CN116376704A - 一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，首先在第一阶段通过富营养培养使微藻大量生长，以获得较高生物量的微藻细胞；在第一阶段淀粉合成的初期利用离心法收集微藻细胞，随后将这些微藻细胞转入第二阶段培养，同时在第二阶段开始时加入正磷酸盐，进一步抑制胞内淀粉的合成，使得微藻胞内的碳被更多的用来合成油脂，提高胞内油脂含量，从而获得含油量高的微藻细胞，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物能源技术领域，具体涉及一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法。
背景技术
微藻生长速度快，固碳效率高，产脂能力强，微藻的固碳和产脂能力是传统油料作物的数十倍，微藻油脂中富含三酰甘油，三酰甘油则是生产生物柴油的良好原料。此外，微藻环境适应能力强，能够在沙漠、盐碱地、滩涂等非农业耕地上生长，不与人争地，利用微藻生产生物柴油具有广阔的应用前景。
尽管利用微藻生产生物柴油具有诸多优势，但目前其生产成本较高。2022年，我国微藻生物柴油的生产成本约合1.99美元/kg，远高于石化柴油约0.85美元/kg的市售价格。研究发现，在规模化培养过程中微藻油脂产率低，难以满足工业化生产的需求，是导致生产成本过高的关键。生物量和油脂含量是影响微藻油脂产率的两大因素，二者一般存在“此消彼长”的关系，在适宜培养条件下，微藻生长速度快，生物量高但油脂含量低；在受到胁迫时，微藻生长减缓，但会合成大量油脂来储存碳和能量。微藻生长和油脂积累的制约关系导致难以获得较高的油脂产率，限制了微藻生物柴油的发展。
目前为了能够同时获得较高的生物量和脂质产量，多采用自养-缺氮两阶段培养促进微藻油脂合成的方法。氮缺乏可以促进产油微藻油脂的累积，其原因为氮源充足时，细胞生长旺盛，蛋白质、脂类和核酸等生物活性物质均正常合成，因此所得脂肪酸含量较低；但氮源缺乏时，蛋白质和核酸等含氮化合物的合成受到限制，而含氮元素较少的贮存脂类和绝大多数膜质仍能继续合成，因此在细胞干重中的百分含量增加。
在自养-缺氮的两阶段培养技术中，通常在微藻细胞生长到稳定期生物量最大时离心细胞，随后进行第二阶段缺氮培养。然而，由于稳定期时间较长，在稳定期胁迫的施加时间点尚不明确，导致产脂效率不高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，以解决微藻细胞产脂效率不高的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将微藻按0.4-0.6g/L的生物量浓度接种到培养基一中，再将培养基一置于无菌培养室中通气培养，培养温度为28-33℃，通气速率为0-1vvm，光照强度为0-10W/m2，培养时间为60-84h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为28-33℃，通气速率为0-1vvm，光照强度为0-10W/m2，培养时间为24-120h，得到微藻成品；所述培养基二是在去除氮源的培养基一中加入淀粉抑制剂，其余组分同培养基一。
研究发现，微藻的生长分为两个阶段，第一阶段是微藻细胞大量分裂繁殖阶段，此时细胞主要进行分裂增加细胞数目；第二阶段是胞内物质合成阶段，此时细胞主要合成大量基础物质，如蛋白质、DNA、色素等。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，微藻为普通小球藻、蛋白核小球藻或斜生栅藻。
进一步，培养基一为SM培养基、Asp2培养基、Zarrouk培养基、BG-11培养基或MediumA培养基。
进一步，第一阶段和第二阶段的培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2。
进一步，第一阶段的培养时间为72h，第二阶段的培养时间为96h。
如图1所示，在生长的对数期，胞内物质合成的过程就已经开始，在到达稳定期时，细胞内的碳已经被大量用于合成蛋白质、DNA、色素等基础物质，如在此时离心细胞进行缺氮胁迫操作，由于胞内碳原料已被合成其他物质导致不充足，使得油脂产量不高。但如果在胞内物质合成的初期离心微藻细胞进行缺氮培养，可使胞内的碳立即被用于合成油脂，从而提高两步培养法的产脂效率。
进一步，淀粉抑制剂为正磷酸盐。
进一步，淀粉抑制剂为K2HPO4。
进一步，淀粉抑制剂的加入浓度为0.4-0.6mmol/L。
进一步，淀粉抑制剂的加入浓度为0.5mmol/L。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：微藻通过光合作用固定空气中的CO2并将其合成胞内含碳物质，这些含碳物质主要用于生理活动和生长，以及合成淀粉和油脂等储能物质。通过添加正磷酸盐可以有效地抑制淀粉合成途径中ADP葡萄糖焦磷酸化酶的活性，进而抑制微藻细胞淀粉的合成，提高油脂产率。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明关键点在于明确细胞内物质合成时间点，在淀粉合成初期施加胁迫，同时添加正磷酸盐抑制淀粉合成，使更多的碳流向油脂合成途径，进一步提高两阶段培养法的产脂效率，相对于传统单阶段培养模式，本发明大大提高了微藻细胞的脂质生产力；
2.本发明在微藻培养过程中充分利用空气中的无机营养元素，降低了微藻的培养成本；
3.该模式能实现微藻生长阶段的可控培养，适合应用于工业化生产。
附图说明
图1为微藻生长过程图；
图2为第一阶段生物量浓度变化图；
图3为第一阶段淀粉含量变化图；
图4为第一阶段油脂含量变化图；
图5为第二阶段生物量浓度变化图；
图6为第二阶段淀粉含量变化图；
图7为第二阶段油脂含量变化图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将蛋白核小球藻按0.5g/L的生物量浓度接种到BG-11培养基中，再将培养基置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2，培养时间为72h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的蛋白核小球藻的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2，培养时间为96h，得到蛋白核小球藻成品，培养基二是在缺少NaNO3的BG-11培养基中加入0.5mmol/L K2HPO4，其余组分同BG-11培养基；此组为72h+P组。
通过对72h+P组第二阶段的生物量浓度、淀粉、油脂含量的监测，生物量浓度每12h检测一次，淀粉和油脂含量每24h检测一次，得到第二阶段生物量浓度、淀粉含量、油脂含量的变化曲线，如图5-7所示。
实施例2：
一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将普通小球藻按0.4g/L的生物量浓度接种到SM培养基中，再将培养基置于无菌培养室中通气培养，培养温度为28℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为6W/m2，培养时间为60h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的普通小球藻的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为28℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为6W/m2，培养时间为120h，得到普通小球藻成品，培养基二是在缺少NH4NO3的SM培养基中加入0.4mmol/L Na2HPO4，其余组分同SM培养基。
实施例3：
一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将斜生栅藻按0.5g/L的生物量浓度接种到Asp2培养基中，再将培养基置于无菌培养室中通气培养，培养温度为33℃，光照强度为10W/m2，培养时间为84h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的斜生栅藻的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为33℃，光照强度为10W/m2，培养时间为96h，得到斜生栅藻成品，培养基二是在缺少NaNO3的Asp2培养基中加入0.5mmol/LK2HPO4，其余组分同Asp2培养基。
实施例4：
一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将蛋白核小球藻按0.6g/L的生物量浓度接种到MediumA培养基中，再将培养基置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为1vvm，培养时间为84h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的蛋白核小球藻的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为1vvm，培养时间为24h，得到蛋白核小球藻成品，培养基二是在缺少NH4NO3的MediumA培养基中加入0.6mmol/LNa2HPO4，其余组分同MediumA培养基。
对比例1：
一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将蛋白核小球藻按0.5g/L的生物量浓度接种到BG-11培养基中，再将培养基置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2，培养时间为72h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的蛋白核小球藻的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2，培养时间为96h，得到蛋白核小球藻成品，培养基二是BG-11培养基中缺少NaNO3，其余组分同BG-11培养基；此组为72h组。
通过对72h组第二阶段的生物量浓度、淀粉、油脂含量的监测，生物量浓度每12h检测一次，淀粉和油脂含量每24h检测一次，得到第二阶段生物量浓度、淀粉含量、油脂含量的变化曲线，如图5-7所示。
对比例2：
一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，包括以下步骤：
第一阶段：将蛋白核小球藻按0.5g/L的生物量浓度接种到BG-11培养基中，再将培养基置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2，培养时间为120h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的蛋白核小球藻的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2，培养时间为96h，得到蛋白核小球藻成品，培养基二是在缺少NaNO3的BG-11培养基中加入0.5mmol/L K2HPO4，其余组分同BG-11培养基；此组为120h+P组。
通过对120h+P组全培养过程的生物量浓度、淀粉、油脂含量的监测，生物量浓度每12h检测一次，淀粉和油脂含量每24h检测一次，得到生物量浓度、淀粉含量、油脂含量的变化曲线，如图2-7所示。
结果分析：
1.第一阶段培养
检测120h+P组中蛋白核小球藻在第一阶段中0-120h的生物量浓度变化状况，如图2所示。结果表明蛋白核小球藻生物量浓度一直在增长，在第120h达到稳定期，此时生物量浓度最大，传统的自养-缺氮培养通常在此时间点进行阶段转换。
图3是第一阶段蛋白核小球藻的淀粉含量变化图，淀粉含量先缓慢减少直至48h时开始增长，随后一直呈直线上升趋势，可以初步确定第72小时为胞内淀粉初期合成时间点。
图4是第一阶段蛋白核小球藻的油脂含量变化图，可以看出第一阶段自养过程中微藻的油脂含量增长速度较缓慢，各个时间点测得的数据差距很小，油脂含量变化不大，说明在第一阶段中，微藻的生长更多体现在生物量浓度的积累。
在油脂含量变化不大时，采用油脂产率对微藻油脂进行表征，油脂产率计算公式如下：
式中，Ct为生物量浓度，g/L；Lt为油脂含量，％；Ct0为初始生物量浓度，g/L；Lt0为初始油脂含量，％；T为培养时间，天。
表1为120h+P组第一阶段各时间点的油脂产率。
表1第一阶段油脂产率
| Time(h) | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 |
| 油脂产率(mg/L/d) | 27.53 | 59.12 | 67.69 | 62.15 | 56.12 |
2.第二阶段培养
如图5-7所示，在第二阶段培养120h后，72h+P组的生物量浓度最高，淀粉含量最低，但三组之间油脂含量差异不大。
表2为第二阶段各时间点的油脂产率。
表2第二阶段油脂产率
从最终油脂产率来看，72h+P组的油脂产率最高，这是因为通过优化阶段转换时间点以及加入正磷酸盐抑制淀粉的合成，使得更多的碳被用于生长和油脂合成，提高了自养-缺氮两阶段培养法的产脂效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一阶段：将微藻按0.4-0.6g/L的生物量浓度接种到培养基一中，再将培养基一置于无菌培养室中通气培养，培养温度为28-33℃，通气速率为0-1vvm，光照强度为0-10W/m2，培养时间为60-84h；
第二阶段：将第一阶段培养得到的藻液离心浓缩后接种到培养基二中，再将培养基二置于无菌培养室中通气培养，培养温度为28-33℃，通气速率为0-1vvm，光照强度为0-10W/m2，培养时间为24-120h，得到微藻成品；所述培养基二是在去除氮源的培养基一中加入淀粉抑制剂，其余组分同培养基一。
2.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述微藻为普通小球藻、蛋白核小球藻或斜生栅藻。
3.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述培养基一为SM培养基、Asp2培养基、Zarrouk培养基、BG-11培养基或MediumA培养基。
4.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述第一阶段和第二阶段的培养温度为30℃，通气速率为0.5vvm，光照强度为5W/m2。
5.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述第一阶段的培养时间为72h，第二阶段的培养时间为96h。
6.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述淀粉抑制剂为正磷酸盐。
7.根据权利要求1或6所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述淀粉抑制剂为K2HPO4。
8.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述淀粉抑制剂的加入浓度为0.4-0.6mmol/L。
9.根据权利要求1所述的高油脂产率的微藻两阶段培养方法，其特征在于：所述淀粉抑制剂的加入浓度为0.5mmol/L。
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