CN116350536A - 一种重组人源化胶原蛋白组合物及其应用 - Google Patents

一种重组人源化胶原蛋白组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白组合物及其应用。该重组人源化胶原蛋白组合物包含重组III型人源化胶原蛋白和维生素B12。本发明提供的重组III型人源化胶原蛋白和维生素B12复配后表现出良好的抗皱、紧致、修护皮肤的功效，相关测试结果甚至优于视黄醇这种公认的有效护肤成分。

Description

一种重组人源化胶原蛋白组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种改善皮肤状态的组合物，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白组合物及其应用。
背景技术
胶原蛋白是真皮层中存在最多的组织，以胶原纤维的形式存在，三根氨基酸链一组，像编麻花辫子一样交织在一起，形成三螺旋结构(图1和2)。然后一根根辫子再聚集成束，结成网络，让皮肤有了弹性和强度。
但是随着衰老，皮肤中的胶原蛋白就会流失，皮肤变得松弛，失去弹性。所以很多抗老的护肤品中都针对胶原蛋白做了文章。其中也有主打添加胶原蛋白的产品。目前的产品中通常添加的是去端肽胶原和重组人源化胶原蛋白。
去端肽胶原是动物来源的胶原蛋白去掉容易引起人体排异和免疫风险的端肽之后，剩余的胶原蛋白部分。去端肽胶原蛋白最大的优势是保留了完整的三螺旋结构，具有良好的胶原强度和活性，但麻烦的是水溶状态下稳定性不好，遇热后就直接变性失活，失去了胶原该有的作用，这就好比鸡蛋受热后再也孵不出小鸡。这也是传统的精华乳液护肤品中的胶原很容易在保存和运输时候受热而失效的原因。
重组人源化胶原蛋白是由DNA技术制备的和人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分序列或功能片段的组合。优势是人体应用更加安全，不会像应用动物胶原一样出现免疫问题。这也是近几年热门的运用生物工程制备原料的技术，在护肤品上已经开始应用。重组人源化胶原蛋白透皮后可以直接补充人体胶原，同时可以刺激成纤维细胞分泌更多的胶原蛋白，降低在受损皮肤修护时的人体自身的胶原消耗。此外，重组人源化胶原在抗炎舒缓方面也有很好的效果，是比较综合的一种护肤品原料。而且从配方应用上看，重组人源化胶原的热稳定性上也比去端肽胶原更好一些，对于产品形式上可以更加多样化。
维生素B12又叫钴胺素，是唯一含金属元素的维生素。维生素B12进入人体以后，以谷胺酰和甲基谷氨两种辅酶的形式，参与体内碳水化合物、蛋白质、脂肪等物质的代谢过程。维生素B12可以促进红细胞的发育和成熟，参与神经递质的合成，维护保持神经髓鞘的代谢与功能。维生素B12还可参与同型半胱氨酸的代谢，降低血液同型半胱氨酸水平。维生素B12是合成核酸必不可少的物质，可直接参与创面皮肤成纤维细胞和角质细胞的RNA合成，促进创面四周皮肤以及创面基底皮肤成纤维细胞的再生和修复。
随着重组技术的发展，重组I型、III型等人源化胶原蛋白慢慢被开发出来。但在皮肤护理角度的相关研究和应用尚未深入，缺乏了解。
尤其是人体含有不同种类的胶原蛋白，主要分布为I型、III型胶原，占据了皮肤中的绝大多数，已经有一些体外和人体数据验证了III型重组人源化胶原蛋白在在紧致抗衰、修护人体皮肤角度的作用机理和实际功效，但目前的研究还比较单一，不够深入。更主要的是，胶原和其他活性物之间是否存在复配协同，是否有相关增效的功能，以及是否能提升单独使用的护肤功效，目前行业还缺乏相应机理和数据。
发明内容
第一方面，为了获得抗皱、紧致和修护功效好的组合物，本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白组合物包含重组III型人源化胶原蛋白和维生素B12。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(8～100000)：1。在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(2000～100000)：1。
进一步地，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(10000～25000)：1。
进一步地，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为20000：1。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(8～2000)：1。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(8～10)：1。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(10～100000)：1。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(10～2000)：1。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白的含量为0.01％～1％(优选为0.01％或0.2％或1％)；所述重组人源化胶原蛋白组合物中的维生素B12的含量为0.000001％～5.0％。优选为0.000005％～0.025％，或0.000005％～0.020％，或0.00001％～0.0001％，或0.000005％～0.0001％；更优选为0.00001％、0.000005％或0.0001％。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白的含量为1％；所述重组人源化胶原蛋白组合物中的维生素B12的含量为0.000001％～5.0％。优选为0.000005％～0.025％，或0.000005％～0.020％，或0.00001％～0.0001％。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白的含量为0.01％；所述重组人源化胶原蛋白组合物中的维生素B12的含量为0.000001％～5.0％。优选为0.000005％～0.025％，或0.000005％～0.020％，或0.000005％～0.0001％。
在一些实施方案中，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的维生素B12来自含1％维生素B12的原料。
第二方面，如上所述的重组人源化胶原蛋白组合物在制备护肤品方面的应用。
第三方面，本发明还公开了一种护肤品，包含如上所述的重组人源化胶原蛋白组合物。
第四方面，本发明还公开了一种作用于皮肤的制剂，包含如上所述的重组人源化胶原蛋白组合物。
进一步地，所述作用于皮肤的制剂是护肤品、药妆品、化妆品、和/或皮肤学临床应用制剂。
进一步地，所述作用于皮肤的制剂按形态分是液体制剂(比如溶液剂、注射剂、洗剂、搽剂等)，固体制剂(比如散剂、丸剂、片剂、膜剂等)，半固体制剂(软膏剂、凝胶剂、栓剂、糊剂等)和/或气体制剂(气雾剂、喷雾剂等)；按分散系统分类可以是溶液型(分子分散)，胶体溶液型(1－100nm细微粒子)，乳剂型(>100nm乳滴)，混悬型(>500nm微粒)，气体分散型，微粒分散型和/或固体分散型。
有益效果：本发明在实验中意外的发现，将重组III型人源化胶原蛋白和微量的维生素B12组合后，可以大幅度提升重组III型人源化胶原蛋白在提升皮肤抗皱、紧致、修护的能力。向重组III型人源化胶原蛋白加入维生素B12，刺激I型胶原蛋白的实验中胜过了公认有效的视黄醇。
重组人源化胶原蛋白非常安全温和有效、但目前成本较高。维生素B12作为常用护肤品原料，价格友好。本发明将重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12组合后使用，可以大幅提升III型胶原蛋白在皮肤抗皱、紧致、修护方面的功效，提供了新型的增效降本的配方方案。
本发明提供的重组III型人源化胶原蛋白和维生素B12复配后的使用效果甚至能达到优于视黄醇这种公认的有效护肤成分，表现出良好的抗皱、紧致、修护皮肤的功效。因此，本发明提供了新型的温和护肤功效解决方案。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是胶原蛋白结构示意图。
图2是I型胶原蛋白三螺旋结构示意图。
图3是MTT法测得的样品Retinol GS 50(视黄醇)作用下细胞活力曲线图。
图4是MTT法测得的样品Retinol GS 50(视黄醇)作用下细胞形态学图。其中的Solvent Control(溶剂对照)是指不含样品Retinol GS 50(视黄醇)的溶剂对照。
图5是MTT法测得的表3中的各样品作用下细胞形态学图。其中的Solvent Control(溶剂对照)是指不含表3中的各样品的溶剂对照。
图6是MTT法测得的样品维生素B12(1％)作用下细胞活力曲线图。
图7是MTT法测得的样品维生素B12(1％)作用下细胞形态学图。其中的SolventControl(溶剂对照)是指不含样品维生素B12(1％)的溶剂对照。
图8是实施例2-1中I型胶原蛋白免疫荧光图片汇总。
图9是实施例2-1中I型胶原蛋白相对积分光密度(IOD)/细胞数值柱状图。
图10是组织形态检测结果汇总。
图11是实施例3中Collagen I免疫组化结果部分汇总。
图12是实施例3中Collagen I相对积分光密度(IOD)值柱状图。
图13是实施例3中Collagen III免疫组化结果汇总。
图14是实施例3中Collagen III相对积分光密度(IOD)值柱状图。
图15是细胞增殖柱状图之一。
图16是细胞增殖柱状图之二。
图17是实施例2-2中I型胶原蛋白免疫荧光图片汇总。
图18是实施例2-2中I型胶原蛋白相对积分光密度(IOD)/细胞数值柱状图。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
材料和试剂
成纤维细胞，批号：Fb19052002，由广东博溪生物科技有限公司提供；离体皮肤组织，由广东博溪生物科技有限公司获得。样品信息见表1。
DMEM培养液(Gibco)、PBS(索莱宝)、TGF-β1(Peprotech)、Collagen I抗体(Proteintech)、多聚甲醛(Biosharp)、离体皮肤组织培养液(广东博溪生物)、维生素C(VC，Sigma)、维生素E(VE，Sigma)、Collagen III抗体(Abcam)、无水乙醇(国药)、二甲苯(国药)、苏木精(碧云天)、伊红(碧云天)、胎牛血清(FBS，兰州荣晔)、EGF(Gibco)。
表1、样品信息
Figure BDA0004196540010000051
主要设备
CO2培养箱(Thermo，150I)、超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1F)、倒置显微镜(Olympus，CKX41)、UVA辐照仪(飞利浦)、UVB辐照仪(飞利浦)、荧光显微镜(Leica，DM2500)、正置显微镜(Olympus，BX53)。
实施例1、细胞毒性检测——噻唑蓝比色法(MTT法)
1检测方法
1)细胞接种：成纤维细胞按8×103个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2)试验分组：试验设置调零组、溶剂对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。
3)配液：按检测浓度设定表(表2、表3)配制不同浓度的样品工作液。
表2、检测浓度设定表-1
Figure BDA0004196540010000052
表3、检测浓度设定表-2
Figure BDA0004196540010000061
表4、检测浓度设定表-3
Figure BDA0004196540010000062
4)给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL培养液；阳性对照组每孔加入200μL含10％二甲基亚砜(DMSO)的培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品的培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
5)检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。
6)细胞相对活力计算式：
Figure BDA0004196540010000063
2、检测结果
根据MTT(表5和图3)和形态学(图4)结果，认为样品Retinol GS 50(视黄醇)基于成纤维细胞，在0.002％(v/v)的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
表5、样品Retinol GS 50(视黄醇)MTT检测结果
Figure BDA0004196540010000064
根据MTT(表6)和形态学(图5)结果，认为基于成纤维细胞，表3中的各样品的浓度均在安全浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
表6、表3中不同样品MTT检测结果
Figure BDA0004196540010000071
根据MTT(表7和图6)和形态学(图7)结果，认为基于成纤维细胞，表4中的样品(含1％维生素B12的原料)浓度在25mg/mL(即维生素B12的含量在0.025％)以内均在安全浓度范围内未表现出明显的细胞毒性。
表7、样品维生素B12(1％)MTT检测结果
Figure BDA0004196540010000072
实施例2、基于成纤维细胞的检测
实施例2-1
1、检测方法
1)接种：按4×104个/孔的接种密度接种成纤维细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2)配液：按照检测分组(表8)配置受试物工作液。
表8、检测分组
Figure BDA0004196540010000081
3)给药：根据检测分组，待24孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药(直接细胞给药)，每组设3个复孔。给药完成后将24孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
4)UVA辐照：根据检测分组，对需要辐照的组别进行UVA辐照，辐照剂量为30J/cm2。辐照结束后，置于培养箱(37℃、5％CO2)中继续培养24h。
5)免疫荧光检测：用4％的多聚甲醛对细胞进行固定，固定24h后，进行I型胶原蛋白(CollagenⅠ)免疫荧光检测，荧光显微镜拍照并使用
Figure BDA0004196540010000082
Plus图像处理软件进行分析。通过检测I型胶原蛋白含量的变化情况(数值越高，I型胶原蛋白含量越多)，评价待测样品的抗皱功效。
6)结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
2、检测结果
检测结果如图8和图9，以及表9所示。与BC组相比，NC组的CollagenⅠ含量显著下降，说明本次检测刺激条件有效。与NC组相比，PC组的CollagenⅠ含量显著上升，说明本次检测阳性对照有效。与NC组相比，样品重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.2％(m/v)浓度下、维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.001％(m/v)+0.2％(m/v)、0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下的CollagenⅠ含量均显著上升，提升率分别为50.00％、290.48％、178.57％。
从图9可知，将维生素B12复配到重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02，获得了很好的表现(CollagenⅠ含量较NC显著升高)，同时也意外发现维生素B12(1％)的量为0.001％时，效果比0.01％更好。
表9、I型胶原蛋白免疫荧光分析结果汇总表
组别(样品序号) 相对IOD/细胞数平均值 SD P-value 提升率
BC 1.00 0.18 / /
NC 0.42 0.08 0.007## /
PC 1.59 0.21 0.001** /
1 0.64 0.10 0.040* 52.38％
2 0.63 0.03 0.013* 50.00％
9 1.64 0.10 0.000** 290.48％
10 1.17 0.13 0.001** 178.57％
备注：积分光密度(IOD)，其数值反映Collagen I的含量。用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P＜0.05表示为#，P＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P＜0.05表示为*，P＜0.01表示为**。备注：细胞形态显示，Retinol GS 50(视黄醇)有光毒，结果仅供参考。
实施例2-2
1、检测方法
除检测分组如表17所示外，其他试剂、操作等检测方法同实施例2-1。
表17、检测分组
Figure BDA0004196540010000091
Figure BDA0004196540010000101
2、检测结果
检测结果如图17、图18以及表18所示。与BC组相比，NC组的CollagenⅠ含量显著下降，说明本次检测刺激条件有效。与NC组相比，PC组的CollagenⅠ含量显著上升，说明本次检测阳性对照有效。与NC组相比，维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.0005％(m/v)+0.01％(m/v)、0.0010％(m/v)+1％(m/v)、2.0000％(m/v)+0.20％(m/v)、2.5000％(m/v)+0.20％(m/v)复配浓度下的CollagenⅠ含量均显著上升，提升率分别为46.58％、21.92％、17.81％、34.25％。
表18、I型胶原蛋白免疫荧光分析结果汇总表
组别(样品序号) 相对IOD/细胞数平均值 SD P-value 提升率
BC 1.00 0.02 / /
NC 0.73 0.07 0.003## /
PC 1.11 0.06 0.002** /
G4 1.07 0.03 0.001** 46.58％
G5 0.89 0.03 0.020* 21.92％
G6 0.86 0.04 0.044* 17.81％
G7 0.98 0.07 0.012* 34.25％
备注：积分光密度(IOD)，其数值反映Collagen I的含量。用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P＜0.05表示为#，P＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P＜0.05表示为*，P＜0.01表示为**。
实施例3、基于离体皮肤组织的检测
1、检测方法
1)检测分组(见表10)：
表10、检测分组
Figure BDA0004196540010000102
Figure BDA0004196540010000111
2)组织处理：将新鲜获得的皮肤组织浸入75％酒精中，清洗30s，再使用无菌的PBS缓冲液清洗三次；结束后，将皮肤切成24±2mm2的组织块，表皮面向上，真皮面向下，放入培养模具中，然后将培养模具转入6孔板中，每孔加入3.7mL培养液，在37℃，5％ CO2孵箱中培养，每天换液。
3)给药：离体皮肤组织培养2天后，参照表10中的检测分组及相应处理条件，开始进行辐照和给药；照射剂量为UVA(30J/cm2)和UVB(50mJ/cm2)，连续辐照4天，每次辐照完后更换新鲜培养液，并进行给药处理，阳性对照(VC+VE)采用液下给药的方式进行，待测样品采用表面给药的方式进行。连续辐照4天后，将离体皮肤组织继续培养3天，在此期间不进行辐照，只进行样品给药。
4)组织形态和弹性纤维检测：给药结束后的皮肤组织采用4％多聚甲醛固定模型，组织包埋，切片后分别进行H&E染色和维多利亚蓝染色，回收切片结果，使用显微镜拍照，使用
Figure BDA0004196540010000112
图像处理软件进行分析。
5)免疫组化检测：根据免疫组化具体操作步骤进行检测。
6)结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
2、检测结果
1)组织形态检测结果，见图10。
与BC组相比，NC组表皮活细胞层明显变薄，说明本次检测刺激条件有效。
与NC组相比，PC组表皮活细胞层明显增厚，说明本次检测阳性对照有效。
与NC组相比，样品Retinol GS 50(视黄醇)在0.05％(v/v)浓度下、重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.2％(m/v)浓度下、维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.001％(m/v)+0.2％(m/v)、0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下的表皮活细胞层均明显增厚。
2)CollagenΙ检测结果，见图11、图12和表11。
表11、CollagenΙ免疫组化分析结果汇总表
Figure BDA0004196540010000121
备注：积分光密度(IOD)，其数值反映CollagenΙ的相对含量。用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组的CollagenΙ含量显著下降，说明本次检测刺激条件有效。
与NC组相比，PC组的CollagenΙ含量显著上升，说明本次检测阳性对照有效。
与NC组相比，样品Retinol GS 50(视黄醇)在0.05％(v/v)浓度下、重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.2％(m/v)浓度下、维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.001％(m/v)+0.2％(m/v)、0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下的CollagenΙ含量均显著上升，提升率分别为55.56％、72.22％、122.22％、111.11％。
3)Collagen III检测结果，见图13、图14和表12。
表12、Collagen IIⅠ免疫组化分析结果汇总表
Figure BDA0004196540010000131
备注：积分光密度(IOD)，其数值反映Collagen IIⅠ的相对含量。用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以#表示，P-value＜0.05表示为#，P-value＜0.01表示为##；与NC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
与BC组相比，NC组的Collagen IIⅠ含量显著下降，说明本次检测刺激条件有效。
与NC组相比，PC组的Collagen IIⅠ含量显著上升，说明本次检测阳性对照有效。
与NC组相比，样品Retinol GS 50(视黄醇)在0.05％(v/v)浓度下、重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.2％(m/v)浓度下、维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.001％(m/v)+0.2％(m/v)、0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下的Collagen IIⅠ含量均显著上升，提升率分别为102.94％、91.18％、155.88％、108.82％。
通过实施例1-3得出的结论是：
一、基于成纤维细胞，与对照组相比
样品重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.2％(m/v)浓度下、维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.001％(m/v)+0.2％(m/v)、0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下的I型胶原(Collagen I)含量均显著上升，提升率分别为50.00％、290.48％、178.57％。
二、基于离体皮肤组织，与对照组相比
样品Retinol GS 50(视黄醇)在0.05％(v/v)浓度下、重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.2％(m/v)浓度下、维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.001％(m/v)+0.2％(m/v)、0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下的组织形态明显改善；弹性纤维含量均显著上升，提升率分别为38.33％、45.00％、18.33％；I型胶原(Collagen I)含量均显著上升，提升率分别为55.56％、72.22％、122.22％、111.11％；III型胶原(Collagen III)含量均显著上升，提升率分别为102.94％、91.18％、155.88％、108.82％。
综合以上，说明样品在相应浓度下，通过提升弹性纤维含量，达到紧致功效；通过改善组织形态，提升I型胶原(Collagen I)和III型胶原(Collagen III)含量，达到抗皱功效。
实施例4、细胞增殖检测
1、检测方法
1)细胞接种：成纤维细胞以4×103个/孔的细胞接种量接种至96孔板中，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2)配液：按照检测分组(表13)配置样品工作液。
表13、检测分组
Figure BDA0004196540010000141
Figure BDA0004196540010000151
3)给药：根据表14测试分组，待96孔板中细胞的铺板率达到30％～40％时，进行分组给药，每孔给药量为200μL，每组设3个复孔。培养箱(37℃、5％CO2)中分别培养24h、48h、72h。对需要孵育培养48h和72h的组别每天进行半换液处理。
4)检测：待细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。同时，48h和72h后，进行上述MTT检测操作。
5)细胞相对活力计算：
根据公式计算，
Figure BDA0004196540010000152
6)结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
2、检测结果，见表14-16、图15和16。
表14、细胞增殖检测结果汇总表之一
Figure BDA0004196540010000153
备注：用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。
表15、细胞增殖检测结果汇总表之二
Figure BDA0004196540010000161
备注：用t-test方法进行统计分析时，与BC组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**。由于表17是与样本平行做的BC、PC；而表18是与另一批样本平行做的BC、PC，故两表格中的BC、PC数值上存在些许出入。
表16、细胞增殖检测结果汇总表之三
Figure BDA0004196540010000162
Figure BDA0004196540010000171
与BC组相比，PC组给药24h、48h、72h后，细胞活力显著升高，说明本次测试阳性对照有效。
与BC组相比，样品维生素B12(1％)+重组III型胶原蛋白海绵TTA1-02在0.01％(m/v)+0.2％(m/v)复配浓度下，给药24h后，细胞活力显著升高，提升率为6.18％。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种重组人源化胶原蛋白组合物，其特征在于，包含重组III型人源化胶原蛋白和维生素B12。
2.如权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白组合物，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为(2000～100000)：1。
3.如权利要求2所述的重组人源化胶原蛋白组合物，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白与维生素B12的质量比为20000：1。
4.如权利要求2所述的重组人源化胶原蛋白组合物，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的重组III型人源化胶原蛋白的含量为0.01％～1％；所述重组人源化胶原蛋白组合物中的维生素B12的含量为0.000001％～5.0％。
5.如权利要求2所述的重组人源化胶原蛋白组合物，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白组合物中的维生素B12来自含1％维生素B12的原料。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组人源化胶原蛋白组合物在制备护肤品方面的应用。
7.一种护肤品，其特征在于，包含如权利要求1-5任一项所述的重组人源化胶原蛋白组合物。
8.一种作用于皮肤的制剂，其特征在于，包含如权利要求1-5任一项所述的重组人源化胶原蛋白组合物。
9.如权利要求8所述的作用于皮肤的制剂，其特征在于，所述作用于皮肤的制剂为护肤品、药妆品、化妆品、和/或皮肤学临床应用制剂。
10.如权利要求8所述的作用于皮肤的制剂，其特征在于，所述作用于皮肤的制剂按形态分是液体制剂，固体制剂，半固体制剂和/或气体制剂；按分散系统分类是溶液型，胶体溶液型，乳剂型，混悬型，气体分散型，微粒分散型和/或固体分散型。
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