CN116355918A - 一种寨卡病毒的靶点序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请是申请号为CN202010726669.4的分案申请。本发明提供一种寨卡病毒的靶点序列，其为RNA病毒基因序列中含20～40个碱基、且与人类基因组序列相似性不低于95％的核酸序列片段，其包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的靶点序列。本发明还涉及构建上述靶点序列的引物组合物、与上述靶点序列相关的生物材料以及上述靶点序列的应用。本发明构建的上述序列的病毒片段具有与人基因组DNA相互作用的功能，其类似病毒miRNA，同时验证了过表达RNA病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响，并提出上述靶点片段是RNA病毒的重要致病物质的全新概念。上述靶点序列对RNA病毒的检测及诊断、药物筛选以及开展RNA病毒引发的病症的治疗等均具有重要应用价值。

Description

一种寨卡病毒的靶点序列及其应用
本申请是申请号为CN202010726669.4、申请日为2020年07月25日、发明名称为“一种RNA病毒的靶点序列及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA病毒的靶点序列及其应用，具体为一种寨卡病毒的靶点序列及其应用。
背景技术
RNA病毒也称RNA型病毒，是指遗传物质是RNA的病毒。病毒RNA的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低很低，几乎是没有的，所以其变异很快。而疫苗是要根据病毒的固定核苷酸序列或蛋白进行开发制作的，所以RNA病毒疫苗较难开发。它不可单独进行繁殖，必须在活细胞内才可进行。常见的RNA病毒有：艾滋病病毒、脊髓灰质炎病毒、烟草花叶病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、新型冠状病毒(2019-nCoV)等。冠状病毒是一类带有囊膜的不分节段的正义RNA病毒，能够感染多种哺乳动物和鸟类等宿主，特别是对人类可导致轻度至中度呼吸道疾病。在过去的二十年里，人畜共患传染过程中导致了两种高致病性冠状病毒的出现：严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratorysyndrome，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome，MERS-CoV)。目前没有特异性针对冠状病毒的有效靶点。
核酸是生物体内遗传信息储存与传递的一个重要载体，在生物功能的调控上也发挥着极其重要的作用，随着人们对核酸的结构与功能认识的不断深入，核酸作为药物设计靶点的价值越来越被大家所重视。MicroRNA(miRNA)是一类长约22～25个核苷酸的单链短序列小RNA，它不编码蛋白质，但能以其5’末端第2～8位核苷酸以非完全性碱基配对的方式结合于同源mRNA的3’UTR(3’非转译区)，最初人们认为miRNA的发卡结构中只有其中一条链中的序列发挥调控作用，通过诱导信使RNA(mRNA)的降解和转录后基因沉默来负向调节基因的表达发挥功能，而另一条链会降解掉，但后来越来越多的证据发现miRNA的上下链，都会作为独立的miRNA发挥作用。除了miRNA负向调控，有些个案报道在特殊情况下miRNA能够促进基因的表达或翻译(Vasudevan et al.,2007,Vasudevan and Steitz,2007,Place etal.,2008)。XIAOM等人在2015年发现例如has-miR-26a-1、has-miR-3179和has-24-1等能够与增强子结合，该结果发表在RNABiology杂志上，并在全基因组的水平上激活基因表达(XIAO M,LI J,LI W,et al.2017.MicroRNAs activate gene transcriptionepigenetically as an enhancer trigger.RNA Biol[J],14:1326-1334.)。发明人前期工作表明，miRNA的这种特性并非是个例，而是适用于很多组织和细胞。在研究miRNA自身的表观遗传学调控机制时，在7种不同的组织细胞中，对1594条miRNA前体进行了系统分析，意外地发现有300多条miRNA前体在基因组中的位置与增强子的组蛋白修饰标志H3K4mel或H3K27ac高度重叠。这让发明人将同时具有组织细胞特异性的miRNA和增强子这两个重要的分子生物学事件联系起来(Xiao et al.,2017)。基于此，发明人认为miRNA是重要的双功能分子。当miRNA位于细胞浆时，它可以作用于mRNA 3’UTR区域，如同灭火器一样，阻断mRNA的翻译进而发挥基因的负调控作用；与此相反的是，当它位于细胞核中时，就像一个点火器，通过结合增强子改变增强子的染色质状态，从而激活基因的转录表达。发明人把定位于核内并有激活作用的RNA称为NamiRNA(nuclear activating miRNA)。基于此，发明人提出了NamiRNA-增强子-靶基因网络激活模型，用于揭示细胞核内miRNA功能。令人惊喜的是，NamiRNA与靶基因存在直接的正向调控关系，它还参与肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭等生物学行为。
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是蛋白多糖中糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)的主要成分之一，也是目前研究较多的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分之一，在正常组织功能和发育中发挥重要作用，包括为细胞提供支持和锚定，促进细胞间信号传导以及促进细胞移动和迁移。HA由一类称为HA合成酶(hyaluronic acid synthase，HAS)的整合膜蛋白合成，其中脊椎动物具有三种类型：HAS1、HAS2和HAS3。这些酶通过将葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖反复添加到新生多糖中来延长HA，并通过细胞膜挤出和进入细胞外空间。HA是一种大分子黏性糖胺聚糖，可由Ⅱ型肺上皮细胞、内皮细胞及肺成纤维细胞分泌，其中成纤维细胞可受致病因子，如氧自由基等的刺激合成大量HA。HA的基本结构是β-D葡萄糖酸和2-乙酰基-2-去氧-D-葡萄糖分别以β1.3和β2.4糖苷链连接的重复二糖直链分子聚合体，为最主要的糖胺多糖，HA在肺组织主要分布于毛细血管和细支气管周围的间质中，广泛表达于细胞外基质，也可表达于细胞表面。透明质酸的最大作用就是可以吸收和保存水分，一个透明质酸分子可以吸附9个水分子，透明质酸的增多无疑会加剧局部水分的增多。已有研究表明HA具有增加局部水肿并促进炎症级联反应，导致白细胞迁移、增殖和分化。
透明质酸合成酶抑制剂(4-Methylumbelliferone，4-MU)是HA合成的选择性抑制剂。4-MU是一种香豆素家族的衍生物。其他香豆素衍生物，例如苯丙香豆素
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金华法林/>
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由于其抗凝机制多以预防性药物来减少心血管疾病的发生。ACE2是新型冠状病毒的受体，其表达量与新型冠状病毒引起的疾病的进程有紧密的相关性。HAS1、HAS2、HAS3是透明质酸合成酶家族，其表达量在细胞外基质中的沉积增加与新型冠状病毒引起的疾病及其并发症有紧密的关系。FBXO15是F-box蛋白家族的成员，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。MYL9是肌球蛋白轻链9，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。KALRN是RhoGEF激酶，其表达量与结节病的进程和肾脏和肺等多个脏器的炎症有相关性。ATP8B1是P型阳离子转运ATPase家族的成员，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。IGF2R是胰岛素样生长因子2和甘露糖6-磷酸的受体，其表达量与炎症应答有紧密的相关性。C5AR1是补体成分5a受体1，其表达量与炎症反应的调控有紧密的相关性。EPAS1是内皮PAS结构域蛋白1，其表达量与炎症反应的调控有紧密的相关性。TIMM21是内线粒体膜转位酶21，其表达量与炎症反应的调控有紧密的相关性。
到目前为止，RNA病毒尤其是新型冠状病毒引起非典型肺炎的机制并不清楚，其他相关RNA病毒的致病机制和疫苗设计或生产也存在诸多问题，加之RNA病毒引起的疾病缺乏有效的治疗药物和治疗方案，病毒的毒力及易感人群难以确定，迫切需要研究RNA病毒的致病机制，开发RNA病毒的致病性和人群易感性检测，寻找RNA病毒的特效药物和治疗方案，制备高效低毒的RNA病毒疫苗，为人类战胜RNA病毒感染提出切实可行的中国方案。
发明内容
新冠病毒的RNA序列大约3万个碱基，发明人前期将新冠病毒与人体基因组做比较时，发现新冠病毒核酸序列中隐含了5段人的基因组序列，长度在24-28bp不等。这5段序列在人和灵长类动物中极其保守，序列居然一个碱基也不差，这5段序列的保守性提示其具有重要意义。为了便于对其功能和应用进行研究，发明人随将上述保守序列命名为HIS(HumanInsert Sequence)。与此同时，发明人发现SARS和MERS病毒基因组中也分别有3段和2段人的基因组序列(HIS)。新冠病毒、SARS、MERS毒基因组中HIS的位置分布，主要分布在人体增强子区域，提示其与基因激活有关；SARS-CoV-2中的HIS所在增强子上下游200K范围内含有大量的炎症因子基因；HIS所在的RNA区域可以形成病毒来源的发卡结构，进一步分析发现HIS可以形成发卡结构具有miRNA的前体特征；以HIS为基础通过生物信息学分析和预测其靶基因也大多与炎症因子有关；SARS病毒的和新冠病毒的HIS靶点区域有透明质酸合成酶(HAS)基因；根据发明人前期研究工作中发现并提出的NamiRNA-增强子-基因激活理论(Xiao et al.,2017)，发明人认为新冠病毒及SARS病毒的HIS序列在病毒感染人体后会激活炎症因子，引起炎症因子风暴并可能通过激活透明质酸合成酶产生过量的透明质酸引起肺部毛玻璃样改变进而导致ARDS。鉴于新冠病毒中的HIS序列是冠状病毒致病的重要物质基础和重要发病机制，发明人进一步通过实验证实SARS-COV-2、SARS-COV以及MERS病毒的HIS序列在细胞中过表达时能够激活包括HAS以及炎症因子的表达，同时细胞外的透明质酸产生增加。更加重要的是发现新冠患者血清中的透明质酸含量与患者的病情严重程度密切相关。发明人认为病毒靶点序列也可以引起血液学指标的改变，结合临床数据，可用于临床病情检测。因此，冠状病毒的靶点既可以运用于临床诊断，针对该靶点设计药物治疗以及成为设计/优化疫苗的可能，这一类靶点的开发可以推广至其他RNA病毒，并以典型的冠状病毒、艾滋病病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒进行验证，获得相似的结果，尤其其他RNA病毒的HIS序列与人体基因组配对的区域大多与这类RNA病毒的致病性和特征有关联。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：
本发明通过将RNA病毒的基因序列与人基因组进行对比筛选出多段与人基因组相似性为不低于95％(即互补配对为95％以上)的靶点序列，其结构稳定，且成功构建出的病毒片段具有与人基因组DNA相互作用的功能，且其类似病毒miRNA，同时验证了过表达RNA病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响，上述筛选及验证对RNA病毒的诊断及检测、筛选药物进行RNA病毒引发的病症的治疗、以及设计/优化疫苗方面均具有很好的应用价值。
本发明所涉及的RNA病毒包括感染人的RNA病毒，感染家禽家畜以及人畜共患的RNA病毒。其中与人体基因组一致的靶点序列命名为HIS(Human Insert Sequence)，与鸡、猪、狗、鸭基因组一致的靶点序列分别命名为CIS(Chicken Insert Sequence)、PIS(PigInsert Sequence)、DIS(Dog Insert Sequence)、MIS(Mallard Insert Sequence)。这些病毒特定的靶点序列可以和SARS-COV-2一样，可以通过增强子激活基因的表达，与病毒在人和其他物种中引起的疾病密切相关，进而做为靶标可用于病毒的毒力判断，其反义RNA序列可用于药物的开发，以及缺失该靶点序列作为减毒疫苗设计的重要策略。
本发明克服现有技术中所存在的缺陷，提供一种RNA病毒的靶点序列，其具有与人类基因组相互作用的功能，并验证了过表达RNA病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响，并将该靶点序列及其反义RNA序列进行开发应用于RNA病毒诊断、治疗及其设计/优化疫苗。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种RNA病毒的靶点序列，所述靶点序列为RNA病毒核苷酸序列中包含的不小于20～40个碱基、且与人类基因组序列或相关家畜基因组序列的相似性为不低于95％(即95％以上的一致性或互补配对)的核酸序列片段。优选，与人类基因组序列相似性为不低于95％的核酸序列片段；更优选，与人类基因组序列相似性为100％的核酸序列片段。
为了进一步优化上述RNA病毒的靶点序列，本发明采取的技术措施还包括：
进一步地，所述RNA病毒包括寨卡病毒(zika virus)，所述寨卡病毒的靶点序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3。
进一步地，所述RNA病毒还包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、埃博拉病毒(ebola virus)、艾滋病病毒中的至少一种。上述所述RNA病毒还可包括其他RNA病毒，例如诺如病毒、轮状病毒等。
进一步地，所述RNA病毒的靶点序列分别如表1.1和1.2所示(靶点序列各片段的命名方式为病毒名加HIS或其他规则名称加片段序号)。
表1.1RNA病毒的靶点序列表
Figure SMS_3
表1.2另一部分RNA病毒的靶点序列表
Figure SMS_4
Figure SMS_5
Figure SMS_6
本发明的第二个方面是提供一种用于构建任一上述的RNA病毒的靶点序列的引物组合物。例如，靶点序列SEQ ID NO.1的引物为SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.7；和/或，靶点序列SEQ ID NO.2的引物为SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.11；和/或，靶点序列SEQ ID NO.3的引物为SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.15。具体地，RNA病毒的靶点序列的引物组合物如表2所示。
进一步地，在上游引物的5’端前面加上保护碱基和EcoRI酶切位点序列CGGAATTC，下游引物的5’端前面加上保护碱基和BamHI酶切位点序列CGGGATCC。
表2–RNA病毒的靶点序列的扩增引物序列表
Figure SMS_7
Figure SMS_8
Figure SMS_9
Figure SMS_10
本发明的第三个方面是提供一种与任一上述的RNA病毒的靶点序列相关的生物材料，所述生物材料选自下述A)～B)中的一种：
A)与任一上述的RNA病毒的靶点序列互补配对的DNA和/或RNA分子；
B)含有任一上述的的RNA病毒的靶点序列或A)中所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系。
可理解的是，上述DNA分子、表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系均可为本领域常规使用的生物材料，其均可采用本领域常规方法制备。
进一步地，所述生物材料为重组载体，其构建步骤包括：1)设计引物，PCR扩增所述RNA病毒的靶点序列；2)将扩增的序列片段和表达载体酶切，连接目的序列片段和表达载体；3)将连接产物转化大肠杆菌，培养；4)鉴定后提取重组质粒并包装。其中，RNA病毒的靶点序列如上表1.1和表1.2所示，部分引物序列如上表2所示。
进一步地，所述表达载体包括但不限于pCDH载体，其他载体如pCMVp-NEO-BAN载体、pEGFP载体、pEGFT-Actin、pSV2载体、pCDNA载体、pLVX载体、pAAV载体、pET载体、pDsRed载体，其病毒相关重组载体骨架可为本领域使用的任一合适的载体。
进一步地，所述重组载体具有表达病毒相关靶点片段的功能；其中，所述相关靶点片段具有与人类基因组相互作用(相结合)的功能。所述重组载体上表达有任一上述的RNA病毒的靶点序列，例如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、寨卡病毒(zika virus)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、埃博拉病毒(ebolavirus)、艾滋病病毒的靶点序列。
本发明的第四个方面是提供一种任一上述的RNA病毒的靶点序列的应用，所述应用选自以下应用中的至少一种：在细胞水平上激活相关基因的应用、在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用、在筛选或制备用于预防或治疗RNA病毒引发的病症的药物中的应用、在制备RNA病毒检测或诊断试剂中的应用、在制备针对RNA病毒的疫苗中的应用。
进一步地，所述病症包括人的疾病、动物的疾病和人畜共患病。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，所述药物剂型包括形式可为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、气雾剂、注射剂、乳剂或混悬剂。
进一步地，在筛选或制备药物时，通过直接筛选对所述靶点序列进行调控的有效物质；或者，根据所述靶点序列所调控基因的作用，筛选针对所述靶点序列所调控基因及基因产物的有效物质。
进一步地，所述应用为RNA病毒的靶点序列在在细胞水平上激活相关基因的应用时，所述相关基因包括ACE2基因、透明质酸合成酶家族HAS1、HAS2、和HAS3的编码基因和/或片段周围200k以内基因。
进一步地，所述RNA病毒包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒或艾滋病病毒，更具体地为新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒。
进一步地，所述片段周围200k以内基因包括但不限于FBXO15、MYL9、KALRN、ATP8B1、ZHX2、IGF2R、C5AR1、EPAS1、TIMM21。可理解的是，根据RNA病毒类型的不同，其激活的相关基因也存在区别。
进一步地，所述RNA病毒为寨卡病毒，所述相关基因包括片段周围200k以内基因；其中，SEQ ID NO.1所示的靶点序列片段过表达后CNMD、VPS36、QRFPR、ANXA5、CCNA2、TMEM155、TRPC3、EXOSC9、BBS7、KIAA1109基因被激活；SEQ ID NO.2所示的靶点序列片段过表达后TAC1、OCM2、LMTK2、BR13、BAIAP2L1基因被激活；SEQ ID NO.3所示的靶点序列片段过表达后ADGRL3基因被激活。
进一步地，所述应用为RNA病毒的靶点序列在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用时，所述激活靶基因为如上所述的RNA病毒的靶点序列在细胞水平上激活的相关基因，所述相关基因如上所例举；其中，所述应用为利用所述RNA病毒的靶点序列或其反向互补序列筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物，所述反向互补序列包括反向互补RNA序列或反向互补DNA序列(例如，利用RNA病毒靶点序列的反向互补序列、RNA病毒的靶点序列或其反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰)。具体地，所述药物包括miRNA抑制剂。
进一步地，所述用于抑制激活靶基因表达的药物为病毒靶点抑制剂antagomir，其将所述RNA病毒的靶点序列的反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，全链进行甲氧基修饰，得到相对应的病毒靶点抑制剂antagomir。
进一步地，所述应用为RNA病毒的靶点序列在筛选或制备用于预防或治疗RNA病毒引发的病症的药物中的应用时，所述RNA病毒引发的病症为靶点序列引起透明质酸含量上升从而引发的病症，所述用于预防或治疗RNA病毒引发的病症的药物为透明质酸抑制剂4-MU；具体地，所述RNA病毒包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒。
可理解的是，上述药物还可包括其他能抑制被激活靶基因的药物以及其他可调节透明质酸水平(抑制透明质酸合成、降低透明质酸浓度等)的药物。
进一步地，所述应用为制备针对RNA病毒的疫苗中的应用时，在疫苗设计过程中敲除所述靶点序列。例如，敲除所述靶点序列的方法包括：CRISPR系统和/或核酶技术。CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN(转录激活因子类感受器核酸酶)等其他基因编辑技术更高。虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。核酶技术属于一种利用核酶的技术，主要是可以进行核酶的设计以进行应用。核酶属于一种能序列特异性剪切RNA的RNA分子，其可以被设计。经过设计的核酶可以用来选择特异性的mRNA片段，也可以通过结合特异性mRNA来阻断其表达。因此，这项技术可以用来进行RNA结构的研究，还可用于异常基因表达导致疾病的治疗。
进一步地，所述疫苗为减毒活疫苗。
本发明的第五个方面是提供了一种减毒活疫苗，所述减毒活疫苗的全基因组不包含上述的RNA病毒的靶点序列。
本发明的第六个方面是提供RNA病毒的靶点序列在研究针对RNA病毒所致疾病的药物靶点中的应用。
进一步地，在RNA病毒所致疾病的细胞中找到RNA病毒的靶点序列，并在RNA病毒的靶点序列周围200k以内寻找药物靶点或使用预测软件blast 2.2.30或bedtools 2.29.2在200k以外寻找药物靶点。
本发明的第七个方面是提供一种检测病毒的方法，对上述的RNA病毒的靶点序列进行检测。
进一步地，所述靶点序列的检测包括RCR扩增和核苷酸测序。
进一步地，这种对RNA病毒的靶点序列进行检测，可用以判断病毒性疾病的诊断，致病性判断及人群易感性检测。
附图说明
图1为本发明一实施例中PCR扩增冠状病毒SARS-CoV-2相关的6个靶点病毒载体的跑胶电泳图。
图2为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段在293T细胞内过表达后mRNA水平的结果示意图；其中，***，p<0.001。
图3为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段在293T细胞内过表达后基因ACE2的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01，***，p<0.001。
图4为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段在293T细胞内过表达后基因HAS1的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01，***，p<0.001。
图5为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段在293T细胞内过表达后基因HAS2的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01。
图6为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段在293T细胞内过表达后基因HAS3的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01，***，p<0.001。
图7为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-4在293T细胞内过表达后周围基因FBXO15的mRNA水平的结果示意图；其中，***，p<0.001。
图8为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-3在293T细胞内过表达后周围基因MYL9的mRNA水平的结果示意图；其中，***，p<0.001。
图9为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-1在293T细胞内过表达后周围基因ATP8B1的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01。
图10为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-5在293T细胞内过表达后周围基因KALRN的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01。
图11为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-6在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图。
图12为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段SARS-CoV-HIS-2在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01.***，p<0.001。
图13为本发明一实施例中qPCR检测冠状病毒靶点片段MERS-CoV-HIS-2在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图；其中，**，p<0.01。
图14为本发明一实施例中qPCR检测寨卡病毒靶点片段在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图。
图15为本发明一实施例中qPCR检测埃博拉病毒靶点片段在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图。
图16为本发明一实施例中qPCR检测艾滋病病毒HIV-2靶点片段在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图。
图17为本发明一实施例中qPCR检测antagomir对冠状病毒靶点片段SARS-CoV-HIS-2在293T细胞内过表达后周围基因的mRNA水平的结果示意图。
图18为本发明一实施例中qPCR检测antagomir对冠状病毒靶点片段MERS-CoV-HIS-2对激活基因mRNA水平的抑制作用的结果示意图；其中，*<0.05。
图19为本发明一实施例中qPCR检测antagomir对冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-4对激活基因mRNA水平的抑制作用的结果示意图；其中，*<0.05。
图20为本发明一实施例中qPCR检测antagomir对冠状病毒靶点片段SARS-CoV-2-HIS-3对激活基因mRNA水平的抑制作用的结果示意图；其中，*<0.05。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择；下述实施例中相关试剂及生物材料均为市售产品；下述实施例中的分子克隆技术为现有技术中在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。下述实施例主要以冠状病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒和艾滋病病毒为例进行论述。
实施例1-RNA病毒靶点过表达载体构建
本实施例为RNA病毒靶点过表达载体的构建，其步骤包括：
1、序列获取和引物设计
从NCBI的Nucleotide数据库Genbank上找到新冠病毒SARS-CoV-2基因序列，然后将病毒的全基因组核苷酸序列和人类全基因组序列进行Blast比对，最终筛选出相似性不小于95％的病毒核苷酸序列片段为病毒RNA靶点序列(下面简称靶点)，新冠病毒SARS-CoV-2筛选出5段与人基因组完全互补配对的序列以及1段与人基因不完全互补配对，寨卡病毒、埃博拉病毒、艾滋病病毒、SARS-CoV病毒和MERS-CoV病毒、其他RNA病毒用同样的方法获取靶点序列。筛选所得的靶点序列如上表1.1和上表1.2所示。
利用primer5软件分别确定上下游引物，再在上游引物的5’端前面加上保护碱基和EcoRI酶切位点序列(CGGAATTC)，下游引物的5’端前面加上保护碱基和BamHI酶切位点序列(CGGGATCC)。引物委托上海桑尼生物科技有限公司进行合成。部分靶点的引物序列如上表2所示。
2、获取RNA病毒靶点目的片段序列
以新冠病毒靶点序列为例，利用同源重组人工合成病毒靶点片段，根据序列设计的F123与R1引物进行退火后，利用F123和R2与F123和R3进行两轮巢氏PCR，Q5酶扩增目的基因片段，扩增体系和程序如下：PCR体系(总体积50μL)：5×Reactionbuffer 10μL；dNTPs(10mM)1μL；上游引物(10μM)2.5μL；下游引物(10μM)2.5μL；cDNA模板1μL；Q5聚合酶0.5μL；ddH2O 32.5μL；
PCR程序：98℃30s；98℃10s，55～72℃30s，72℃30s/kb，35个循环；72℃2min。
严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒等则利用F1与R1引物进行退火后，利用F2和R2与退火产物进行巢氏PCR获得目的片段。
3、PCR产物的回收、酶切及纯化
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收，并使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技公司)回收目的片段；酶切过程参照NEB网站酶切体系37℃酶切过夜，并采用PCR产物回收试剂盒(天根生化科技公司)纯化回收。
4、连接
利用T4连接酶将酶切后的PCR产物和酶切后的pCDH载体按照如下连接体系连接，16℃过夜。连接体系(总计10μL)：PCR产物1μL；酶切后的pCDH载体1μL；T4 DNA连接酶缓冲液1μL；T4 DNA连接酶1μL；H2O 6μL。
5、转化、挑取单克隆连接
(1)将10μl的连接产物加入50μl的DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min。
(2)42℃热激感受态细胞90s后，立即放到冰上5min。
(3)在超净工作台中加入300μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃恒温摇床中摇菌30min。
(4)菌液1000g离心5min后弃上清，剩50μl菌液，将其均匀涂到氨苄抗性的LB固体平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。
(5)从过夜培养的平板上挑取适量单克隆菌落，分别放入加有200μl氨苄抗性LB液体培养基的EP管中，37℃恒温摇床中摇菌2小时后送测序鉴定。最后通过载体PCR可以得到目的条带(图1)。
结果显示：靶点-载体的长度均为200-250bp。图1示出了分别含新型冠状病毒的6个靶点的靶点-载体的电泳结果，其中，HIS1为含SARS-CoV-2-HIS-1的靶点-载体，HIS2为含SARS-CoV-2-HIS-2的靶点-载体，HIS3为含SARS-CoV-2-HIS-3的靶点-载体，HIS4为含SARS-CoV-2-HIS-4的靶点-载体、HIS5为含SARS-CoV-2-HIS-5的靶点-载体、HIS6为含SARS-CoV-2-HIS-6的靶点-载体。
上述同样操作于SARS-CoV病毒、MERS-CoV病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒和艾滋病病毒。
实施例2–细胞过表达RNA病毒靶点序列对周围基因表达水平的影响
本实施例对293T细胞中过表达RNA病毒靶点序列对周围基因表达水平进行检测，其步骤简述如下：
1、脂质体法包制慢病毒：依照分子克隆，将SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV过表达质粒及病毒包装质粒psPAX2和衣壳质粒pMD2.G-VSVG转入293T细胞，48hr和72hr后各收取一次上清，0.45μm滤器过滤细胞碎片后得到慢病毒原液。
2、感染细胞：提前将被感染的细胞(慢病毒原液)铺20万于6cm培养皿中，待第二天细胞贴壁之后进行第一次感染，第三天再重复感染一次；第四天让细胞恢复一天不加入任何刺激；第五天开始对质粒所带的对应杀药标记进行药物筛选。
3、实时荧光定量PCR
(1)总RNA提取
准备106～107细胞，用PBS重悬后离心去除上清，加入1ml Trizol室温裂解5min，然后加入0.2ml氯仿，涡旋震荡仪震荡15s，室温静置2min。4℃离心机离心15min，13,300rpm。转移上层无色水相于另一EP管中。加入等体积异丙醇，涡旋震荡仪充分混合，入4℃离心机离心10min，13,300rpm。倒掉上清，加入DEPC水配制的75％乙醇1ml，上下颠倒至沉淀悬浮起来，入4℃离心机离心5min，13,300rpm。用移液器吸尽上清，室温干燥5～20min，期间观察沉淀形态，待其刚刚变透明时，根据沉淀的量将其溶解于40～100μlDEPC水中。取1μl在Nanodrop上测定其浓度以及OD260/OD280。提取的RNA于-80℃冰箱保存。
(2)逆转录合成cDNA
使用Takara(D2680A)的反转录PCR试剂盒，PCR反应体系和程序如下：反转录PCR体系(总体积20μL)：5×PrimeScriptBuffer 4μL；dNTP Mixture(2.5mMeach)4μL；Random6mers(100μM)1μL；OligodTPrimer(50μM)1μL；PrimeScriptReverse Transcriptase(200U/μl)0.5μl；RNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl；TotalRNA 1μg；RNaseFree dH2O补至20μL；反转录PCR程序：42℃10min，95℃2min。
(3)RT-qPCR
使用Takara实时荧光定量PCR试剂盒检测目的基因转录水平上的表达情况。实时荧光定量PCR体系(总体积10μL)：SybrGreenMix 5μL；Forward(10μm)1μL；Reverse(10μm)1μL；cDNA 3μL。
实验结果：在过表达靶点序列片段后，该片段的表达水平有上万倍的上调(图2)。其中，与冠状病毒非常相关的ACE2基因在SARS-CoV-HIS、SARS-COV-2-HIS-3和SARS-COV-2-HIS-4片段过表达后被激活(图3)。与新冠病毒相关的透明质酸合成酶家族HAS1(图4)，HAS2(图5)和HAS3(图6)基因也被SARS-CoV-HIS、MERS-CoV-HIS、SARS-COV-2-HIS-3和SARS-COV-2-HIS-4片段显著激活。最后检测SARS-COV-2-HIS-4(图7)，SARS-COV-2-HIS-3(图8)，SARS-COV-2-HIS-1(图9)和SARS-COV-2-HIS-5(图10)片段周围200k以内基因均被显著激活，在不是完全互补配对的片段SARS-CoV-2-HIS-6中得到了同样的结果(图11)，具体基因包括：FBXO15、MYL9、KALRN、ATP8B1、C5AR1、EPAS1等。SARS-COV-HIS-2(图12)和MERS-COV-HIS-2(图13)也具有相同结果，具体为SARS病毒靶点片段周围基因ZHX2的表达增加，MERS病毒靶点片段周围基因IGF2R的表达增加。此外，本实施例还检测了寨卡病毒(图14)、埃博拉病毒(图15)、艾滋病病毒HIV-2(图16)，其结果也相同，具体为：寨卡病毒靶点片段在293T细胞内过表达后周围CNMD、VPS36等16个基因的表达增加；埃博拉病毒靶点片段在293T细胞内过表达后周围VGLL4、TAMM41等15个基因的表达均增加；HIV病毒靶点片段在293T细胞内过表达后周围BMP5、MMP1、ADCYAP1基因的表达增加；HIV2病毒靶点片段在293T细胞内过表达后周围LAPTM4A、LRRC14B等8个基因的表达增加。
上述结果证明构建的载体表达病毒相关miRNA发挥着一定的功能，为之后的研究提供研究基础。
实施例3-RNA病毒靶点miRNA抑制剂(antagomiR)或反义序列对被激活靶基因的抑制作用
本实施例对RNA病毒靶点抑制剂antagomir对激活靶基因的抑制作用进行验证，其包括步骤：
步骤一：制备病毒靶点抑制剂antagomir：将RNA病毒的靶点序列的反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，全链进行甲氧基修饰，得到相对应的病毒靶点抑制剂antagomir。
步骤二：采用实施例2的方法制备病毒原液，并采用病毒原液感染细胞，将感染后的细胞分为实验组和对照组两组，其中，实验组为：加入10μM相应病毒靶点抑制剂的感染病毒的细胞液；对照组为：加入10μM感染病毒的细胞液。48小时后将实验组和对照组的细胞液按照实施例4中的实时荧光定量PCR的方法进行试验。
试验结果如图17-20所示，病毒靶点抑制剂可以特异性抑制靶点序列的复制，antagomir可以很好针对靶点序列使得被SARS-CoV-HIS-2(图17)、MERS-CoV-HIS-2(图18)、SARS-CoV-2-HIS-4(图19)和SARS-CoV-2-HIS-3(图20)激活的周围基因有显著下降的趋势，进一步验证了RNA病毒靶点的治疗价值。
本试验还进一步验证了RNA病毒靶点序列的反向互补序列(包括反义DNA和反义RNA序列)以及在RNA病毒的靶点序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，全链进行甲氧基修饰作为抑制剂对对激活靶基因的抑制作用进行验证。试验结果与抑制剂antagomiR相似，可见，上述三种抑制剂均具有对被激活靶基因的抑制作用。RNA病毒靶点序列的反义RNA或反义DNA可以作为抑制RNA病毒核酸并阻断RNA病毒的重要致病途径，其不同的修饰或不修饰产物为RNA病毒疾病的治疗提供重要的物质基础，其部分的详细序列见上表1.1。
实施例4-靶点所影响的透明质酸升高可由透明质酸抑制剂4-MU降低
本实施例对透明质酸抑制剂4-MU降低靶点所影响的透明质酸升高进行验证，其包括步骤：
采用实施例2的方法制备慢病毒和感染细胞；更换新鲜培养基，实验组加入100μM的透明质酸抑制剂4-MU，对照组加入4-MU的溶剂DMSO。24hr后收取细胞上清，进行透明质酸ELISA试剂盒(R&D，DY3614-05)进行检测。步骤简述如下：
1)ELISA板包被：100μl/孔Capture Reagent室温包被过夜。
2)封闭：拍板除去Capture Reagent。400μl/孔Wash buffer洗板3次拍干。使用100μl/孔Dilute Reagent封闭1h。
3)洗板孵育样品：400μl/孔Wash buffer洗板3次，加100μl/孔标准品与待测血清(轻症和重症新冠病毒感染患者血清100μl用200μl试剂盒中Dilute Reagent稀释成总体积300μl。做3复孔)室温孵育2h。
4)洗板孵育Detect Reagent。400μl/孔Wash buffer洗板3次，加100μl/孔DetectReagent室温孵育2h。
5)洗板孵育HRP。400μl/孔Wash buffer洗板3次，加100μl/孔HRP室温孵育20min。
6)洗板孵育底物。400μl/孔Wash buffer洗板3次，加100μl/孔A、B底物混合液，室温孵育20min。
7)终止显色。加50μl/孔stop solution。15分钟内读取450nm吸光度。
检测结果如表4、表5所示：细胞系293T和MRC5中过表达病毒靶点序列后透明质酸含量均显著上升(表4)。而使用透明质酸抑制剂4-MU可以显著降低由过表达靶点序列产生的透明质酸(表5)。本实施例证明该病毒靶点具有科研研究价值并且4-MU具有成为治疗靶向该改靶点的治疗药物，体现了RNA病毒靶点并发症的治疗价值。
表4-293T和MRC5中过表达病毒靶点细胞透明质酸含量测定
Figure SMS_11
表5-透明质酸抑制剂对过表达病毒靶点透明质酸抑制能力测定
Figure SMS_12
实施例5-血常规指标检测
血常规指标由医院提供，血液中透明质酸使用透明质酸ELISA试剂盒(R&D，DY3614-05)进行检测。其中对比轻症的新冠病毒感染患者，重症的新冠病毒感染患者血清中HA含量显著升高(表6)。另外，淋巴细胞数目重症新冠病毒感染患者显著低于轻症新冠病毒感染患者，提示患者免疫细胞随着病情加重而降低；而D-二聚体是纤维蛋白降解产物，D-二聚体水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进。因此，D-二聚体质量浓度对血栓性疾病具有诊断意义。而重症的新冠病毒感染患者血清中D-二聚体含量显著高于轻症患者，提示患者凝血风险随着新冠病毒感染病情的加重而增加，也提示后续的抗凝治疗存在一定的可行性。
表6-轻重症新冠病毒感染患者血液指标
Figure SMS_13
以上结果为RNA病毒靶点序列造成的血液学指标变化成为临床诊断提供依据，体现了RNA病毒靶点的临床诊断价值。并且该靶标具有成为疫苗的可能。另外，制备疫苗过程中，常见的减毒活疫苗仍存在一定的风险有待进一步的优化，将靶点敲除后将大大降低疫苗的致病风险。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种RNA病毒的靶点序列，其特征在于，所述靶点序列为RNA病毒基因序列中包含20～40个碱基、且与人类基因组序列的相似性不小于95％的核酸序列片段；其中，所述RNA病毒包括寨卡病毒，所述寨卡病毒的靶点序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的一种RNA病毒的靶点序列，其特征在于，所述RNA病毒还包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、埃博拉病毒、艾滋病病毒中的至少一种。
3.一种用于构建RNA病毒的靶点序列的引物组合物，其特征在于，靶点序列SEQ IDNO.1的引物为SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.7；和/或，靶点序列SEQ ID NO.2的引物为SEQ IDNO.8～SEQ ID NO.11；和/或，靶点序列SEQ ID NO.3的引物为SEQ ID NO.12～SEQ IDNO.15。
4.一种与权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料选自下述A)～B)中的一种：
A)与权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列互补配对的DNA和/或RNA分子；
B)含有权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列或A)中所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组载体，其构建步骤包括：1)设计引物，PCR扩增所述RNA病毒的靶点序列；2)将扩增的序列片段和表达载体酶切，连接目的序列片段和表达载体；3)将连接产物转化大肠杆菌，培养；4)鉴定后提取重组质粒并包装。
其中，所述重组载体上有表达寨卡病毒的靶点序列。
6.一种如权利要求1或权利要求2所述的RNA病毒的靶点序列的应用，其特征在于，所述应用选自以下应用中的至少一种：在细胞水平上激活相关基因的应用、在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用、在筛选或制备用于预防或治疗RNA病毒引发的病症的药物中的应用、在制备RNA病毒检测或诊断试剂中的应用、在制备针对RNA病毒的疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为RNA病毒的靶点序列在在细胞水平上激活相关基因的应用时，所述RNA病毒为寨卡病毒，所述相关基因包括片段周围200k以内基因；
其中，SEQ ID NO.1所示的靶点序列片段过表达后CNMD、VPS36、QRFPR、ANXA5、CCNA2、TMEM155、TRPC3、EXOSC9、BBS7、KIAA1109基因被激活；SEQ ID NO.2所示的靶点序列片段过表达后TAC1、OCM2、LMTK2、BR13、BAIAP2L1基因被激活；SEQ ID NO.3所示的靶点序列片段过表达后ADGRL3基因被激活。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为RNA病毒的靶点序列在筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物中的应用时，所述激活靶基因为如权利要求1所述的RNA病毒的靶点序列在细胞水平上激活的相关基因，所述相关基因如权利要求7所述；其中，所述应用为利用所述RNA病毒的靶点序列或其反向互补序列来筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物，所述反向互补序列包括反向互补RNA序列或反向互补DNA序列。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为利用RNA病毒靶点序列的反向互补序列来筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物；或者，利用RNA病毒靶点序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰以及5’端进行两个硫代骨架修饰来筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物；或者，利用RNA病毒靶点序列的反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰以及5’端进行两个硫代骨架修饰来筛选或制备用于抑制激活靶基因表达的药物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述用于抑制激活靶基因表达的药物为病毒靶点抑制剂antagomir，其将所述RNA病毒的靶点序列的反向互补序列的3’端进行胆固醇修饰和四个硫代骨架修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，全链进行甲氧基修饰，得到相对应的病毒靶点抑制剂antagomir。
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