CN116367719A

CN116367719A - 细胞冷冻保存用的中空纤维膜

Info

Publication number: CN116367719A
Application number: CN202180073831.XA
Authority: CN
Inventors: 田岛崇嗣; 泷井由典
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2020-10-30
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2023-06-30
Also published as: US20230397602A1; JPWO2022092067A1; EP4239050A1; TWI811826B; WO2022092067A1; TW202231868A; EP4239050A4

Abstract

一种细胞冷冻保存用的纤维素酯制的中空纤维膜，其抑制用于细胞的冷冻保存时的强度降低。一种中空纤维膜，其是包含纤维素酯的细胞冷冻保存用的中空纤维膜，通过玻璃化冷冻法进行了冷冻后被融化时的断裂强度为冷冻前的湿润时的断裂强度的80％以上。

Description

细胞冷冻保存用的中空纤维膜

技术领域

本发明涉及细胞冷冻保存用的中空纤维膜。

背景技术

作为卵细胞、胚细胞等细胞的冷冻保存方法，已知有玻璃化冷冻法。在玻璃化冷冻法中，使用被称作Cryotop(注册商标)的器具。Cryotop是在柄的前端安装有非常薄的长条状的片的专用器具。对于细胞，在与玻璃化液等冷冻用的液体一起载置于Cryotop的前端的片上的状态下，利用液氮等进行冷冻保存。

近年，在这样的细胞的冷冻保存中，也对使用中空纤维膜的方法(中空纤维冷冻保存法)进行了研究。在中空纤维冷冻保存法中，对于细胞，在收纳于由乙酸纤维素形成的中空纤维膜的内部的状态下进行冷冻并保持。在该方法中，期待冷冻后的细胞的生存率提高。

然而，中空纤维膜是比较容易损坏的原材料，存在用于冷冻保存时破损的担忧，处理性有问题。例如，专利文献1(日本专利第5252556号公报)、专利文献2(日本专利第5051716号公报)及专利文献3(日本专利第6667903号公报)中公开了用于提高冷冻保存时的中空纤维的处理性的中空纤维的支撑器具等。

需要说明的是，作为现有的中空纤维膜，例如已知有如专利文献4(日本专利第5440332号公报)及专利文献5(日本专利第5212837号公报)所公开的用于血液透析、血液透析过滤等的包含乙酸纤维素的中空纤维膜。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5252556号公报

专利文献2：日本专利第5051716号公报

专利文献3：日本专利第6667903号公报

专利文献4：日本专利第5440332号公报

专利文献5：日本专利第5212837号公报

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，存在乙酸纤维素等纤维素酯制的中空纤维膜由于暴露于像用于细胞的冷冻保存这样的极低的温度、冷冻及之后的融化时的体积变化等而强度降低、发生破损的担忧。

因此，本发明的目的在于，对于细胞冷冻保存用的纤维素酯制的中空纤维膜，抑制用于细胞的冷冻保存时的强度降低。

用于解决课题的手段

(1)一种中空纤维膜，其是包含纤维素酯的细胞冷冻保存用的中空纤维膜，

通过玻璃化冷冻法进行了冷冻后被融化时的断裂强度为冷冻前的湿润时的断裂强度的80％以上。

(2)根据(1)所述的中空纤维膜，其在厚度方向上具有不均匀的结构。

(3)根据(1)或(2)所述的中空纤维膜，其中，

上述中空纤维膜的外表面的平均孔径为内表面的平均孔径的1.1倍以上。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的中空纤维膜，其中，

厚度方向截面的平均面积率为40％以上且70％以下。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的中空纤维膜，其中，

厚度方向截面的面积率在厚度方向上的变动小于5％。

(6)根据(1)～(3)中任一项所述的中空纤维膜，其中，

通过原子力显微镜对上述中空纤维膜的内表面进行测定时的算术平均粗糙度为20nm以下。

发明效果

根据本发明，对于细胞冷冻保存用的纤维素酯制的中空纤维膜，能够抑制用于细胞的冷冻保存时的强度降低。

附图说明

图1是示出中空纤维膜的内径的测定结果的图表。

图2是示出中空纤维膜的膜厚的测定结果的图表。

图3是示出中空纤维膜的断裂强度的测定结果的图表。

图4是示出中空纤维膜的断裂伸长率的测定结果的图表。

图5是示出中空纤维膜的屈服强度的测定结果的图表。

图6是用于对中空纤维膜的制造方法的一例进行说明的示意图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。需要说明的是，在本说明书中，“A～B”的形式表达是指范围的上限下限(即A以上且B以下)，在A没有单位的记载、仅B有单位的记载的情况下，A的单位与B的单位相同。

＜中空纤维膜＞

本实施方式的中空纤维膜可以适合地用于细胞的冷冻保存。

作为成为对象的细胞，可举出：包括卵细胞(受精卵等)、胚细胞、iPS细胞及ES细胞等的多能干细胞、来自多能干细胞的细胞器等人工组织(细胞聚集体)等。细胞聚集体可以由多个细胞种类构成。需要说明的是，细胞在配置于中空纤维膜的内部的状态下冷冻保存。包含分散的细胞的细胞悬浮液也可以在中空纤维膜的内部冷冻保存。

(纤维素酯)

本实施方式的中空纤维膜包含纤维素酯。构成中空纤维膜的材料中的纤维素酯的比率优选为90质量％以上，更优选为95质量％以上，进一步优选为98质量％以上。中空纤维膜可以仅由纤维素酯构成。

优选中空纤维膜具有能够看到收纳于其内部的细胞的程度的透明性。纤维素酯是透明性高的材料，因此，优选构成中空纤维膜的材料中的纤维素酯的比率高。

另外，优选中空纤维膜不溶解于玻璃化液，并且树脂成分不溶出至玻璃化液中。从该观点考虑，也优选构成中空纤维膜的材料中的纤维素酯的比率高。

作为纤维素酯，例如可举出：乙酸纤维素、邻苯二甲酸纤维素、琥珀酸纤维素等。纤维素酯优选为乙酸纤维素。乙酸纤维素对于作为杀菌剂的氯具有耐性，能够利用氯进行杀菌。

作为乙酸纤维素，例如可举出：三乙酸纤维素、一乙酸纤维素、二乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素等。从耐久性等观点考虑，乙酸纤维素优选为三乙酸纤维素。

作为乙酸纤维素，例如，由大赛璐化学工业公司市售有乙酰化度、聚合度等不同的各种乙酸纤维素(L－20、30、40、50、70、LT－35、55、105等)。优选使用6％粘度超过140mPa·s且小于200mPa·s的粘度比较低的乙酸纤维素(粘度比较低的聚合物)。

乙酸纤维素的乙酰化度优选为53～62％，更优选为55～61.5％，进一步优选为58～61.5％。需要说明的是，乙酰化度表示纤维素中的羟基的乙酸基取代度。需要说明的是，乙酰化度的理论上限为62.5％，但如果乙酰化度过高，则存在溶解性、成型性降低的可能性。

(断裂强度等强伸度)

本实施方式的中空纤维膜通过玻璃化冷冻法进行了冷冻后被融化时的断裂强度为冷冻前的湿润时的断裂强度的80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上。

另外，本实施方式的中空纤维膜通过玻璃化冷冻法进行了冷冻后被融化时的断裂伸长率相对于冷冻前的湿润时的断裂伸长率优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。

另外，本实施方式的中空纤维膜通过玻璃化冷冻法进行了冷冻后被融化时的屈服强度相对于冷冻前的湿润时的屈服强度优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。

这样一来，包含本实施方式的纤维素酯的中空纤维膜抑制了用于细胞的冷冻保存时的强度降低。

需要说明的是，断裂强度、断裂伸长率及屈服强度通过后述的实施例中的强伸度(断裂强度、断裂伸长率及屈服强度)的测定方法进行测定。

玻璃化冷冻法是通过将细胞在液氮中浸渍等来急速降低温度，从而防止容易在－60℃～－15℃下产生的所谓水的晶体化，在非晶质的玻璃状态下对细胞进行冷冻的方法。该方法在不易发生由形成冰晶导致的细胞损伤、处理所耗费的时间短、不需要特殊的机器、细胞的长期保存良好等方面比缓慢冷冻法优异。细胞的玻璃化冷冻的具体方法已开发出多种，作为一例，可举出将细胞浸渍于耐冻性的保存液，在液氮中、超低温的冰箱内以－80℃以下、更优选以－190℃以下急速地使其冷冻的方法。

需要说明的是，在冷冻及融化的前后对上述强伸度(断裂强度、断裂伸长率及屈服强度)进行比较时的玻璃化冷冻法的条件如下。

[玻璃化冷冻法的条件]

(平衡液)

组成：乙二醇(7.5质量％)、二甲基亚砜(7.5质量％)及水

浸渍时间：4分钟

(玻璃化液)

组成：乙二醇(15质量％)、二甲基亚砜(15质量％)、蔗糖(玻璃化液中0.5M)及水

浸渍时间：30秒钟

(冷冻保存条件)

冷冻方法：在液氮(LN₂)中的浸渍

保存方法：在液氮(LN₂)中浸渍的状态下保存1周

(融化方法)

在融化液(1M蔗糖水溶液)中浸渍1分钟

在稀释液(0.5M蔗糖水溶液)中浸渍3分钟

在清洗液(市售的TCM199培养基(GIBCO公司))中浸渍5分钟，进一步在相同组成的另外的清洗液中浸渍5分钟

(中空纤维膜的形状等)

中空纤维膜的内径优选为30μm以上且300μm以下，更优选为35μm以上且260μm以下。

中空纤维膜的厚度优选为20～200μm，更优选为30～150μm。需要说明的是，膜厚可以通过“(外径－内径)/2”进行计算。

中空纤维膜(中空纤维型的膜)优选由半透膜形成。这是因为，对于收纳于中空纤维膜内进行冷冻保存的细胞，不会使细胞通过，但会使培养液、冷冻保存液、上述保存液中所含的冻害保护物质等通过，因此，能够维持在中空纤维膜内的内部空间内包有细胞的状态。即，存在能够容易地将中空纤维膜的内部空间的培养液、细胞内液等置换成冷冻保存溶液的优点。

中空纤维膜的中空率优选为10～65％，更优选为12～55％。需要说明的是，中空率是中空纤维膜的横截面中的中空部的面积的比例，用“中空部截面积/(膜部截面积+中空部截面积)×100(％)”表示。

中空纤维膜的平均孔径(膜整体的微细孔的平均孔径)优选为10μm以下。作为平均孔径的测定方法，例如可举出：泡点法、压汞法。

优选本实施方式的中空纤维膜为在厚度方向上具有不均匀的结构(非对称结构)的膜。认为在中空纤维膜具有非对称结构的情况下，抑制由像用于细胞的冷冻保存这样的极低的温度、冷冻及之后的融化时的体积变化等导致的中空纤维膜的强度降低的效果高。其理由尚未明确，但作为一个理由而认为：不均匀的结构的聚合物链的缓冲能力比均匀的结构更高、更不易受到中空纤维膜的体积变化等的影响。

作为具有非对称结构的中空纤维膜，例如可举出：密度(空孔率、截面开孔率)等在厚度方向上不同的中空纤维膜。作为这样的中空纤维膜，例如可举出如下所述的膜：其在一个表面侧具有致密层，该致密层成为实质上规定了中空纤维膜的孔径的分离活性层，另一个表面侧的密度比致密层低。

优选在具有非对称结构的中空纤维膜中，一个表面的开孔率与另一个表面的开孔率不同。开孔率大的一个表面的开孔率优选为另一个表面的开孔率的1.1倍以上，更优选为1.3倍以上。认为通过具有这样的非对称结构，从而在玻璃化冷冻中，从中空纤维膜的外侧的溶液向中空纤维膜内部的溶液的传热迅速地发生，因此，能够抑制冰晶的生成，从而抑制了对膜结构、细胞的损伤。

需要说明的是，在膜表面的开孔率的测定中，首先，使用10000倍的扫描型电子显微镜(SEM)对中空纤维膜进行摄像。从得到的图像切出纵762pixel×横620pixel的区域后，使用图像解析软件(例如，WinROOF2013)将图像二值化成白/黑，求出中空纤维膜的内表面及外表面的开孔率。对10个视野实施，求出其平均，作为表面开孔率。

中空纤维膜的面积率是中空纤维膜的厚度方向截面(横截面)中的空孔部以外的实部(膜存在的部分)的面积比率。面积率通过对利用SEM对中空纤维膜的截面进行拍摄而得到的图像进行解析来决定。具体而言，将膜截面在膜厚方向上进行3等分，分割成3个区域，对它们分别测定面积率。3个区域是包含外表面的区域A、包含内表面的区域B、及区域A与区域B之间的区域(中心区域C)。SEM的倍率只要是能够识别空孔部和实部的倍率即可，为了测定本发明的中空纤维膜，例如5000倍～20000倍是适当的。面积率通过使用了图像解析的方法进行计算。具体而言，使用图像解析软件(例如，WinROOF2013)进行空孔部和实部(聚合物部)的二值化处理。二值化处理后，根据空孔部的总面积与聚合物部的总面积的比率计算出面积率。

在本实施方式中，中空纤维膜具有如下特征：具有上述非对称结构，并且在膜的厚度方向上的体积密度(厚度方向截面中的面积率)的变动小(优选几乎固定)。理由尚未明确，但认为通过具有上述结构特征，从而能够耐受急剧的温度变化、玻璃化液的体积变化。因此认为，能够抑制由冷冻、融化导致的中空纤维膜结构的脆化、破坏，能够保持膜强度。

需要说明的是，厚度方向截面中的面积率的变动小是指，例如，对于厚度方向截面中包含外表面的区域A、包含内表面的区域B、及中心区域C(区域A与区域B之间的区域)而言，面积率(％)之差小。具体而言，对区域A、B及C的面积率进行测定时，从a(区域A的面积率)、b(区域B的面积率)及c(区域C的面积率)选出的2个面积率的全部组合中，2个面积率之差的绝对值优选小于5％，更优选小于3％(参照下述式)。需要说明的是，例如，区域A为从外表面至膜厚的30％深度的区域，区域B为从内表面至膜厚30％的深度的区域。

优选|a－b|＜5％、且|b－c|＜5％、且|c－a|＜5％

更优选|a－b|＜3％、且|b－c|＜3％、且|c－a|＜3％

厚度方向截面的平均面积率(例如，“(a+b+c)/3”)优选为40％以上且70％以下(参照下式)。

40％≤(a+b+c)/3≤70％

另外，在本发明中，优选中空纤维膜的内表面的平滑性高。通过使内表面的平滑性高，即使卵细胞、胚细胞与中空纤维膜的内表面接触，也能够将给细胞表面带来伤痕等的风险抑制为最小限度。这里，平滑性高是指算术平均粗糙度Ra值为20nm以下。如果平滑性高，则给细胞带来的损伤变小，因此，Ra值更优选为10nm以下，进一步优选为1nm以上且小于8nm。算术平均粗糙度Ra值可以使用原子力显微镜(AFM)进行测定。

＜中空纤维膜的制造方法＞

本发明也涉及一种中空纤维膜的制造方法，上述中空纤维膜包含上述的纤维素酯。

本实施方式的中空纤维膜的制造方法例如为以下的方法。

上述的中空纤维膜的制造方法包括：

纺丝工序，将纺丝原液及内液从套管状的喷嘴经过空中行进部喷出至凝固液中，使上述纺丝原液在上述凝固液中凝固，将上述纺丝原液的凝固物从上述凝固液中拉出，由此得到中空纤维膜。

上述纺丝原液包含含有纤维素酯的树脂原料、溶剂及非溶剂，

上述内液包含水，

上述喷嘴中的纺丝原液的温度为70～110℃，内液的温度为40～70℃，

上述凝固液中的上述溶剂的量相对于上述非溶剂的比率为60/40～80/20，

喷嘴拉伸比为0.4～0.9。

上述纺丝原液中的纤维素酯的浓度优选为10～30质量％。

在上述纺丝原液中，上述溶剂的量相对于上述溶剂及上述非溶剂的总量的比率优选为60～80质量％。

上述溶剂优选为非质子性极性溶剂。

上述非溶剂优选为二醇酯。

上述空中行进部的直线距离优选为10～50mm。

[纺丝工序]

参照图6，在纺丝工序中，将纺丝原液(spinning dope)10a及内液10b从套管状的喷嘴11经过空中行进部(气隙)20喷出至凝固液21中，使纺丝原液在凝固液21中凝固，将纺丝原液的凝固物从凝固液21中拉出，由此得到中空纤维膜16。中空纤维膜的拉出等例如通过液中引导件12及辊13、14、15进行。

喷嘴11为套管状，具备外管和设置于外管的内部的内管。从外管与内管之间的空隙(狭缝)喷出纺丝原液，从内管的内部喷出内液。内径的直径(狭缝的内径)相对于外管的直径(狭缝的外径)的比率优选为110～300％，更优选为110％～200％。外管的直径优选为220～400μm，更优选为220～330μm。内管的直径优选为150～330μm，更优选为150～270μm。需要说明的是，优选内管的直径为与中空纤维膜的直径相同程度。

内管的截面积相对于狭缝的截面积的比率优选为80～120％。通过采用这样的喷嘴，能够使制膜原液的喷出线速度与抽取速度为相同程度，因此，能够减少喷出的制膜原液与内液的界面摩擦，能够防止中空纤维膜内面的粗糙。

需要说明的是，制膜原液的喷出线速度通过用制膜原液的喷出量除以根据喷嘴狭缝外径(a)和喷嘴狭缝内径(b)求出的狭缝截面积[π(a/2)²－π(b/2)²]而求出(参照下述式)。

制膜原液的喷出线速度[m/分钟]＝制膜原液的喷出量/狭缝截面积

抽取速度是设置于凝固浴的出口的辊13的旋转速度(表面速度)(参照图6)。

喷出线速度相对于抽取速度的比率(抽取速度/喷出线速度)即喷嘴拉伸比为0.4～0.9，优选为0.5～0.9。这样一来，通过使喷出线速度比制膜原液的抽取速度快，能够得到本发明的中空纤维的特征膜结构。

上述空中行进部20的直线距离(喷嘴11的前端与凝固液21的液面之间的距离)优选为10～50mm，更优选为10～40mm。

需要说明的是，可以对在纺丝工序中得到的中空纤维膜进一步实施利用纯水的清洗工序(水洗工序)。水洗工序中的水的流动优选为与中空纤维膜的移动方向成相反方向的流动(逆流)，但也可以为与中空纤维膜的移动方向相同方向的流动(顺流)。

(纺丝原液)

纺丝原液10a包含含有上述纤维素酯的树脂原料、溶剂及非溶剂。

喷嘴11中的纺丝原液的温度(设定温度)为70～110℃，优选为70～100℃。

上述纺丝原液中的纤维素酯的浓度优选为10～30质量％，更优选为10～25质量％。如果纤维素酯的浓度过低，则中空纤维膜的强度变低。另一方面，如果纤维素酯的浓度过高，则纺丝原液的粘度变得过高，存在纺丝的实施变得困难的情况。

溶剂是能够溶解纤维素酯的液体。溶剂优选为极性溶剂，优选可溶于水。极性溶剂优选为非质子性极性溶剂。作为非质子性极性溶剂，例如可举出：N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈等。

非溶剂是无法溶解纤维素酯的液体(水除外)。作为非溶剂，例如可举出：二醇酯、甘油、醇类等，优选为二醇酯。作为二醇酯，例如可举出：乙二醇、三乙二醇(TEG)、聚乙二醇(聚乙二醇200、聚乙二醇400等)、丙二醇等。

在上述纺丝原液中，溶剂(S)的量相对于非溶剂(NS)的比率(S/NS比)为60/40～80/20，更优选为65/35～75/25。如果纺丝原液中的S/NS比过小，则纤维素酯的溶解变得不稳定，因此，有时纺丝稳定性降低，或者无法得到适于本发明的用途的非对称结构。如果S/NS比过大，则有时无法得到非对称结构的中空纤维膜，或者纺丝稳定性降低。

需要说明的是，纺丝原液除了溶剂和非溶剂以外，还可以进一步包含水。

对成为中空纤维膜的构成材料的包含纤维素酯的树脂原料、溶剂及非溶剂进行混合时的材料的添加顺序、混合方法没有特别限定。

(内液)

内液包含水。内液中的水的含有率为95～100质量％，优选为98～100质量％。

优选中空纤维膜的内表面的平滑性高。这是因为能够减少由与进行冷冻保存的细胞的接触导致的损伤。

为了提高中空纤维膜的内表面的平滑性，优选的是，在将纺丝原液从喷嘴喷出后，在受到干扰的影响前使内表面迅速凝固(固定)，不使相分离过度地进行。另外，优选的是，不对凝固中及凝固后的内表面施加会带来拉伸之类的外力，极力地抑制中空纤维膜结构固定后的内径变动等。

为了使内表面快速地凝固，优选使用相对于纺丝原液10a而言凝固性高的内液10b，或者采用容易凝固的纺丝原液组成、温度条件。

因此，在本实施方式的制造方法中，使用相对于包含纤维素酯的纺丝原液而言凝固性高的包含水的内液。

除水以外，一般作为纤维素酯的非溶剂使用的乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇200或400、甘油、丙二醇等也可以分别单独或混合使用。在使用以水作为主体的内液的情况下，作为除水以外的成分，也能够以5重量％作为上限而添加上述非溶剂、作为纤维素三乙酸酯系聚合物的溶剂的N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。

喷嘴11中的内液的温度(设定温度)为40～70℃，优选为45～65℃。如上所述，喷嘴11中的纺丝原液的温度(设定温度)为70～110℃，优选将内液设定为比其更低的温度。喷嘴11中的内液的温度优选比喷嘴11中的纺丝原液的温度低10℃以上低，更优选低20℃以上，进一步优选低30℃以上。

将纺丝原液10a和内液10b从套管状的喷嘴11喷出时，从能够提高纺丝原液(中空纤维膜)的内表面的凝固性(凝固速度)的方面考虑，优选在纺丝原液与内液之间设置温度差。通过提高内表面的凝固速度，能够得到具有非对称结构(在厚度方向上不均匀的结构)的中空纤维膜。另外，在将内液的温度设定为特定的范围的基础上，将后述的凝固液的组成调整为特定的范围，或者调整喷嘴拉伸的做法，成为提高中空纤维膜内表面的平滑性、虽然是非对称结构但是能够在膜截面中减少膜在厚度方向上的体积密度(面积率)的变化的一个原因。需要说明的是，为了在纺丝原液与内液之间设置温度差，优选使用：具有能够在直到即将喷出之前分别对纺丝原液和内液进行温度控制的结构的喷嘴。

(凝固液)

凝固液优选包含溶剂和非溶剂(水除外)。需要说明的是，在该情况下，凝固液除了溶剂和非溶剂以外，可以还包含水。

凝固液中的溶剂及非溶剂的总量的比率(凝固液的浓度)为60～90质量％，优选为65～90质量％。由此，能够得到本发明的中空纤维膜的特征结构。

另外，凝固液的温度优选为20～60℃，更优选为30～50℃。

实施例

以下，举出实施例，对本发明更详细地进行说明，但本发明不限定于这些实施例。

[实施例1]

通过实施方式中说明的中空纤维膜的制造方法，在以下的条件下制造实施例1的中空纤维膜。

(纺丝原液的组成)

原料树脂(纤维素酯)：三乙酸纤维素(CTA)(LT75、大赛璐化学工业制)

原料树脂浓度(聚合物浓度)：17.5质量％(纺丝原液中)

溶剂：N-甲基吡咯烷酮(NMP)

非溶剂：三乙二醇(TEG)

[溶剂/非溶剂(S/NS)比＝7/3]

内液：水

(纺丝原液的制备)

通过将上述的原料树脂的粉末与其他材料一起进行混合，从而制备在纺丝工序中使用的纺丝原液。

(凝固液的组成)

溶剂(S)：NMP

非溶剂(NS)：TEG

水

凝固液的浓度[(S的质量+NS的质量)/凝固液的质量]：78质量％

S/NS比与纺丝原液相同。

(纺丝工序的条件)

纺丝原液的喷出温度(设定温度)：93℃

内液(水)的喷出温度(设定温度)：55℃

喷嘴：套管状喷嘴(外管的直径：270μm、内管的直径：200μm)

空中行进部的距离(气隙长度)：25mm、

空中行进部的滞留时间：0.025秒钟

凝固液的温度：43℃

拉出速度：60m/分钟

喷嘴拉伸比：0.78

[水洗工序的条件]

水洗槽的流动：逆流

温度98℃

[实施例2，3]

如表1所示，变更喷嘴拉伸比。除此以外的方面与实施例1同样地进行，制造实施例2及实施例3的中空纤维膜。将对得到的中空纤维膜的内表面的算术平均粗糙度、面积率进行测定而得到的结果示于表2。

[比较例1、2]

如表1所示，变更纺丝原液、内液及凝固液各自的组成、以及各制造条件。需要说明的是，使用液体石蜡作为内液，内液的设定温度未特别控制，为与纺丝原液温度相同程度。除此以外的方面与实施例1同样地进行，制造比较例1及比较例2的中空纤维膜。

[表1]

PA231058H

[面积率的测定]

将湿润状态的中空纤维膜浸渍于液氮中，使其冷冻后，从液氮中取出，立即进行弯折割断，由此得到具有平滑的截面(厚度方向截面)的样品。以能够观察截面的方式将样品固定于试样台，对样品的截面进行碳蒸镀。使用扫描型电子显微镜(日立制S－2500)以加速电压5kV、倍率10000倍对蒸镀后的样品的截面进行摄像。对于得到的图像中与上述的区域A～C(包含外表面的区域A、包含内表面的区域B、及区域A与区域B之间的中心区域C)分别相当的区域的中心部附近，使用图像解析软件WinROOF2013，进行空孔部和聚合物部的二值化处理。二值化处理之后，根据空孔部与聚合物部的比率计算出面积率。这里，区域A是从外表面至膜厚的30％深度的区域，区域B是从内表面至膜厚的30％深度的区域。

需要说明的是，有时由于割断、电子束，从而截面的一部分溶解等结构变得不清晰，因此，在该情况下，使用结构清晰的部分进行测定，或者变更样品重新拍摄照片。

将面积率的测定结果示于表2。

[算术平均粗糙度的测定]

准备以能够观察中空纤维膜的内表面的方式剖开(沿着中空纤维膜的长度方向倾斜切割)而得的中空纤维膜作为试样。使用原子力显微镜E－Sweep(Hitachi High－Technologies公司)以DFM模式在大气中进行观察。使用Si－DF3作为悬臂，使用20μm扫描仪作为扫描仪。将观测视野设为2μm见方，以256×256pixel测定中空纤维膜的内表面的算术平均粗糙度(Ra)。将算术平均粗糙度(Ra)的测定结果示于表2。

[表2]

＜冷冻保存试验＞

对于实施例1～3及比较例1、2的中空纤维膜，进行使用了玻璃化冷冻法的冷冻保存试验。玻璃化冷冻法的条件与测定上述的断裂强度(通过玻璃化冷冻法进行了冷冻后被融化时的断裂强度)时的条件同样。

对于冷冻保存试验中的实施例1～3及比较例1、2的各中空纤维膜，在最初的干燥状态(“干燥状态”)、通过水而湿润的状态(“湿润状态”)、平衡液浸润的状态(“平衡液”)、玻璃化液浸润的状态(“玻璃化液”)及冷冻后融化的状态(“融化后”)下，实施以下的测定。

[中空纤维膜的内径、外径及膜厚的测定]

通过以下的方法对内径、外径及膜厚进行测定。

使适当根数的中空纤维膜以中空纤维膜不会脱落的程度穿过在载玻片的中央开设的直径3mm的孔，沿着载玻片的上下表面通过剃刀切割中空纤维膜，得到中空纤维膜截面样品。对于得到的中空纤维膜截面样品，使用投影机(Nikon PROFILE PROJECTOR V－12)测定中空纤维膜的内径及外径。

具体而言，对每1个中空纤维膜截面测定中空纤维膜外表面的X－X方向和Y－Y方向(截面上正交的2个方向)的尺寸，将它们的值的算术平均值作为1个中空纤维膜截面的外径。另外，对每1个中空纤维膜截面测定中空部的X－X方向和Y－Y方向(截面上正交的2个方向)的尺寸，将算术平均值作为1个中空纤维膜截面的内径。需要说明的是，对10个截面同样地进行测定，将平均值作为内径及外径。

膜厚(平均值)基于中空纤维膜的内径及内径的测定结果(平均值)并通过式“(外径－内径)/2”进行计算。

将中空纤维膜的内径的测定结果(平均值)示于表3(图1)，将膜厚的测定结果(平均值)示于表4(图2)。需要说明的是，关于比较例，融化后中空纤维膜的强度低，未能制作中空纤维膜截面样品，因此，未能测定内径及膜厚。

[表3]

[表4]

[强伸度的测定]

对于实施例1～3及比较例1、2的中空纤维膜，通过以下的方法测定强伸度(断裂强度、断裂伸长率及屈服强度)。

对于中空纤维膜的强伸度而言，使用拉伸试验机(Toyo Baldwin公司制UTMII)，将1根中空纤维膜切断成约15cm的长度，以不会松弛的方式安装于卡盘间(距离约10cm)，在20±5℃、60±10％Rh的温湿度环境中以十字头速度10cm/min对中空纤维膜进行拉伸，进行测定。

根据得到的S－S曲线，读取中空纤维膜的断裂点的每个单丝的负荷(断裂强度)、伸长率(断裂伸长率)及屈服点的每个单丝的负荷(屈服强度)、伸长率(屈服伸长率)。具体而言，使用日本特开2011－212638号公报的[0061]所示的方法得到负荷及伸长率。

将断裂强度、断裂伸长率及屈服强度的各自的测定结果示于表5～表7(图3～图5)。需要说明的是，对于实施例及比较例中的各个实例分别实施测定5次，将其平均值表示为测定值。

[表5]

[表6]

[表7]

如表5(图3)所示，对于比较例的中空纤维膜而言，与冷冻前(表及图中的“干燥状态”、“湿润状态”、“平衡液”及“玻璃化液”)的值相比，在经过冷冻后被融化后的状态下，断裂强度显著降低。与此相对，在实施例的中空纤维膜的情况下，与冷冻前的值相比，即使在融化后的状态下，断裂强度也几乎未降低。需要说明的是，对于实施例的中空纤维膜而言，利用玻璃化冷冻法进行冷冻后融化的状态下的断裂强度为冷冻前的湿润时(“湿润状态”)的断裂强度的95％以上。

另外，如表6及表7(图4及图5)所示，对于比较例的中空纤维膜而言，与冷冻前的值相比，在经过冷冻后被融化后的状态下，断裂伸长率及屈服强度显著降低。与此相对，在实施例的中空纤维膜的情况下，与冷冻前的值相比，即使在融化后的状态下，断裂伸长率及屈服强度也几乎未降低。需要说明的是，对于实施例的中空纤维膜而言，利用玻璃化冷冻法进行冷冻后融化的状态下的断裂伸长率或屈服强度为冷冻前的湿润时(“湿润状态”)的断裂伸长率或屈服强度的95％以上。

根据这些结果可知，实施例的中空纤维膜能够抑制用于细胞的冷冻保存时的强度降低。

<细胞生存率的评价>

使用实施例1～3及比较例1的中空纤维膜，通过玻璃化冷冻法(中空纤维冷冻保存法)将细胞(来自猪的胚细胞)冷冻并融化后，测定生存细胞数，计算出生存率(生存细胞数相对于供试细胞数的比率)。

另外，使用作为细胞冷冻保存器具的市售品的Cryotop(Cryotop：注册商标、株式会公司Kitasato Corporation制)，通过玻璃化冷冻法(Cryotop法)将细胞冷冻、融化后，测定生存细胞数，计算出生存率。

将以上的生存率的评价结果与供试细胞数(供于试验的细胞的数)及生存细胞数一起示于表8。需要说明的是，玻璃化冷冻法的条件为与测定上述的强伸度时同样的条件，在中空纤维膜冷冻保存法中，在将细胞收纳于中空纤维膜的内部的状态下进行冷冻保存。

[表8]

	实施例1	实施例2	实施例3	比较例1	市售品
						供试细胞数(个)	34	33	34	34	93
生存细胞数(个)	34	29	31	29	59
						生存率(％)	100	87.9	91.2	85.3	63.4

如表8所示，在使用实施例1～3的中空纤维膜进行细胞的冷冻保存的情况下，融化后的生存细胞的比率(生存率)比市售品、比较例高。根据该结果可知，实施例1～3的中空纤维膜能够适合地用于细胞冷冻保存的用途。

附图标记说明

10a纺丝原液、10b内液、11喷嘴、12液中引导件、13、14、15辊、16中空纤维膜、20空中行进部、21凝固液。

Claims

1.一种中空纤维膜，其是包含纤维素酯的细胞冷冻保存用的中空纤维膜，

2.根据权利要求1所述的中空纤维膜，其在厚度方向上具有不均匀的结构。

3.根据权利要求1或2所述的中空纤维膜，其中，

所述中空纤维膜的外表面的平均孔径为内表面的平均孔径的1.1倍以上。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的中空纤维膜，其中，

厚度方向截面的平均面积率为40％以上且70％以下。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的中空纤维膜，其中，

厚度方向截面的面积率在厚度方向上的变动小于5％。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的中空纤维膜，其中，

通过原子力显微镜对所述中空纤维膜的内表面进行测定时的算术平均粗糙度为20nm以下。