CN116462220B - 一种碱式氯化铜及其在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用 - Google Patents
一种碱式氯化铜及其在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种碱式氯化铜及其在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用，得到的碱式氯化铜，在卵母细胞的体外成熟培养液中添加20‑40mmol/L碱式氯化铜，使碱式氯化铜产物与溶液的接触面积增加，促进了碱式氯化铜溶解速度，有效提高了碱式氯化铜的吸收利用率，提高了细胞中铜含量水平，可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种碱式氯化铜及其在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用。
背景技术
铜作为一种重要的微量元素，可促进生长，改善饲料转化率，提高饲料利用率。碱式氯化铜在饲料、工业、农业等领域用途广泛，效果良好。在自然界中，现已发现四种物相的碱式氯化铜，它们互为同分异构体，这四种物相分别是：Atacamite，也称作β-Cu2(OH)3Cl)、Botallackite，也称作α-Cu2(OH)3Cl)、Clinoatacamite，也称作γ-Cu2(OH)3Cl)，以及Paratacamite。这四种碱式氯化铜晶体具有相同的化学式(Cu2(OH)3Cl)，但晶型结构有较大差异，因此这四种同分异构体的理化性质也截然不同。
饲料生产中许多铜添加剂被批准作为微量添加剂，包括如硫酸铜、氧化铜、碱式氯化铜，早期的饲料生产中较多的利用硫酸铜和氧化铜作为微量饲料添加剂，但由于氧化铜的生物利用率低、硫酸铜在饲料混合物中具有较强的氧化还原性，易造成饲料混合物中所需的有机组分氧化变质等缺点，近几年，具有水溶性低、氧化还原能力低以及生物利用率高等优点的碱式氯化铜逐渐取代硫酸铜、氧化铜作为饲料添加剂被广泛利用。碱式氯化铜不溶于水，不吸潮，可减少对饲料养分的破坏，提高饲料品质，因此比硫酸铜在饲料应用中更具优势，被用作饲料添加剂和农业杀菌剂。碱式氯化铜可降低粪便中的铜含量和可溶性铜含量，有利于保护环境。此外，它还可用作医药中间体以及制造其它铜盐产品的基础原料。
目前已有碱式氯化铜的研究，国内外碱式氯化铜的生产方法主要分为两种：一种是利用线路板酸、碱蚀刻废液进行中和反应生产碱式氯化铜；另外一种是通过溶解废铜制成含铜溶液，再进行加碱中和反应生产碱式氯化铜。
例如中国专利申请号200910311148.6碱式氯化铜的制备方法，公开了用加工废铜得到的氢氧化铜作为原料来合成碱式氯化铜(即羟基氯化铜)的方法，步骤相对繁琐，需要控制压强，而且需要对pH值进行调节，并且制备的样品颗粒较大。又例如中国专利申请号200710030323.5利用含铜蚀刻废液生产碱式氯化铜、五水硫酸铜的方法，公开了一种利用酸、碱性蚀刻废液在严格控制加碱条件及反应pH下生产碱式氯化铜的方法；中国专利申请号201110315221.4利用废铜生产碱式氯化铜的方法，公开了一种利用盐酸溶解废铜制成含铜溶液，含铜溶液与特定的碱在特定的条件下反应生成碱式氯化铜的方法；中国专利申请号201210229289.5一种碱式氯化铜的生产方法，公开了一种连续生产碱式氯化铜的新方法，采用氢氧化钠或氢氧化钠混合碱液替代氨蚀刻废液或氨水，通过往反应溶液中添加少量的铵根离子，生产较大颗粒的碱式氯化铜。
现有制备碱式氯化铜的方法，还存在一些缺陷和不足，比如原料的纯度和安全性不明确；需要控制反应体系的pH值等条件；反应步骤较多、过程繁琐；生产效率较低等。而且，现有对碱式氯化铜的应用研究，一般是将碱式氯化铜作为新型铜源饲料添加剂，缺少对碱式氯化铜在饲料之外的应用研究。
发明内容
针对现有技术中猪卵母细胞体外成熟培养液的卵母细胞体外发育的凋亡率指标不理想的问题，本发明提供了一种碱式氯化铜及其在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用，制备得到一种碱式氯化铜，应用到猪卵母细胞体外成熟体系中，可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种碱式氯化铜的制备方法，包括如下步骤：
1)将硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.0-1.5％的回转窑渣，进行高压反应，所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为(0.38-0.42):(0.22-0.25):(2.25-2.50):(16-17)；高压反应的压力控制在0.2-0.5MPa，反应温度控制在150-200℃，反应时间为1.0-2.0h；
2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，得到碱式氯化铜，碱式氯化铜的粒径为400-600um，碱式氯化铜的孔隙率为60-70％；
步骤1)所述的回转窑渣，是指以钢铁厂含锌烟尘、渣灰、瓦斯灰、锌湿法冶炼浸出渣等含锌固废为原料，经回转窑火法挥发富集制备次氧化锌的工艺流程中而产生的，通过除杂处理、吸附处理、干燥后，主要成分检测如下所示：Cu 5-8％、Fe<0.1，余量为C。
本发明中：
步骤1)中所述的硝酸铜与氯化钠质量比为(0.38-0.42):(2.25-2.50)，氯化钠过量，目的是促使硝酸铜反应更彻底，提高硝酸铜的利用率，降低碱式氯化铜的生产成本，同时，反应体系中有六次甲基四胺，整个体系的粘度高，氯化钠适当过量也可降低产物的粘度，优选的，所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为0.40:0.24:2.40:17。
步骤1)中所述去离子水的添加量是足量的，加入足量的去离子水，一方面，降低反应物的粘度，有利反应物混合均匀，有利于提高产率，另一方面，在密闭容器中的反应提供足够的蒸汽压，有利于的介孔的形成；如果水的添加量过低，则混合效果降低，且不能提供足够的蒸汽，水的添加量过高，降低了反应物的浓度，会降低反应速度，而且，水量过多，产生的蒸汽多，不利于反应压力的控制，更不利于后续的瞬间卸压。
步骤1)中所述高压反应的压力控制在0.2-0.5MPa，控制适当的压力提高反应速度，同时，有利于容器中的水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，压力太低，蒸汽不能顺利进入颗粒内部，压力太高，不利于形成颗粒，产物颗粒的粒径减少，降低了产物的性能，优选地，压力控制在0.3、0.4MPa。
步骤2)中所述将高压反应的密闭容器瞬间卸压，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中中蒸汽位置没有被填充，形成介孔，从而得到高活性，如果卸压时间太长，颗粒中蒸汽不能瞬间溢出，随着反应容器中压力和温度缓慢降低，颗粒中孔洞结构坍塌，得不到内部有孔洞的碱式氯化铜。
步骤3)所述的真空干燥，真空度为0.04-0.08MPa，温度为80-120℃，真空干燥时间为1-2h。
步骤3)所述的一种碱式氯化铜，通过控制碱式氯化铜的粒径为400-800um，提高产物颗粒的粒径，有利于提高产物流动性，减少产物粘壁性，同时，能有效降低生产和使用过程中粉尘量，提供干净的劳动环境；进一步优选地，所述粒径为400-600um。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明所述的一种碱式氯化铜的制备方法，通过在高压反应过程中加入回转窑渣，所述的回转窑渣是指以钢铁厂含锌烟尘、渣灰、瓦斯灰、锌湿法冶炼浸出渣等含锌固废为原料，经回转窑火法挥发富集制备次氧化锌的工艺流程中而产生的，回转窑渣本身就是蓬松多孔，通过除杂处理、吸附处理、干燥后，在高压反应过程中会随着水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，在后续瞬间卸压的过程中，回转窑渣会进入到反应的物质颗粒中，利用回转窑渣耐热性好、粘度高、耐水解好的特点，具有很强的稳定性，可以支撑产物颗粒介孔的形成，防止颗粒中孔洞结构坍塌，从而使得到碱式氯化铜具有新的形状和用途。
2、本发明所述的一种碱式氯化铜的制备方法，通过将密闭反应容器中压力瞬间卸除，使反应产物颗粒中的蒸汽瞬间冲出，由于是瞬间卸压，颗粒中蒸汽位置没有被填充，形成介孔，从而得到高活性，如果卸压时间太长，颗粒中蒸汽不能瞬间溢出，随着反应容器中压力和温度缓慢降低，颗粒中孔洞结构坍塌，得不到内部有孔洞的碱式氯化铜。
3、本发明得到的一种碱式氯化铜，使碱式氯化铜产物与溶液的接触面积增加，促进了碱式氯化铜溶解速度，有效提高了碱式氯化铜的吸收利用率；但当孔隙率过高，产物的溶解速度过快，产物在短时间内被大量吸收，然而，有机体在短时间对碱式氯化铜的利用率有限，碱式氯化铜得不到利用而浪费，同时，给细胞造成了巨大负担。因此，保持一定孔隙率，通过控制一种碱式氯化铜的孔隙率为50-60％，适合在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例1制备得到的碱式氯化铜颗粒的介孔的放大图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
实施例1：
一种碱式氯化铜的制备方法，包括如下步骤：
1)将硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.5％的回转窑渣，进行高压反应，所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为0.38:0.22:2.25:16；高压反应的压力控制在0.5MPa，反应温度控制在200℃，反应时间为1.0h；
2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.08MPa，温度为120℃，真空干燥时间为1h，得到碱式氯化铜，碱式氯化铜的粒径为400-600um，碱式氯化铜的孔隙率为60-70％；
步骤1)所述的回转窑渣，是指以钢铁厂含锌烟尘、渣灰、瓦斯灰、锌湿法冶炼浸出渣等含锌固废为原料，经回转窑火法挥发富集制备次氧化锌的工艺流程中而产生的，通过除杂处理、吸附处理、干燥后，主要成分检测如下所示：Cu 5.6％、Fe<0.1，余量为C。
图1是实施例1制备得到的碱式氯化铜颗粒的介孔的放大图。
实施例2：
一种碱式氯化铜的制备方法，包括如下步骤：
1)将硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.0％的回转窑渣，进行高压反应，所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为0.42:0.25:2.50:17；高压反应的压力控制在0.2MPa，反应温度控制在180℃，反应时间为1.5h；
2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.04MPa，温度为80℃，真空干燥时间为2h，得到碱式氯化铜，碱式氯化铜的粒径为400-600um，碱式氯化铜的孔隙率为60-70％；
步骤1)所述的回转窑渣同实施例1。
实施例3：
一种碱式氯化铜的制备方法，包括如下步骤：
1)将硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.2％的回转窑渣，进行高压反应，所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为0.40:0.24:2.40:16.5；高压反应的压力控制在0.3MPa，反应温度控制在150℃，反应时间为2.0h；
2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，真空度为0.06MPa，温度为100℃，真空干燥时间为1.5h，得到碱式氯化铜，碱式氯化铜的粒径为400-600um，碱式氯化铜的孔隙率为60-70％；
步骤1)所述的回转窑渣同实施例1。
对比例1：
现有常规碱式氯化铜(粒径400-700um的实心颗粒)。
对比例2：
和实施例1相比，步骤1)中没有加入回转窑渣，其他同实施例1。
对比例3：
和实施例1相比，步骤1)中没有加入回转窑渣，用甘油硬脂酸酯代替回转窑渣，其他同实施例1。
实验例：
碱式氯化铜在猪卵母细胞体外成熟体系的应用，包括如下步骤：
1)准备卵母细胞的成熟培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/LNaHCO3、10IU/mL孕马血清促性腺激素、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、20μmol/L丁苯羟酸；电激活液的主要成分为：0.3mmol/L甘露醇、0.1mmol/LCaCl2·H2O、0.1mmol/L MgSO4·7H2O、0.5mmol/L Hepes、0.01％(w/v)聚乙烯醇(PVA)；
2)准备胚胎培养液：6.31g/L NaCl、0.74g/L KCl、0.047g/L KH2PO4、2.1g/LNaHCO3、0.022g/L丙酮酸钠、0.62g/L乳酸钙、0.15g/L L-谷氨酰胺、0.55g/L亚牛磺酸、20ml/L必需氨基酸、10ml/L非必需氨基酸、0.065g/L青霉素、0.05g/L链霉素、4g/L牛血清蛋白(BSA)；
3)猪卵泡液的制备：从猪卵巢上抽出3-8mm大小的透亮卵泡，获取卵泡液，对该液体进行离心，3500r/min，15min，收集上清液，用0.22μm过滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；
4)卵母细胞的培养：猪卵巢采用75％乙醇清洗15s，然后用37℃加有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3遍，用装12号针头的10mL注射器轻柔抽取2-6mm透亮卵泡，放入38.5℃恒温架中的试管中；在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上颗粒、卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，将卵母细胞移入含有孕马血清促性腺激素(eCG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)的成熟液中培养20-22h，再换至无激素的成熟液中继续培养20-22h；设置20μmol/L丁苯羟酸的处理组和空白对照组，比较卵母细胞凋亡率、第一极体排出率；
5)体外受精(IVF)和孤雌(PA)胚胎生产：新鲜猪精液镜检活率0.7以上、畸形率低于50％为合格；将9mL洗精液加入1mL新鲜猪精液中，1500r/min离心3次，每次3min，弃去上清液，加入受精液重悬，待用；
卵母细胞在获能液中清洗3遍，移入12孔板受精液中，加入重悬获能的精子，调整精子密度为1×106个/mL，将卵母细胞与精子比例调整为1:1000放入培养箱共孵育；3h后移入胚胎培养液中轻柔吹打，去除多余精子，将受精卵移入胚胎培养液微滴中继续培养；
6)孤雌激活采用电激活法，用平衡15min的激活液清洗融合槽3遍，将卵母细胞在激活液中清洗3遍后，移至覆盖满电激活液的融合槽电极丝中间，以1.00kV/cm、80μs的直流脉冲激活3次，电激活后的卵母细胞置于PZM3胚胎培养液中清洗3遍，移入胚胎培养液微滴中继续培养，继续培养条件为5％ CO2、饱和湿度、39℃；
7)将上步骤培养到168h的囊胚，置于Hoechst33342中染色15min，之后滴1-2滴甘油压片、封片，使其均匀铺散在载玻片上，再于荧光照射下进行细胞计数；
8)设置空白对照组，比较卵母细胞成熟效率的影响。
实验组1：步骤1)中添加实施例1得到的碱式氯化铜20mmol/L；
实验组2：步骤1)中添加实施例1得到的碱式氯化铜30mmol/L；
实验组3：步骤1)中添加实施例1得到的碱式氯化铜40mmol/L；
对比组1：步骤1)中添加对比例1的现有常规碱式氯化铜30mmol/L；
对比组2：步骤1)中添加对比例2得到的碱式氯化铜30mmol/L。
对比组3：步骤1)中添加对比例3得到的碱式氯化铜30mmol/L。
实验结果：
表1不同实验组对卵母细胞成熟效率的影响
注：同列数据肩标不同字母代表同列数据差异显著(P<0.05)，无字母或含相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
结果：
1、通过实验组1-3和对比组1的比较，说明本发明得到的碱式氯化铜，结果表明：在卵母细胞的体外成熟培养液中添加20-40mmol/L碱式氯化铜，使碱式氯化铜产物与溶液的接触面积增加，促进了碱式氯化铜溶解速度，有效提高了碱式氯化铜的吸收利用率，提高了细胞中铜含量水平，相比对比例1的现有常规碱式氯化铜30mmol/L、对比例2得到的现有碱式氯化铜30mmol/L，可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率。
2、通过实验组1-3和对比组2的比较，说明本发明在制备碱式氯化铜的过程中，通过在高压反应过程中加入回转窑渣，会随着水形成蒸汽并进入到产物颗粒中，在后续瞬间卸压的过程中，回转窑渣会进入到颗粒中，利用回转窑渣耐热性好、粘度高、耐水解好的特点，具有很强的乳化性能和特殊的稳定性，可以支撑产物颗粒介孔的形成，防止颗粒中孔洞结构坍塌，从而得到碱式氯化铜，在卵母细胞的体外成熟培养液中添加20-40mmol/L碱式氯化铜，可以降低卵母细胞体外发育的凋亡率。
3、通过实验组1-3和对比组3的比较，说明本发明在制备碱式氯化铜的过程中，通过在高压反应过程中加入回转窑渣，效果要比加入甘油硬脂酸酯好，分析原因是回转窑渣进过长时间的高温、干燥处理，回转窑渣本身就是蓬松多孔，在高压反应过程中会随着水形成蒸汽并进入到碱式氯化铜颗粒中，会产生更多的介孔，从而让碱式氯化铜可以在卵母细胞的体外成熟培养液中产生更多大的影响。
通过实施例和对比例的基本性能的比较，说明实施例的制备方法明显优于对比例。
Claims (5)
1.一种碱式氯化铜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠和去离子水混合于密闭容器中，再加入相当于去离子水质量1.0-1.5％的回转窑渣，进行高压反应，所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为(0.38-0.42):(0.22-0.25):(2.25-2.50):(16-17)；高压反应的压力控制在0.2-0.5MPa，反应温度控制在150-200℃，反应时间为1.0-2.0h；
2)上步骤的高压反应完成后，将高压反应的密闭容器瞬间卸压，时间为1-3s；
3)上步骤的卸压后，将得到的物料进行真空干燥，得到碱式氯化铜，碱式氯化铜的粒径为400-600um，碱式氯化铜的孔隙率为60-70％；
步骤1)所述的回转窑渣，是指以钢铁厂含锌烟尘、渣灰、瓦斯灰、锌湿法冶炼浸出渣含锌固废为原料，经回转窑火法挥发富集制备次氧化锌的工艺流程中而产生的，通过除杂处理、吸附处理、干燥后，主要成分检测如下所示：Cu 5-8％、Fe<0.1，余量为C。
2.根据权利要求1所述的一种碱式氯化铜的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的硝酸铜、六次甲基四胺、氯化钠、去离子水的质量比为0.40:0.24:2.40:17。
3.根据权利要求1所述的一种碱式氯化铜的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述高压反应，压力控制在0.3、0.4MPa。
4.根据权利要求1所述的一种碱式氯化铜的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的真空干燥，真空度为0.04-0.08MPa，温度为80-120℃，真空干燥时间为1-2h。
5.权利要求1-4任一所述的一种碱式氯化铜的制备方法得到的碱式氯化铜的应用，其特征在于：所述的碱式氯化铜在猪卵母细胞体外成熟体系中的应用。
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2023
- 2023-01-06 CN CN202310019025.5A patent/CN116462220B/zh active Active
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