CN116391726A - 一种防治猕猴桃细菌性溃疡病的复配生防菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治猕猴桃细菌性溃疡病的复配生防菌剂。所述复配生防菌剂的菌株为Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019，Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019相容且对猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌具有协同抑制作用。所述复配生防菌剂的田间防治效果为73.89%，优于单一菌种的防治效果且与市售常用药剂防效相当。本发明复配生防菌剂制备成本低，比传统防治方法更安全，对环境无毒无害，可工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物资源化利用技术领域，涉及微生物及其发酵产物在植物病害防治中的应用，具体涉及一种防治猕猴桃细菌性溃疡病的复配生防菌剂。
背景技术
猕猴桃细菌性溃疡病由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起，其危害部位多、影响周期长、流行频次高、防控难度大，严重制约了猕猴桃产业健康发展。目前，猕猴桃细菌性溃疡病的防治以化学防治为主，铜制剂和抗生素是溃疡病防治中最常用且效果较好的药剂，随着“3R”问题的日益突出，这两类药剂的使用有效性开始受到限制，一些欧洲国家也已禁止链霉素在猕猴桃上的使用。
生物防治是一种集安全、高效、不易产生抗药性等优点于一体的植物病虫害防治方法，符合新时期农业发展要求。其中利用微生物制成的生防菌剂是生物防治的重要组成部分，但生防菌剂只有具备了适应田间生产实践的特性，如抑菌谱广、防效高、防效稳定等，才能更具有推广应用的价值。单菌种生防菌剂的环境依赖性强、作用机制单一，无法最大程度发挥生防潜力，不利于应用和推广，而通过对多种生防菌复配后，利用多种生防机制的协同作用，可以更高效地防治病虫害，以降低成本、提高效益。
目前，复配生防菌所展现的优良效果已在烟草黑胫病、枯萎病、香蕉穿孔线虫病、苹果轮纹病、大豆根腐病、枣黑斑病、灰霉病等多种植物病害上相继报道。针对由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病的防治上尚缺乏技术成熟、广泛应用的复配生防菌剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题：化学药剂或单菌种生防菌剂尚难以实现猕猴桃细菌性溃疡病的高效且安全的防治；对猕猴桃细菌性溃疡病的防治仍以铜制剂为主，可用的生防资源匮乏。
为了解决现有技术存在的问题，本发明探索出植物病害防治的新思路，即经过科学复配生防菌，发挥多种生防机制协同作用。这不仅可以降低单株生防菌对环境的依赖性，更高效的参与病害防控，还可为猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治进一步提供生防产品新材料。
基于上述技术思路，本发明首先对猕猴桃细菌性溃疡病菌拮抗菌组合的相容性进行测定，在能够相容的基础上再测定该组合对猕猴桃细菌性溃疡病致病菌Psa的抑制效果，最后通过离体和田间防治试验测定该拮抗菌组合对猕猴桃细菌性溃疡病的防治效果
本发明提供一种复配生防菌剂。所述复配生防菌剂用于防治猕猴桃细菌性溃疡病，采用的复配菌株为Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019。本发明通过平板对峙和Psa抑制试验得出，Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019相容，且对猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌具有协同抑制作用。所述复配生防菌剂的有效组分为Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticusHhb.019发酵液的组合。本发明利用离体叶片真空渗透和离体枝条有伤接种的方法，明确了所述复配生防菌剂对猕猴桃细菌性溃疡病的预防作用。
进一步地，本发明所用Delftia lacustris ZWP15菌株的保藏编号为CGMCCNo.23331，所用Bacillus proteolyticus Hhb.019的保藏编号为CGMCC No.24797。这两种菌株均购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
作为本发明复配生防菌剂的优选实施方式之一，以体积比计，所述Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合比例为1:1。
本发明进一步揭示了菌株Delftia lacustris ZWP15、Bacillus proteolyticusHhb.019的发酵培养基成分和工艺参数。
具体地，制备所述Delftia lacustris ZWP15发酵液的培养基组分为：以质量百分比计，马铃薯淀粉0.571%、棉籽饼粉0.5%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.25%、水余量；发酵参数为：温度24℃、转速205 r/min、初始pH值7.0、所述Delftia lacustris ZWP15接种量2%、发酵时长20.196 h。
具体地，制备所述Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的培养基组分为：以质量百分比计，马铃薯淀粉1.0%、花生饼粉2.509%、氯化钠0.5%、水余量；发酵参数为：温度28℃、转速234 r/min、初始pH值7.0、所述Bacillus proteolyticus Hhb.019接种量1.183%、发酵时长40 h。
基于本发明的技术思路，本领域技术人员结合现有技术，可将所述Delftia lacustris ZWP15发酵液、所述Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液按特定的比例复配（优选为1:1），通过添加农业上使用的助剂或载体将所述复配生防菌剂加工成农业上可接受的剂型后施用。
还有，本发明请求保护复配生防菌剂在猕猴桃细菌性溃疡病防治中的应用。所述复配生防菌剂的菌株为Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019，Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019相容且对猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌具有协同抑制作用。进一步地，所述复配生防菌剂的有效组分为Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合。以体积比计，所述Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合比例为1:1。有关Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的制备工艺参照上文所述。
与现有技术相比，本发明“一种防治猕猴桃细菌性溃疡病的复配生防菌剂”具有下述有益效果或优点：
本发明首先测定不同菌种组合的相容性，在明确能够相容的基础上再测定对致病菌的抑制效果，最后结合离体和田间预防效果，提供了一种防治猕猴桃细菌性溃疡病的复配生防菌剂。本理论方法为植物病虫害生防菌剂的开发与制备提供了技术途径。
菌株Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019均来源于健康猕猴桃根际土，对人畜、农作物和生态环境无毒无害。优化后的发酵培养基组分廉价易得，发酵方法简便易操作，发酵液制备成本低且成分安全，可满足规模化生产要求。
本发明经筛选得到菌株Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticusHhb.019相容性好，且是对猕猴桃细菌性溃疡病致病菌Psa M228抑制效果强的拮抗菌组合。经防治试验获知，本发明所述复配生防菌剂可直接用于猕猴桃细菌性溃疡病的生物防治，复配生防菌剂（发酵液10倍液）对猕猴桃细菌性溃疡病的防效为73.89%，与市售6%春雷霉素可湿性粉剂100倍液和46%氢氧化铜可湿性粉剂100倍液的防效相当。本发明所述复配生防菌剂是一种优异的猕猴桃细菌性溃疡病生物防治资源。
附图说明
图1为菌株Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019的相容性测定结果。ZWP15表示菌株Delftia lacustris ZWP15，Hhb.019表示菌株Bacillus proteolyticus Hhb.019，ZWP15+Hhb.019表示在含菌株Delftia lacustris ZWP15的平板上滴加10 μL Bacillus proteolyticus Hhb.019菌株的菌悬液，Hhb.019+ZWP15表示在含菌株Bacillus proteolyticus Hhb.019的平板上滴加10 μL Delftia lacustris ZWP15菌株的菌悬液。
图2为菌株Delftia lacustris ZWP15、Bacillus proteolyticus Hhb.019及其组合对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌Psa M228的皿内抑制结果。
图3为菌株Delftia lacustris ZWP15、Bacillus proteolyticus Hhb.019及其组合通过离体叶盘真空渗透接种后，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌Psa M228的预防效果。
图4为菌株Delftia lacustris ZWP15、Bacillus proteolyticus Hhb.019及其组合通过离体枝条接种后，对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌Psa M228的预防效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
在各实施例中，Delftia lacustris ZWP15活化所用培养基为PDA平板；Bacillus proteolyticus Hhb.019活化所用培养基为LB平板；猕猴桃细菌性溃疡病病原菌Psa M228活化所用培养基为LB平板。
如无特殊说明，菌液的培养条件均为28℃、220 r/min；菌悬液的制备方法是将菌液以8000 r/min离心2 min，无菌水离心冲洗两遍后重悬菌体。
实施例1
使用平板划线的方法，将保藏的猕猴桃细菌性溃疡病拮抗菌Delftia lacustrisZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019作为待测菌株分别接种于平板上。菌株ZWP15使用PDA培养基，菌株Hhb.019使用LB培养基，28℃培养2~3 d，得到活化的待测菌株。
将待测菌株ZWP15和菌株Hhb.019分别接种到LB液体培养基，在28℃、220 r/min恒温摇床振荡培养16~18 h。使用紫外分光光度计将菌体浓度调整至1×108 CFU/mL（OD600=1.0），得到待测菌株菌液。
待PDA培养基冷却至45℃时，将制备好的菌液与PDA培养基以1:9的比例混合倒平板，晾干后在该培养基中心点滴加10 µL待测菌液。所有菌株被作为待测菌株和挑战菌株两两交叉进行试验。每处理重复3次，晾干后置于28℃培养箱中培养2~5 d，通过观察有无抑菌圈和抑菌圈大小来判断两种菌株的相容性，即能否共生长。抑菌圈不明显或较小即代表相容性较好。如图1所示，Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019组合（标记为BD18）抑菌圈不明显，相容性较好。
实施例2
分别制备菌株Psa M228、ZWP15和Hhb.019菌液。使用抑菌圈法，将相容性良好的拮抗菌组合BD18中菌株ZWP15、Hhb.019的菌液按照1:1的比例混合在一起，混匀后使用分光光度计将菌液浓度调整至1×108 CFU/mL。待PDA培养基冷却至45℃左右时，将稀释好的病原菌Psa M228菌液与PDA培养基以1:9的体积比混合倒平板，晾干后在该培养基中心点打孔（直径d=6 mm），分别在小孔中加入10 µL待测菌液（ZWP15菌液、Hhb.019菌液、BD18混合菌液），每组处理重复3次，晾干后放置于28℃培养箱中培养2~3 d，使用十字交叉法测量抑菌圈直径，如图2所示。
经测量，组合BD18的抑菌圈直径为33.10±0.85 mm，菌株ZWP15的抑菌圈直径为25.33±0.29 mm，菌株Hhb.019的抑菌圈直径为24.33±0.76 mm。经Duncan氏新复极差法检验，组合BD18抑菌圈直径显著大于单一菌落的直径（p<0.05），说明组合BD18具有显著增效作用。
实施例3
采集来自于不同猕猴桃盆栽苗上的大小均匀、长势一致、健康的新生完全展开叶，表面消毒（0.6% NaClO溶液浸泡6~8 min，无菌水冲洗至无刺激性气味，置于滤纸上晾干）后，使用无菌打孔器（直径d=11 mm）制备叶盘，注意避开主叶脉。
分别制备菌株Psa M228、ZWP15、Hhb.019和BD18（混合比例1:1）的菌悬液，将菌悬液浓度调整至1×104 CFU/mL用于侵染。以无菌水为阴性对照，Psa M228菌悬液为阳性对照，叶盘置于菌液中，真空渗透（0.1 MPa，10 s，3次），先分别接种拮抗菌ZWP15、Hhb.019、BD18，24 h后再接种Psa M228菌悬液。
无菌水冲洗叶盘，用无菌滤纸吸干叶盘表面的水分，叶正面朝下紧贴于0.8%水琼脂平板上，每个水琼脂平板10~15个叶盘，每处理重复3次。
将叶盘置于人工气候培养培养箱保湿培养（光周期L/D：18 h/6 h；昼夜温度：16℃/10℃；相对湿度90%），接种4天后观察叶盘发病情况并拍照记录，使用ImageJ软件测算病斑面积，使用下述公式计算预防效果。
预防效果=（对照病斑面积-处理病斑面积）/对照病斑面积×100%
结果如图3所示，先接种组合BD18，24 h后接种致病菌Psa M228时，叶片表面病斑占比为9.86%，显著低于单一菌种ZWP15的21.97%、Hhb.019的18.06%和阳性对照的54.46%。经计算，组合BD18对病斑的预防效果为81.72%，高于单一菌种ZWP15的59.67%和Hhb.019的66.78%，存在显著差异（p<0.05）。
实施例4
采集当年生健康猕猴桃枝条，表面消毒后（方法同实施例3），截成10 cm长的枝条，两端用石蜡密封。
分别制备菌株Psa M228、ZWP15、HHB.019和BD18（混合比例1:1）的菌悬液（方法同实施例3），将菌悬液浓度调整至1×108 CFU/mL用于接种。以无菌水为阴性对照，致病菌PsaM228为阳性对照，使用无菌刀片制造伤口（1 mm宽，至韧皮部），在伤口处滴加10 µL菌液，先接种拮抗菌ZWP15、Hhb.019、BD18，24 h后接种Psa M228菌悬液，每组处理15根枝条。
菌液渗透进枝条后，置于人工气候培养箱保湿培养（条件同实施例3），接种20 d后观察发病情况，测量病斑长度并记录结果，使用下述公式计算预防效果。结果见图4。
预防效果=（对照病斑长度-处理病斑长度）/对照病斑长度×100%
对于组合BD18组，平均病斑长度为1.50 mm，低于菌株Hhb.019的4.67 mm、菌株ZWP15的1.53 mm，且显著低于阳性对照的13.6 mm。
组合BD18对离体枝条病斑的预防效果为88.97%，高于单一菌种ZWP15的88.73%，且显著优于菌株Hhb.019的65.69%（p<0.05）。通过本实验结果可知，组合BD18对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌Psa M228的扩展起到了明显的抑制作用。
实施例5
田间防治效果试验地点为陕西省宝鸡市眉县营头镇万霞村（34°11′15″N，107°44′15″E），果园栽培管理水平和土壤肥力中等，所有试验小区栽培条件均匀一致。周边地块猕猴细菌性桃溃疡病高发。供试植物为4~5年生徐香猕猴桃果树，长势一致。分别于2021年秋季采果后（10月中下旬）、冬季落叶前（11月上旬）、春季开花前（翌年3月上旬）各施药1次，共施药3次。施药采用淋干的方法，施用量每株1.0 L；每组处理20株，重复3次，共计60株。在2022年03月15日，调查记录各处理发病株数，根据下述公式计算病株率及防治效果，结果如表1所示。
病株率=发病株数/调查总株数×100%
防治效果=（对照病株率-处理病株率）/对照病株率×100%
表1，不同药剂对猕猴桃细菌性溃疡病的田间防治效果
由表1可看出，复配生防菌剂BD18发酵液10倍液对田间猕猴桃细菌性溃疡病的防治效果为73.89%，优于对照组的ZWP15发酵液10倍液的67.42%、Hhb.019发酵液10倍液的63.03%，且显著优于市售枯草芽孢杆菌可湿性粉剂100倍液的53.28%。与常用药剂46%氢氧化铜水分散粒剂100倍液的75.31%、6%春雷霉素可湿性粉剂100倍液的79.01%及解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂100倍液的73.46%无显著性差异（p<0.05）。说明本发明提供的复配生防菌剂BD18可用于田间防治猕猴桃细菌性溃疡病。
以上所述的实施例是是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.复配生防菌剂在猕猴桃细菌性溃疡病防治中的应用，其特征在于，所述复配生防菌剂的菌株为Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019，Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019相容且对猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌具有协同抑制作用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述复配生防菌剂的有效组分为Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以体积比计，所述Delftia lacustrisZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合比例为1:1。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，制备所述Delftia lacustris ZWP15发酵液的培养基组分为：以质量百分比计，马铃薯淀粉0.571%、棉籽饼粉0.5%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.25%、水余量；
发酵参数为：温度24℃、转速205 r/min、初始pH值7.0、所述Delftia lacustris ZWP15接种量2%、发酵时长20.196 h。
5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，制备所述Bacillus proteolyticusHhb.019发酵液的培养基组分为：以质量百分比计，马铃薯淀粉1.0%、花生饼粉2.509%、氯化钠0.5%、水余量；
发酵参数为：温度28℃、转速234 r/min、初始pH值7.0、所述Bacillus proteolyticusHhb.019接种量1.183%、发酵时长40 h。
6.一种复配生防菌剂，其特征在于，所述复配生防菌剂用于防治猕猴桃细菌性溃疡病，菌株为Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019，Delftia lacustris ZWP15和Bacillus proteolyticus Hhb.019相容且对猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌具有协同抑制作用，所述复配生防菌剂的有效组分为Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合。
7.根据权利要求6所述的复配生防菌剂，其特征在于，以体积比计，所述Delftia lacustris ZWP15发酵液和Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的组合比例为1:1。
8.根据权利要求6或7所述的复配生防菌剂，其特征在于，制备所述Delftia lacustrisZWP15发酵液的培养基组分为：以质量百分比计，马铃薯淀粉0.571%、棉籽饼粉0.5%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.25%、水余量；
发酵参数为：温度24℃、转速205 r/min、初始pH值7.0、所述Delftia lacustris ZWP15接种量2%、发酵时长20.196 h。
9.根据权利要求6或7所述的复配生防菌剂，其特征在于，制备所述Bacillus proteolyticus Hhb.019发酵液的培养基组分为：以质量百分比计，马铃薯淀粉1.0%、花生饼粉2.509%、氯化钠0.5%、水余量；
发酵参数为：温度28℃、转速234 r/min、初始pH值7.0、所述Bacillus proteolyticusHhb.019接种量1.183%、发酵时长40 h。
10.根据权利要求6所述的复配生防菌剂，其特征在于，所述复配生防菌剂加工成农业上可接受的剂型后施用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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