CN103320364A - 一株代尔夫特氏菌及其在修复丁草胺药害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株代尔夫特氏菌及其在修复丁草胺药害中的应用。所述代尔夫特氏菌（Delftia sp.）C-5保藏号为：CGMCC No.7383。本发明的代尔夫特氏菌C-5能够有效降解低浓度的丁草胺，可应用于受丁草胺污染的水体及土壤的以及用于缓解水稻上的丁草胺药害。

Description

一株代尔夫特氏菌及其在修复丁草胺药害中的应用

技术领域

本发明涉及环境污染微生物修复领域，具体地说，涉及一株代尔夫特氏菌及其在修复丁草胺药害中的应用。

背景技术

生物修复是利用微生物的广泛代谢途径对污染物进行处理的一种环境生物技术，微生物降解农药，既高效又安全且运行成本低，目前已分离到了很多能降解或者转化农药的微生物，并且研究了它们的作用方式和作用机理，证实了微生物降解是治理环境污染的有效途径，因此高效降解菌的筛选显得尤为重要。

楚小强等在2009年筛选出的施氏假单孢菌（Pseudomonasstutzeri），通过质谱筛选出了2种主要降解产物，分别为2-氯-2’,6’-二乙基乙酰苯胺和2,6-二乙基苯胺(农业环境科学学报,2009.28(1):145-150)。

李艳春等在2009年筛选出的不动杆菌属能够耐受高浓度的丁草胺，在丁草胺浓度为800mg/L时仍能较好的生存(微生物学通报,2009,36(8):1178-1182)。

李川等在2004年从稻田土壤分离的一株对丁草胺具有高效降解能力的真菌—茄类镰刀菌（F.sp.solani），为丁草胺等酰胺类除草剂寻求新的污染生物治理的方法提供了依据(农业环境科学学报,2004,23(3):611-614)。

赵淑莉等在2005年运用高效液相色谱对丁草胺在水溶液中的微生物的降解进行了研究，结果表明未灭菌的水中丁草胺降解率比灭过菌的水中快，接种微生物后丁草胺降解速率明显加快，这就更加说明微生物是丁草胺降解的主要因素(农业环境科学学报2005,24(5)：989-993)。

Zhengjinwei等在2012年研究发现的Catellibacterium caeni sp.nov DCA-1T将丁草胺降解鉴定出了五种产物分别为N-羟甲基-2-氯-N-(2,6-二乙基-苯基)乙酰胺（N-hydroxymethyl-2-chloro-N-(2,6-diethyl-phenyl)-acctamide）,2-氯-N-(2,6-二乙基-苯基)乙酰胺（2-chloro-N-(2,6-diethyl-phenyl)-acetamide）,(2,6-二乙基-苯基)–乙氧基甲基-氨基甲酸（(2,6-diethyl-phenyl)-ethoxymethyl-carbamicacid）,N-(2,6-二乙基-苯基)-N-羟甲基-乙酰胺

（N-(2,6-diethyl-phenyl)-N-hydroxymethyl-acetamide）和N-(2,6-二乙基-苯基)-N-羟甲基-甲酰胺

（N-(2,6-diethyl-phenyl)-N-hydroxymethyl-formamide）（参见《国际生物腐败和生物降解》(International Biodeterioration&Biodegradation)73(2012)16-22）。

吴新杰等在2000年研究发现土壤中的微生物对丁草胺在水溶液中的降解具有较强烈的作用，并分离出了一株新的丁草胺降解菌株Arrhrobacte.sp.WY306(应用与环境生物学报，2000,6（6）：593-596)。

目前还没有关于代尔夫特氏菌及其降解丁草胺药害的报道。

发明内容

本发明提供了一株高效丁草胺降解菌株，以期解决因丁草胺的使用产生的大面积药害，并且为生物修复污染土壤或水体提供依据。

本发明从长期受丁草胺污染的农药厂排污地筛选到的一株代尔夫特氏菌Delftia sp.C-5菌株。该菌株于2013年3月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号：CGMCC No.7383。

本发明菌株对丁草胺具有较好的降解能力，且能以丁草胺为唯一C源。通过富集驯化，根据生理生化特征、菌株形态相似性比较、16S rDNA序列同源性分析，将菌株C-5鉴定为代尔夫特氏菌（Delftiasp.）。

本发明还提供一种含有所述代尔夫特氏菌C-5的菌剂。

所述菌剂含有代尔夫特氏菌C-5的有效活菌个数5×10⁹-4×10¹⁰。

所述菌剂的制备方法为：LB培养基接种种子，200r/min，30℃培养3天。根据不同的应用方面制备成液体制剂或固体制剂。

本发明菌株可应用于受丁草胺污染的水体及土壤的修复，以及用于缓解水稻上的丁草胺药害。

在上述应用中，可将所述代尔夫特氏菌C-5可制备成菌剂，接种于水体、土壤或基肥中。所述菌剂的制备方法如上所述。

优选地，所述菌剂的接种量按重量百分比为5-10%。

本发明的有益效果：本发明通过富集驯化筛选到的代尔夫特氏菌属的细菌C-5能够有效降解低浓度的丁草胺。由于丁草胺的田间推荐用量不高（每亩施用50mL有效含量为60%的丁草胺），残留也不会太大，因此降解菌C-5降解低浓度丁草胺将在田间实际生物修复中，拥有更广泛的应用前景。

附图说明

图1为C-5菌株的电镜照片；

图2为C-5菌株的系统发育树；

图3为C-5菌株对丁草胺药害水稻植株的修复效果，A为不加丁草胺不加菌的对照组，B为加5mg/L丁草胺加10%C-5菌的实验组，C为加20mg/L丁草胺加10%C-5菌的实验组，D为加10mg/L丁草胺加10%C-5菌的实验组；

图4为C-5菌株对丁草胺药害水稻植株的修复效果，A为不加丁草胺不加菌的阴性对照组，B为加5mg/L丁草胺加10%C-5菌的实验组，C为加5mg/L丁草胺不加菌的阳性对照组；

图5为C-5菌株对丁草胺药害水稻植株的修复效果，A1-3为不加丁草胺不加菌的阴性对照组，B1-3为加5mg/L丁草胺加5%C-5菌的实验组，C1-3为加5mg/L丁草胺不加菌的阳性对照组；

图6为C-5菌株对丁草胺药害水稻植株的修复效果，A1-3为加20mg/L丁草胺加5%C-5菌的实验组，B1-3为加10mg/L丁草胺加5%C-5菌的实验组，C1-3为加5mg/L丁草胺加5%C-5菌的实验组，D1-3为不加丁草胺不加菌的阴性对照组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1菌株的分离与鉴定

1、培养基：

无机盐培养基：FeS0₄·7H₂O，0.02g；CaSO₄，0.08g；MgSO₄·7H₂O，0.4g；K₂HPO₄，0.2g；(NH₄)₂SO₄，0.2g，1000ml去离子水，pH7.0，高压蒸汽灭菌121℃，30min。

LB培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，氯化钠10g（固体培养基加琼脂15g），1000mL去离子水，pH7.0，高压蒸汽灭菌121℃，30min。

2、菌体分离纯化：

取5g土样加入含50mg/L的丁草胺无机盐培养液中，于30℃恒温摇床黑暗振荡培养（150r/min），每隔7天接种5%体积分数的菌液到同样的新鲜培养基中，并且丁草胺的浓度以50mg/L的梯度递增，至培养基中的丁草胺浓度达到200mg/L，如此驯化约2个月。于LB培养基上划线分离，挑取生长较好的菌落分离纯化3次，最后得到单一的菌株。将分离得到的单一菌株重新转接到含有丁草胺20mg/L的无机盐培养基中，摇床培养得以验证其降解丁草胺的特性。将纯化好并能高效降解丁草胺的菌株保存于LB固体斜面培养基上（含丁草胺20mg/L），30℃培养箱培养过夜后放置于4℃冰箱保存备用。在以下的研究中，将对该高效降解菌株做详细的鉴定分析。

3、菌株的鉴定及命名：

C-5在LB平板上放置于培养箱30℃培养24h后，菌落呈乳白色、隆起、圆形、不透明状，菌体的电镜图片（见图1）。

C-5的生理生化特性：淀粉水解反应呈阴性、接触酶反应阳性、脲酶反应呈阳性、V-P反应阳性、甲基红反应阳性、氧化酶反应阳性、明胶液化反应阳性。

将降解菌株C-5的16S rDNA序列与Genbank中的同源性较高的4个细菌模式株进行比较，菌株C-5的16S rDNA序列与Delftia sp的4个种都有比较高的序列同源性，其系统发育图见图2。由图2可知，菌株C-5的16S rDNA与Delftia tsuruhatensis(GenBank登录号为GQ140326)，Delftia acidovorans(GenBank登录号为GU459215)，Delftia lacustris(GenBank登录号为JN644603)及Delftiasp.(GenBank登录号为FJ688376)的相似性均为99%，且与Delftia sp.的几个种共同组成一个分支。根据系统发育树的结果结合生理生化特征将该菌株鉴定为Delftia sp.。该菌株于2013年3月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号：CGMCC No.7383。

实施例2菌株C-5对缓解丁草胺药害的修复效果

LB培养基接种5%种子，200r/min，30℃培养3天，发酵液离心取上清。每毫升活菌数约为5×10⁹-4×10¹⁰。在药害水稻幼苗中添加降解菌C-5并对药害水稻幼苗的出苗率，株高等进行考察。试验结果如下：

由图3-6可明显看出浓度为5mg/L时，对药害幼苗的株高修复效果最好。

由表1综合分析可知，添加降解菌C-5后对水稻的出苗率，株高，根长，株鲜重均有比较明显的修复效果。在5mg/L，10%（OD600=1.34）接菌量下，出苗率达到87%，仅比空白低10%，比未加菌组高50%。株高比空白低44%，比未加菌高93%，对药害的修复效果达到最好。

菌株C-5在丁草胺初始浓度为20mg/L、pH7.0、温度30℃，接种量为5%（OD600=1.34）时，该菌株对丁草胺的降解率达76%以上。在10mg/L，20mg/L浓度下虽然修复效果都不如5mg/L浓度时，但从表1中能明显看出，在10%接菌量下还是有一定修复效果的。

表1C-5对药害水稻植株生长的影响

注：数据分析采用LSD法单因素方差分析，A,B,C表示在1%水平下差异极显著，a,b,c表示在5%水平下差异显著。

由此得出：降解菌C-5后对药害水稻幼苗的出苗率，株高，根长，鲜重等均有比较明显的影响，可缓解丁草胺药害，对药害植株具有修复效果。

实施例3菌株C-5微生态菌剂的制备

提取活化菌株C-5，LB培养基接种5%种子，200r/min，30℃恒温箱培养3天。采用血球计数板计数，菌体浓度为每毫升5×10⁹-4×10¹⁰个细菌细胞。

其中根据不同的应用方面制备不同的剂型：

（1）液体制剂：用500mL三角瓶装100ml LB培养基，常规灭菌，冷却后再超净工作台上，用无菌水直接洗下斜面菌体接种入发酵三角瓶中，摇瓶培养30℃，200r/min，培养24h。马上转入发酵罐发酵，细菌发酵罐培养基的配制、灭菌，冷却后接种与发酵，30℃，200r/min，培养48h中止发酵，菌体的浓度为每毫升5×10⁹-4×10¹⁰。采用塑料瓶或者塑料袋包装发酵液。

（2）固体粉剂：参照细菌摇瓶培养基的配制，用500mL三角瓶装100ml LB培养基，常规灭菌，冷却后再超净工作台上，用无菌水直接洗下斜面菌体接种入发酵三角瓶中，摇瓶培养30℃，200r/min，培养24h。马上转入发酵罐发酵，细菌发酵罐培养基的配制、灭菌，冷却后接种与发酵，30℃，200r/min，培养48h中止发酵，离心发酵液，得到菌体，向其中加入木炭粉吸附菌体，菌体浓度为每克粉剂含2×10⁹个菌体。用塑料袋进行包装。

实施例4菌株C-5微生态菌剂修复水稻丁草胺药害效果

采用实施例3制备的微生态降解菌剂（液体制剂）修复水稻丁草胺药害。每1公斤降解菌剂用600-800倍清水混匀，水稻田施用丁草胺后，喷雾器施到田间。该施药方式的作用和特征为降解水稻根际周围的丁草胺，降解根际周围土壤的丁草胺，修复水稻丁草胺的药害，经检测水稻产量提高5-10%。

实施例5菌株C-5微生态制剂修复水稻丁草胺药害效果

采用实施例3制备的微生态降解菌剂(固体制剂)与水稻基肥混合施用。按每1公斤降解菌剂与用于1亩水稻田的水稻基肥混匀，施至田间。该施药方式的作用和特征为降解水稻根际周围的丁草胺。防止丁草胺侵入水稻根部并吸收，修复水稻丁草胺的药害，经检测水稻产量提高5-10%。

实施例6菌株C-5微生态制剂修复丁草胺污染水体的效果

采用实施例3制备的微生态降解菌剂（液体制剂或固体制剂）与受污染水体混合，保证受污染水样中的菌体数约至少每毫升5×10⁷个菌体，处理7天，采用高效液相色谱仪测定丁草胺的含量在0.05mg/L以下。该施药方式的作用和特征为降解环境样品水体中的丁草胺，防止丁草胺污染水扩大污染，经检测样品中的丁草胺降解率达95%以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.代尔夫特氏菌（Delftia sp.）C-5，其保藏号为：CGMCC No.7383。

2.含有权利要求1所述代尔夫特氏菌C-5的菌剂。

3.一种制备权利要求2所述菌剂的方法，其特征在于，在LB培养基中发酵代尔夫特氏菌C-5，将得到的发酵液制备成液体制剂或固体制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：发酵温度为30℃，转速为200r/min，发酵时间为3天。

5.权利要求1所述代尔夫特氏菌C-5在降解水体中丁草胺中的应用。

6.权利要求1所述代尔夫特氏菌C-5在降解土壤中丁草胺中的应用。

7.权利要求1所述代尔夫特氏菌C-5在防治水稻免受丁草胺药害中的应用。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，将所述代尔夫特氏菌C-5制备成菌剂，接种于水体、土壤或基肥中。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，接种量按重量百分比为5-10%。

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