图1)。处理25天后，从土壤中取出整个植株，将植株的地上部分与地下部分分割。对地上部分直接称重作为地上部分鲜重。经测定，组合物处理组的地上部分鲜重为33-40.1 g，对照组的地上部分鲜重为27.2 g，组合物处理组比对照组增加21.3-47.4%。将地下部分用自来水冲洗干净后称重作为地下部分鲜重。经测定，组合物处理组的地下部分鲜重为24.5-29.1 g，对照组的地下部分鲜重为21.6 g，组合物处理组比对照组增加了13.4-34.7% (见图2)。

田间播种黄豆，播种后2周内浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，浇灌处理3周后观察黄豆植株生长情况，测量植物高度，对照组株高约为51cm，脂肽处理组样品株高约57-60cm，比对照组增高了11.8-17.6%。播种8周，从土壤中取出整个植株，将植株的地上部分与地下部分分割并进行测定，对照组地上鲜重为295g，组合物处理组地上鲜重为350-500g，比对照组增加了18.6-69.5%。将地下部分用自来水冲洗干净后称重作为地下部分鲜重，处理组的地下部分鲜重为27.5-33.6g，对照组地下部分鲜重23.8g，处理组比对照组增加了和15.5-41.2%。经测定，组合物处理组的平均根瘤数量为43.1个，对照组的平均根瘤数量为6.1个，组合物处理组是对照组的约7倍。将根瘤取下称重，处理组平均根瘤重量约是对照组的10.3倍(见图3)。

采收黄豆，清洗晒干后测定产量。处理组黄豆产量比对照组提高了23-40%，处理组饱仁率比对照组提高了24-45%。

将黄豆与1-100mL组合物1-7拌种后，播种于装土花盆中，浇水每盆6颗，出苗后间苗至4棵/盆，正常浇水护理，播种1月后从花盆中取出整个植株，将植株的地上部分与地下部分分割并进行测定，对照组地上鲜重为28.9g，组合物处理组地上鲜重为35.3-39.1g，比对照组增加了22.1-35.3%。将地下部分用自来水冲洗干净后称重作为地下部分鲜重，处理组的地下部分鲜重为25.7-30.2g，对照组地下部分鲜重23.0g，处理组比对照组增加了和11.7-31.3%。经测定，组合物处理组的平均根瘤数量为36.3个，是对照组的6.05倍。将根瘤取下称重，处理组平均根瘤重量约是对照组的5.9倍。

实施例3. 脂肽组合物促进绿豆根瘤和植株的生长

田间播种绿豆，出苗后2周内浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，浇灌处理3周后观察绿豆植株生长情况，测量植株高度。经测定，各处理组植株的平均高度为13-16 cm，对照组平均高度为11.9 cm。可知，组合物处理组比对照组增加11.0-34.5% (见图4)。

处理10周后，从土壤中取出整个植株，用自来水冲洗地下部分。如图4所示，经测定，处理组的地下部分鲜重为34.8-39.5 g，对照组平均鲜重为27.84 g，组合物处理组比对照组平均增加了25-42%。此外，还对地下部分的根瘤数量和根瘤重量进行测定(见图5），处理组的平均根瘤数量为88-124个，对照组的平均根瘤数量为50个，处理组对对照组提高了76%-148%，将根瘤取下称重，处理组平均根瘤重量是对照组的2.5-4倍，如图5所示。

采收绿豆，清洗晒干后测定产量。处理组绿豆产量对对照组提高了18-35%，处理组饱仁率比对照组提高了8-15%。

田间播种绿豆，出苗至4叶期时，叶面喷施1-200mL脂肽组合物1-7，3周后观察绿豆植株生长情况，测量植株高度。经测定，各处理组植株的平均高度为12.6-15.1 cm，对照组平均高度为11.9 cm。可知，组合物处理组比对照组增加5.9-26.9%。10周后，从土壤中取出整个植株，用自来水冲洗地下部分并测定地下鲜重、根瘤数量和根瘤重量。经测定，处理组的地下部分鲜重为31.5-35.3 g，对照组平均鲜重为27.84 g，组合物处理组比对照组平均增加了13.1-26.8%。处理组的平均根瘤数量为65-90个，对照组的平均根瘤数量为50个，处理组对对照组提高了30%-80%，处理组平均根瘤重量是对照组的1.7-2.7倍。

实施例4. 脂肽组合物促进赤豆根瘤和植株的生长

田间播种赤豆，出苗后1-2周内浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，浇灌3周后观察绿豆植株生长情况，测量植株高度。经测定，各处理组植株的平均高度为13.6-18.4 cm，对照组平均高度为12.2 cm。可知，组合物处理组比对照组增加11.5-50.8%。

处理10周后，从土壤中取出整个植株，将赤豆植株的地上部分与地下部分分割，并分别称重。经测定，处理组的地上部分鲜重为30.2-35.5 g，对照组平均鲜重为25.3 g，组合物处理组比对照组增加了19.4-40.3%。处理组的地下部分鲜重为24.7-28.4 g，对照组平均鲜重为20.6 g，组合物处理组比对照组增加了19.9-37.9%。此外，还对地下部分的根瘤数量进行测定，处理组的平均根瘤数量为63-108个，对照组的平均根瘤数量为41个，处理组对对照组提高了53.6%-163.4%，将根瘤取下称重，处理组平均根瘤重量是对照组的2.1-5倍。采收赤豆，处理组平均豆荚18-20个，比对照组15个，处理组平均赤小豆数为每株138-160个，对照组平均每根植株产赤豆120个，处理组比对照组提高了15%-33.3%（见图6），处理组赤小豆平均产量比对照组提高了17-40%。

实施例5. 脂肽组合物促进菜豆根瘤和植株的生长

田间移栽菜豆苗，缓苗1周后浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，并及时搭架，浇灌2周后，处理组的蔓苗开始爬架，而对照组还未开始抽蔓。处理4周后，再次浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，二次处理4周后观察菜豆植株和地下根系。经测定，处理组菜豆植株地上鲜重为56-72g, 对照组为42g，组合物处理组比对照组增加了33.3-71.4%。处理组的地下部分鲜重为40-51 g，对照组平均鲜重为36g，组合物处理组比对照组增加了11.1-41.7%。此外，还对地下部分的根瘤数量进行测定，处理组的平均根瘤数量为74-101个，对照组的平均根瘤数量为50个，处理组对对照组提高了48%-102%，将根瘤取下称重，处理组平均根瘤重量是对照组的1.3-2.1倍。

实施例6. 脂肽组合物促进落花生根瘤和植株的生长

田间播种花生并覆地膜，出苗时及时扣膜，2周后全部去除地膜并浇灌1-200mL脂肽组合物1-7，浇灌6周后观察花生植株生长情况，测量植株高度（见图7）。经测定，各处理组植株的平均高度为55-60cm，对照组平均高度为50 cm。可知，组合物处理组比对照组增加10-20%。处理组的地上部分鲜重为125-165 g，对照组平均鲜重为110g，组合物处理组比对照组增加了13.6-50%。处理组的地下部分鲜重为75-113 g，对照组平均鲜重为60 g，组合物处理组比对照组增加了25-88.3%。此外，还对地下部分的根瘤数量和果针进行测定，处理组的根瘤数量为103-180个，对照组的根瘤数量为70个，处理组对对照组提高了47.1%-157.1%，将根瘤取下称重，处理组平均根瘤重量是对照组的1.8-4.5倍。处理组平均每株植株果针数量为10-16个，对照组平均每植株果针数为7，处理组对对照组提高了42.9%-128.6%。

处理12周后，采收花生，清洗晒干后测定花生产量。处理组花生产量对对照组提高了20-36.5%，处理组饱仁率比对照组提高了10-21%，处理组百果质量为156.2-170.8g，对照组为135.1g, 处理组比对照组提高了15.6-26.4%，处理组百仁质量比对照组提高了5.3-28.6%。

实施例7. 脂肽组合物促进非豆科植物根瘤和所述植物的生长

7.1在移栽桤木和赤杨(桦木科)、粗枝木麻黄(木麻黄科)、杨梅和香蕨木(杨梅科)、鼠李(鼠李科)、沙棘和沙枣(胡颓子科)、马桑(马桑科)、仙女木(蔷薇科)、四川苏铁和攀枝花苏铁(苏铁科)1-3个月的田间，以清水为对照，浇灌脂肽组合物1-7，每株浇灌1000-2000mL，每月浇灌1次，培养8-10个月，种植过程中肥水管理由种植园统一处理，采集各植物，测定每株植物地下鲜重、根瘤数、根瘤重，以每种植物清水处理组的数据为标准进行归一化处理，结果参见表2。

表2.

7.2 在实验室培养盆中，移栽等面积的红萍(槐叶萍科蕨类)到含有鱼腥藻和脂肽组合物1-7的培养液中，以含鱼腥藻的清水为对照组，培养7天后统计根红萍重量，以清水处理组的数据为标准进行归一化处理，结果参见表3。

在长满角苔、壶苞苔和地衣的试验地，划分等面积试验区域，以清水为对照，浇灌脂肽组合物1-7，每区域浇灌100-1000 mL，每周浇灌1次，4周后取样方内植物，整理，称量植物鲜重，以清水处理组的数据为标准进行归一化处理，结果参见表3。

表3.

以上所述，仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可对上述披露的技术内容作出多种变更或修改，这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种组合物用于促进根瘤生长的用途，其中所述组合物含有：

(i) 0.001-100 g/L的脂肽；和

(ii) 助剂，

其中所述脂肽为选自下组的一种或多种：表面活性素、伊枯草菌素和芬芥素，

其中所述根瘤是通过与植物共生的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生的，所述植物选自下组：豆科、桦木科、木麻黄科、杨梅科、鼠李科、胡颓子科、马桑科、蔷薇科和苏铁科植物。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述脂肽是由细菌、放线菌、真菌或蓝细菌产生的。

3.根据权利要求2所述的用途，其中产生脂肽的细菌是野生菌或基因工程菌。

4.根据权利要求2所述的用途，其中产生脂肽的细菌选自下组：芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、节杆菌属和伯克霍尔德氏菌属；产生脂肽的放线菌选自下组：链霉菌属、拟无枝菌酸菌属和微杆菌属；产生脂肽的真菌选自下组：曲霉属，微囊菌属，孢霉属，漆斑菌属，帚枝霉属，线孢小球腔菌属和冠芒孢霉属；产生脂肽的蓝细菌选自下组：海洋蓝细菌属、石蕊属和青菌属。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述脂肽是通过培养芽孢杆菌或假单胞菌得到的。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述脂肽是通过培养芽孢杆菌并调控脂肽合成相关基因的表达而得到的。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述脂肽合成相关基因选自下组：脂肽合成基因、跨膜运输蛋白基因ycxA、生物素羧化酶基因yngH、芽孢合成基因spoIVA/B/C/F、spoVA/B/D/ E和亮氨酸合成途径基因leuABCD/ilvK。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述脂肽合成基因选自下组：表面活性素合成基因srfA、芬芥素合成基因fen和伊枯草菌素合成基因itu。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述组合物进一步含有0.01-99.99重量%的选自下组的一种或多种组分：多糖、寡糖、糊精、氨基酸、寡肽、蛋白质、类脂、脂肪酸、无机盐、分散剂、润湿剂、聚合物和警戒色试剂。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述组合物为培养能够产生脂肽的细菌得到的培养液。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述与植物共生的细菌选自α、β或γ-变形菌纲。

12.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述与植物共生的细菌选自下组：根瘤菌属、中华根瘤菌属、申氏杆菌属、新根瘤菌属、伴根瘤菌属、中慢生根瘤菌属、慢生根瘤菌属、叶瘤杆菌属、甲基杆菌属、微枝形杆菌属、苍白杆菌属、固氮根瘤菌属、德沃斯氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、贪铜菌属和假单胞菌属；所述与植物共生的放线菌为弗兰克氏菌；所述与植物共生的真菌为子囊菌或担子菌；所述与植物共生的蓝细菌为念珠菌属或鱼腥属。

13.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述根瘤是通过与植物共生的细菌产生的，所述植物为豆科植物。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述植物选自下组：大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、赤豆、豇豆、菜豆、扁豆、木豆、黑豆、鹰嘴豆、落花生、紫云英、苜蓿、合欢、黄檀、皂角、格木、槐、马棘、木蓝、苏木、阿拉伯胶树、黄芪、柯伯胶树、菽麻和葛藤。

15.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，所述根瘤是通过与植物共生的弗兰克氏菌、蓝细菌或真菌产生的，所述植物选自下组：桦木科、木麻黄科、杨梅科、鼠李科、胡颓子科、马桑科、蔷薇科和苏铁科植物。

16.一种使用权利要求1-15中任一项所述的组合物促进根瘤生长的方法，其包括：

(2) 培养并收获所述植物；

(3) 任选地测量所述根瘤的参数，并将其和不施用所述组合物的对照组进行比较，

所述植物选自下组：豆科、桦木科、木麻黄科、杨梅科、鼠李科、胡颓子科、马桑科、蔷薇科和苏铁科植物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述根瘤的参数选自下组：每个植株的根瘤数目和根瘤重量。

18. 根据权利要求16所述的方法，所述根瘤生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：

(1) 施用所述组合物培养的所述植物的每个植株的根瘤数目是所述对照组的至少1.1倍；和/或

(2) 施用所述组合物培养的所述植物的每个植株的根瘤重量是所述对照组的至少1.1倍。

19. 根据权利要求16所述的方法，所述根瘤生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：

(1) 施用所述组合物培养的所述植物的每个植株的根瘤数目是所述对照组的至少7倍；和/或

(2) 施用所述组合物培养的所述植物的每个植株的根瘤重量是所述对照组的至少7倍。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其同时促进与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的生长。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物生长的促进是通过地上部分植株高度、地上部分鲜重、地下部分鲜重、植物产品的数目或重量表征的。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：

(1) 施用所述组合物培养的植物的地上部分植株高度比所述对照组增加10%以上；

(2) 施用所述组合物培养的植物的地上部分鲜重比所述对照组增加15%以上；

(3) 施用所述组合物培养的植物的地下部分鲜重比所述对照组增加5%以上；和/或

(4) 施用所述组合物培养的植物产品的数目或重量是所述对照组的至少1.1倍。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物生长的促进是通过选自下组的一项或多项表征的：

(1) 施用所述组合物培养的植物的地上部分植株高度比所述对照组增加36%以上；

(2) 施用所述组合物培养的植物的地上部分鲜重比所述对照组增加47%以上；

(3) 施用所述组合物培养的植物的地下部分鲜重比所述对照组增加12%以上；和/或

(4) 施用所述组合物培养的植物产品的数目或重量是所述对照组的至少3.0倍。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述植物选自下组：植物的果荚、果针和种子。

25.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述施用选自下组：种子包被、浸种处理、鳞茎处理、灌根处理、滴灌处理和叶面喷施。

26.根据权利要求20所述的方法，其中所述施用选自下组：种子包被、浸种处理、鳞茎处理、灌根处理、滴灌处理和叶面喷施。

27.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述组合物用于农业肥料、农用助剂或农药中。

28.根据权利要求1-8中任一项所述的用途，其中所述组合物用于同时促进根瘤生长和与产生所述根瘤的细菌、放线菌、真菌或蓝细菌共生的植物的生长。