CN116297996B - 一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的uplc-ms/ms方法 - Google Patents
一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的uplc-ms/ms方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的UPLC‑MS/MS方法。该方法通过检测一系列壳聚糖特征离子对的响应强度，以壳聚糖样品浓度为横坐标，以壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流响应的峰面积为纵坐标，对两者建立线性关系拟合，构建测定壳聚糖样品的标准曲线，用于125~4000 ng/mL壳聚糖的定量分析。在给定检测条件下，方法的专属性、线性关系、精密度、准确度、稳定性良好。溶液中存在不与壳聚糖相互作用的一系列共溶质时测量不受干扰。验证了该方法在测定壳聚糖复合材料中壳聚糖含量的适用性，适宜用于分析多种复合材料。该方法为壳聚糖含量测定提供了一种思路和方法。具有较高的实用价值和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于多糖类高分子材料分析技术领域，具体涉及一种准确测定水溶液中壳聚糖含量的UPLC-MS/MS方法。
背景技术
壳聚糖（chitosan，CS）由甲壳素去N-乙酰化而成，由脱乙酰化单体（N-glucosamine, GlcN，D）和乙酰化单体（N-acetyl-glucosamine，GlcNAc，A）通过β-（1-4）糖苷键随机排列组合形成的线性高分子聚合物，脱乙酰化单体、乙酰化单体及壳聚糖的结构式如下所示：
壳聚糖是一种可生物降解的、具有良好生物相容性的高分子碱性多糖，能够溶解于1%乙酸或1%盐酸中，在生物医学领域有广泛的应用。壳聚糖的理化和生物学性质受其摩尔质量和脱乙酰度的影响。
壳聚糖的定量分析方法研究现状：
准确测定壳聚糖含量对保证壳聚糖产品质量的稳定性和可控性具有很强的现实意义。目前，有多种分析方法用于壳聚糖的定量和表征，包括直接分析方法和间接分析方法，各有优势和不足。直接测定壳聚糖含量的分析方法有：分光光度法、毛细管区带电泳、比色检测和尺寸排阻色谱等，但这些方法操作繁琐、不稳定、耗时长，且特异性不强，不适合复杂基质中壳聚糖的常规分析。分光光度法测定壳聚糖含量具有经济、快捷的优点，但通常涉及氨基的反应性，高度依赖于脱乙酰度。比色检测可用的显色剂包括：Cibacron 艳红3B-A、刚果红、邻苯二甲醛及N-乙酰基-L-半胱氨酸和Lugol溶液等，依赖与氨基的静电相互作用，且缺乏特异性，样品处理过程涉及衍生化反应，部分比色检测法检测在基质溶液中的壳聚糖时，会出现蛋白质竞争性参与衍生化反应。
间接测定壳聚糖含量的分析方法有：离子交换法、分光光度法、比色法和HPLC法等。间接壳聚糖测定技术需要在衍生化和检测之前将多糖降解为其单体。可使用酸水解、脱氨基水解或两者的组合的方式降解壳聚糖。酸水解通常包括苛刻的反应条件，以确保完全脱乙酰和解聚，产生水解产物GlcN。中和后再对GlcN衍生化，例如，用邻苯二甲醛进行荧光检测、用乙酸酐进行比色检测或用9-芴基甲氧基碳酰氯（FMOC-Cl）进行UV-vis检测。HPLC具有准确度好、检出限低、分离效果明显、特异性和灵敏度高等优点，它是分析实践中广泛使用的定量检测方法。通常，使用HPLC对壳聚糖进行间接定量分析时，壳聚糖在强酸中先用酸性水解法或脱氨基水解法主要水解成氨基葡萄糖盐，其浓度可通过HPLC测定。但是由于氨基的广泛存在，很难在直接条件下彻底水解壳聚糖，需要先对C-2 氨基进行修饰使壳聚糖能更有效的水解，然后再定量壳聚糖含量。这些测定法的主要缺点是在不适当的水解条件下可能通过各种副反应降解GlcN，需要复杂的反应参数优化。对于壳聚糖质量浓度的测定，所有这些方法都需要事先测定脱乙酰度，考虑两种单体GlcN和GlcNAc的不同摩尔质量。
平均脱乙酰度（DD）对壳聚糖的粘度、成膜性、离子交换容量、溶解性、抗菌降脂作用等性质和功能有着至关重要的影响。查阅文献，发现目前尚无采用UPLC-MS/MS法检测壳聚糖含量的报道，我国药典中目前仍缺乏检测壳聚糖含量的方法。而壳聚糖的定量在壳聚糖纯度检测或含壳聚糖产品的组成分析中特别重要。因此，有必要研究一种准确的壳聚糖定量分析方法，以保证壳聚糖产品的稳定性和可控性，推动壳聚糖在医药、工业、农业等诸多领域的应用和发展，具有重要的现实意义和经济效益。
发明内容
目前壳聚糖的含量测定的方法主要是称量法，中国药典仍未收录任何检测含量的方法，文献报道的壳聚糖的间接含量测定的方法中，方法的准确性、使用场景受到限制，存在的干扰因素颇多，因而需要不断开发准确、简便的方法用于壳聚糖的含量测定。本发明的发明人在研究中发现壳聚糖在特定质谱条件下的稳定断裂，这为利用质谱方法对壳聚糖进行定量分析提供了极大地可能。本发明基于液质联用技术，探索直接测定水溶液中壳聚糖含量的UPLC-MS/MS方法，可用于分析产品中壳聚糖成分的含量。
本发明的目的是提供一种准确测定壳聚糖含量的UPLC-MS/MS方法。
本发明所提供的准确测定壳聚糖含量的UPLC-MS/MS方法，包括下述步骤：
1）称取壳聚糖样品适量用1%乙酸-水溶液（v/v）溶解，得到待测壳聚糖样品溶液；
2）对得到的待测壳聚糖溶液采用UPLC-MS/MS法进行检测。
上述方法步骤1）中，所述待测壳聚糖样品溶液需在 25℃条件下用恒温振荡器200 rpm/min 振荡 2 h，使样品充分溶解。
上述方法步骤2）中，所述采用UPLC-MS/MS法进行检测包括下述步骤：利用超高效液相色谱对待测壳聚糖溶液进行液相洗脱，随后用质谱检测得到物质峰并进行定性定量分析。
进一步的，所述液相洗脱的条件为：壳聚糖的分离、检测在下述任意所述的色谱柱上进行：ACQUITY UPLC peptide BEH300 C18 色谱柱（1.7 μm, 300 Å, 2.1 mm×100 mm,Waters, Milford, MA,美国），或BEH Shield RP18色谱柱（1.7 μm, 130 Å, 2.1 mm×100mm, Waters, Milford, MA,美国）, 或BEH C8 色谱柱（1.7 μm, 130 Å, 2.1 mm×100 mm,Waters, Milford, MA,美国）, 或BEH C18色谱柱（1.7 μm, 130 Å, 2.1 mm×100 mm,Waters, Milford, MA,美国），或ACQUITY UPLC BEH450 SEC 色谱柱（2.5 μm, 450 Å, 2.1mm×150 mm, Waters, Milford, MA,美国）。
优选的，所述色谱柱为ACQUITY UPLC peptide BEH300 C18 色谱柱（1.7 μm, 300Å, 2.1 mm × 100 mm, Waters, Milford, MA,美国）
色谱柱温度设置为30~60 ℃，进样体积为 0.5~2.5 μL，流动相流速为 0.2~0.4mL/min；
流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行等度洗脱；流动相 A：甲酸浓度为 0.1%（v/v）的水溶液，流动相 B：甲酸浓度为 0.1%（v/v）的乙腈溶液；
所述等度洗脱的流程如下：
0~2 min，体积分数60~95% 流动相A（0.1% FA-水）-体积分数40~5%流动相B（0.1%FA-乙腈）；所述流动相A在60~95%之间均可，相应的流动相B比例为（100%-流动相A的体积分数）；
优选的，0~2 min，体积分数80% 流动相A（0.1% FA-水） - 20% 流动相B（0.1%FA-乙腈），洗脱时间为 2 min。
洗针液为0.1%甲酸-25%甲醇-25%异丙醇-49.9%水溶液（v/v/v/v）；密封件冲洗液为10%乙腈-90%水溶液（v/v）。
更进一步的，超高效液相色谱为Acquity I-class 超高效液相色谱。
进一步的，所述质谱检测的条件如下：
所述质谱仪为Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪（配有 ESI 源），样品的测定在正离子模式下进行，ESI 源参数设置如下：毛细管电压：1800~3600 kV；锥孔电压：50~78 V；偏转电压：50~60 V；脱溶剂温度：300~400 ℃；ESI源温度：100~150 ℃；锥孔气流速：150~250 L/h；脱溶剂气流速：600~700 L/h；雾化气压：5.5~6.5 bar。碰撞气为氩气；检测模式为 MRM。
将壳聚糖在ESI 源中产生的碎片离子按照其由不同数量的脱乙酰化单体（D）和乙酰化单体（A）组合的形式命名，壳聚糖在MRM模式下检测的离子对及锥孔电压和碰撞能量见表1。
具体的，所述待测壳聚糖样品溶液通过 Acquity I-class 超高效液相色谱串联Xevo TQ-S 质谱（配有 ESI 源）系统洗脱和检测，仪器系统通过 Masslynx 4.2软件控制。
上述方法步骤(2)还包括建立壳聚糖标准曲线的步骤，具体方法如下：
a1)标准溶液配制
用壳聚糖标准品配制成一系列浓度的标准溶液，选用的壳聚糖标准品应与待测壳聚糖样本的脱乙酰度一致；
b1)采用上述步骤2）中的方法对所述系列浓度的标准溶液进行检测，同时记录峰面积；以壳聚糖标准品溶液质量浓度为横坐标（X），以壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流（TIC）响应的峰面积为纵坐标（Y）进行线性拟合，用加权最小二乘法 （W=1/X2） 进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线。
上述步骤a1)更具体的配制方法为：
精密称取壳聚糖标准品适量，用1%乙酸-水溶液（v/v）溶解至浓度为 0.2 mg/mL，得到壳聚糖储备液；以所述流动相A为溶剂，取壳聚糖储备液用于配制标准曲线样品；用流动相A逐级稀释到最终浓度125，250，500，1000，2000，4000 ng/mL，配制成标准曲线样品工作溶液。
所述方法还进一步包括：将上述方法步骤(2)中对待测壳聚糖溶液采用UPLC-MS/MS法进行检测所得的壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流（TIC）响应的峰面积代入上述标准曲线，得到所述待测样本中壳聚糖的浓度。
本发明所述壳聚糖可以由单纯的壳聚糖提供，也可以由壳聚糖复合物中的壳聚糖提供。
所述壳聚糖复合物包括壳聚糖-海藻酸钠复合海绵、壳聚糖-透明质酸复合海绵、壳聚糖-泊洛沙姆复合海绵等。
当壳聚糖样品为壳聚糖复合物时，首先需要将壳聚糖复合物中的壳聚糖分离，然后在采用上述方法进行测定。
本发明开发了一种新型的直接测定水溶液中壳聚糖含量的UPLC-MS/MS检测方法，通过检测一系列壳聚糖的特征离子对的响应强度，以壳聚糖样品浓度为横坐标，以壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流（TIC）响应的峰面积为纵坐标，对两者建立线性关系拟合，构建可靠的定量壳聚糖样品的标准曲线，测定范围为125~4000 ng/mL，在给定的检测条件下，方法的专属性、线性关系、精密度、准确度、稳定性良好，溶液中存在不与壳聚糖相互作用的一系列基质时测量不受干扰。该方法为壳聚糖含量的测定提供了一种思路和方法。具有较高的实用价值和经济效益。
样品制备过程中不需要进行过多的样品处理，无需长时间水解、荧光标记、同位素标记、染色等操作，没有其他复杂的反应条件，检测的时间大大缩短，提高了便捷性，以及可适用的色谱设备和液相性能相关参数调整空间较大，并且质谱的灵敏度较高可以检测低至ng/mL级别的水溶液样品，这些可以被认为是该方法相对于现有的壳聚糖定量方法的关键优势。
进一步，可以对不同脱乙酰度的壳聚糖开发UPLC-MS/MS检测方法，用不同脱乙酰度的壳聚糖标准品建立可用于含量测定的标准曲线，即可实现对相应脱乙酰度的壳聚糖样品的定量分析。因此，用于壳聚糖测定的UPLC-MS/MS方法有很高的潜力作为工业部门中质量控制的工具，这些都将为壳聚糖产品质量的稳定性和可控性提供简单、快捷、有效的检测手段，为科研人员特别是企业技术人员提供方便。再进一步，该研究思路和方法的开发可能为生物样品中的壳聚糖的定量分析方法的建立奠定基础，并有希望成为壳聚糖体内药代动力学的研究工具，对壳聚糖类材料和医疗器械的开发有重要的现实意义。
附图说明
图1为空白溶液、125 ng/mL CS200-87溶液和1000 ng/mL CS200-87溶液样品的MRM总离子流及6个特征离子对的色谱图；
图2为空白溶液、125 ng/mL CS200-87溶液和1000 ng/mL CS200-87溶液样品的7个特征离子对的色谱图；
图3为UPLC-MS/MS分析方法测定CS200-87一个分析批的标准曲线；
图4为UPLC-MS/MS分析方法测定CS200-87一个分析批标准曲线的准确度和偏差；
图5为在基质溶液中壳聚糖检测浓度与无基质的壳聚糖溶液浓度的偏差（n=3）；
图6为用于测定壳聚糖-海藻酸钠复合材料中壳聚糖成分含量的随行标准曲线；
图7为用于测定壳聚糖-透明质酸复合材料中壳聚糖成分含量的随行标准曲线；
图8为用于测定壳聚糖-泊洛沙姆复合材料中壳聚糖成分含量的随行标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、准确测定水溶液中壳聚糖含量的UPLC-MS/MS方法
1. 实验材料
1.1 仪器
Acquity I-class 超高效液相色谱串联 Xevo TQ-S 质谱（配有 ESI 源）系统，仪器系统通过 Masslynx 4.2 软件控制，Waters公司（Milford, MA, 美国）生产。
电子天平，型号：ME-235S，生产厂家：Sartorius公司（德国）。
纯水仪，型号：Milli-Q Advantage A10（>18 MΩ∙cm，3 ppb），生产厂家：Aillipore公司（Darmstadt, 德国）。
高速低温离心机，型号：3-18K，生产厂家：Sigma公司（美国）。
涡旋混合器，型号：MX-S，生产厂家：赛洛捷克公司（美国）生产。
恒温振荡器，型号：TCYQ，生产厂家：太仓市试验设备厂（中国）。
pH计，型号：PB-10，生产厂家：Sartorius 公司（德国）。
冷冻干燥机，型号：LGJ-10D，生产厂家：北京四环科学仪器厂有限公司（中国）。
数控超声波清洗仪，型号：KQ5200DE，生产厂家：昆山市超声仪器有限公司（中国）。
医用冷藏冰箱，型号：HYC-391，生产厂家：青岛海尔特种电器有限公司（中国）。
1.2 试剂
壳聚糖 （CS200-87），DD 80%~95%，50~800 mPa·s，货号：69047438-500 g，批号：20210226，国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）生产，壳聚糖以“CS分子量-脱乙酰度”命名。经尺寸排阻色谱法-18角度静态光散射仪-示差检测器（SEC-MALLS-dRI）检测壳聚糖样品重均分子量（Mw）为183.11 kDa，数均分子量（Mn）为141.88 kDa，多分散度（Mw/Mn）为1.29，均方根旋转半径（Rg,z）为41.63 nm；经核磁共振氢谱法（1H NMR）检测壳聚糖样品脱乙酰度为86.76%。
乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）和异丙醇（色谱纯），购自Fisher Scientific 公司（Waltham, MA, 美国）。
甲酸（色谱级，≥98%），甲酸铵（质谱级，≥99%），购自阿拉丁公司（上海，中国）。
乙酸（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。
氨基葡萄糖 （≥99%）和乙酰氨基葡萄糖（≥99%） ，购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。
壳二糖（chitobiose, COS 2，≥98%），壳三糖（chitotriose, COS 3，≥98%），壳四糖（chitotetraose, COS 4，≥98%），壳五糖（chitopentaose, COS 5，≥97%），壳六糖（chitohexaose, COS 6，≥96%）和壳七糖（chitoheptaose, COS 7，≥95%），购自博智汇力生物科技有限公司（青岛，山东，中国）。
右旋葡聚糖（Mw 270kDa，来自肠系膜明串珠菌），购自阿拉丁公司（上海，中国）。
葡萄糖（分析纯）和蔗糖（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。
8种糖代谢产物：柠檬酸（99%）、琥珀酸（99%）、延胡索酸（99%）、乳酸（99%）、丙酮酸（99%）、苹果酸（99%）、果糖（99%）、α-酮戊二酸（99%）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。
牛血清白蛋白（BSA，98%冻干粉，Mw ~68 kDa），购自索莱宝公司（北京，中国）。
L-甲硫氨酸（≥99.0%），L-半胱氨酸（≥99.0%），L-精氨酸（≥99.0%），购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。
氢氧化钠（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。
海藻酸钠（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）。
泊洛沙姆188（Cat#S7070，溶解性：100mg/mL水中），购自索莱宝公司（北京，中国）。
透明质酸（H909938，分子量：800~1500 kDa），购自麦克林公司（上海，中国）。
2. 实验方法
2.1 溶液的配制
2.1.1 流动相的配制
流动相 A：甲酸浓度为 0.1%（v/v）的水溶液，
流动相 B：甲酸浓度为 0.1%（v/v）的乙腈溶液。
2.1.2 壳聚糖储备液的配制
精密称取壳聚糖（CS200-87）标准品适量，用1%乙酸-水溶液（v/v）溶解至浓度为0.2 mg/mL，壳聚糖溶液需在 25℃条件下用恒温振荡器 200 rpm/min 振荡 2 h，使样品充分溶解。储备液现用现配。
2.1.3 壳聚糖标准曲线及质控样品的配制
以流动相A为溶剂，取壳聚糖储备液用于配制标准曲线样品。用流动相A逐级稀释到最终浓度125，250，500，1000，2000，4000 ng/mL，配制成标准曲线样品工作溶液。
另取储备液用于配制质量控制（QC）样品，用流动相A稀释到最终浓度3000 ng/mL作为质控样品工作液，平行配制6份。
工作溶液5000 rpm/min 离心 10 min 后，取上清液 200 μL 置于 2 mL 进样瓶中待测。以上储备液、工作溶液均于4℃储存。
2.2 检测方法
2.2.1 液相方法
液相洗脱条件：壳聚糖的分离、检测在 ACQUITY UPLC peptide BEH300 C18 色谱柱（1.7 μm, 300 Å, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA,美国）上进行。
色谱柱温度设置为40 ℃，进样体积为 2 μL，流动相流速为 0.3 mL/min。流动相洗脱：恒定比例的 80% 流动相A（0.1% FA-水） - 20% 流动相B（0.1%FA-乙腈），洗脱时间为2 min。洗针液为0.1%甲酸-25%甲醇-25%异丙醇-49.9%水溶液（v/v/v/v）；密封件冲洗液为10%乙腈-90%水溶液（v/v）。
2.2.2 质谱方法
壳聚糖样品通过 Acquity I-class 超高效液相色谱串联 Xevo TQ-S 质谱（配有ESI 源）系统洗脱和检测，仪器系统通过 Masslynx 4.2软件控制。
壳聚糖用 ACQUITY UPLC peptide BEH300 C18 色谱柱（1.7 μm, 300 Å, 2.1 mm× 100 mm, Waters, Milford, MA,美国）进行洗脱。样品的测定在正离子模式下进行，ESI源参数设置如下：毛细管电压：2000 kV；锥孔电压：60 V；偏转电压：50 V；脱溶剂温度：350℃；ESI源温度：150 ℃；锥孔气流速：150 L/h；脱溶剂气流速：650 L/h；雾化气压：6.0 bar。碰撞气为氩气；检测模式为 MRM。将壳聚糖在ESI 源中产生的碎片离子按照其由不同数量的脱乙酰化单体（D）和乙酰化单体（A）组合的形式命名，壳聚糖在MRM模式下检测的离子对及锥孔电压和碰撞能量见表1。
2.3 分析方法的确证
2.3.1 方法的专属性
按照2.2节中的UPLC-MS/MS方法采集并分析空白样品（0.1% 甲酸-水溶液（v/v），即流动相A）和定量下限（LLOQ）浓度125 ng/mL 壳聚糖溶液样品，分别平行配置6份，对比色谱图，考察方法的专属性。如果存在任何干扰，则该干扰的允许响应值应小于相应LLOQ响应值的10%。
2.3.2 线性和范围
用6个不同浓度梯度的标准曲线溶液，分别为125，250，500，1000，2000，4000 ng/mL，按照2.2节中的检测方法进样测定。以壳聚糖标准品溶液质量浓度为横坐标（X），以壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流（TIC）响应的峰面积为纵坐标（Y）进行线性拟合，用加权最小二乘法 （W=1/X2） 进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线，确定斜率和截距。通过相关系数（r2）值评估校准曲线的线性。最低定量限（LLOQ）为标准曲线的最低浓度点125 ng/mL，检测范围为125~4000 ng/mL。
2.3.3 重复性考察
按“2.1.3 质控样品配制”项下方法配制3000 ng/mL的质控样品工作液，按照检测方法连续进样6次，测定壳聚糖CS200-87的13个特征离子对和TIC的峰面积，计算峰面积的RSD值，RSD均应小于3%。
2.3.4 准确度和精密度及定量下限考察
按“2.1.3 质控样品配制”项下方法配制3000 ng/mL的质控样品工作液，质控样品进行6样本分析，随行标准曲线，连续测定三个不同的分析批，至少两天完成，根据当日工作标准曲线计算QC样品的测得浓度，以配制浓度为理论值，采用统计学单因素方差分析法计算分析方法批内和批间的精密度RSD（QC样品测定值的相对标准偏差）和准确度RE（QC样品测定均值对理论值的相对偏差）。
日间和日内准确度用相对偏差（RE）表示，所有QC样品的相对偏差均应在±5%范围内。日内精密度表示为相对标准偏差（RSDr(%)），QC的RSDr均应小于3%。日间精密度表示为相对标准偏差（RSDR(%)），QC的RSDR均应小于6%。
2.3.5 溶液稳定性
配制3000 ng/mL的质控样品，平行配制6份，研究壳聚糖溶液的稳定性。用新鲜制备的标准曲线分别考察质控样品在环境温度（25℃）放置24h, 在自动进样器（10 ℃）中放置48h，储备液在4℃储存10d的溶液稳定性。6次重复测定的准确度RE应小于5%，精密度应满足：QC的RSDr应小于3%。
2.3.6 基质效应
分别配制以下2组（共10种）QC样品，比较不同组之间峰面积获得基质效应的数据：
溶液A（无基质）：用流动相A配制3000 ng/mL的质控样品，平行配制3份，进样检测。
溶液B（含基质）：以流动相A为溶剂分别配制9种基质的溶液C，分别取9种溶液C各3批，按4.3.1.3离心处理方法处理后得到基质的上清液。分别用上述9种上清液配制3000ng/mL的质控样品，测定每种基质溶液的3个QC样品的峰面积。
共溶质的溶液C如下。溶液C1：1 μg/mL氨基葡萄糖；溶液C2：1 μg/mL乙酰氨基葡萄糖；溶液C3：1 μg/mL的COS 2~7混合溶液；溶液C4：1 μg/mL右旋葡聚糖；溶液C5：1 μg/mL葡萄糖；溶液C6：1 μg/mL蔗糖；溶液C7：1 μg/mL的8种糖代谢产物（柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸、果糖、α-酮戊二酸）混合溶液；溶液C8：1 μg/mL牛血清白蛋白；溶液C9：1 μg/mL的3种氨基酸（L-甲硫氨酸，L-半胱氨酸，L-精氨酸）混合溶液，分别作为含有基质的溶液C。
通过计算化合物在溶液B中的峰面积与在溶液A中峰面积的比值得到基质效应，要求变异系数不大于5%。
2.4 检测复合壳聚糖材料中的壳聚糖含量
2.4.1壳聚糖-海藻酸钠复合海绵的制备
称取壳聚糖CS200-87和海藻酸钠适量，分别用1%乙酸-水溶液（v/v）和水溶解并稀释至浓度约为1 mg/mL，待完全溶解后，将海藻酸钠溶液分别按不同比例一次性加入壳聚糖溶液中，得到壳聚糖占比分别为11.49%，22.14%，31.41%，48.35%，64.51%，74.48%和90.85%的壳聚糖-海藻酸钠混合溶液，在室温下1200 rpm/min搅拌2 h，制备了聚电解质复合物（PEC）。然后用2M NaOH将PEC调节至pH 7.0，在20 ℃下进行超声处理以去除气泡，充分搅拌后冷冻干燥，得到复合海绵。
2.4.2 壳聚糖-海藻酸钠复合海绵水溶液的制备
取7种壳聚糖-海藻酸钠复合海绵适量，粉碎，各精密称定3份。加50 mL水，在室温下200 rpm/min震荡30 min，使海藻酸钠完全溶解，5000 rpm/min 离心 20 min 后，倾倒弃去上清液，保留沉淀物，分离出了复合材料中的壳聚糖。再加50 mL 1%乙酸-水溶液（v/v）溶解沉淀物，在室温下200 rpm/min震荡30 min，使复合材料中的壳聚糖完全溶解。然后，用流动相A稀释约200倍至复合溶液体系质量浓度约为1000~2000 ng/mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液200 μL置于2 mL进样瓶中。按照4.2节中的UPLC-MS/MS方法采集并分析壳聚糖-海藻酸钠复合海绵中的壳聚糖成分，计算样品中壳聚糖的含量，检验建立的定量分析方法在检测复合壳聚糖材料中的适用性。
2.4.3 壳聚糖-透明质酸复合海绵的制备
称取壳聚糖CS200-87和透明质酸适量，分别用1%乙酸-水溶液（v/v）和水溶解并稀释至浓度约为1 mg/mL，待完全溶解后，将透明质酸溶液分别按不同比例一次性加入壳聚糖溶液中，得到壳聚糖占比分别为11.03%，23.46%，36.76%，49.67%，64.75%，74.61%和89.50%的壳聚糖-透明质酸混合物，在室温下1200 rpm/min搅拌2 h。用2M NaOH将PEC调节至pH7.0，在20 ℃下进行超声处理以去除气泡，充分搅拌后冷冻干燥，得到复合海绵。
2.4.4 壳聚糖-透明质酸复合海绵水溶液的制备
取7种壳聚糖-透明质酸复合海绵适量，粉碎，各精密称定3份。加50 mL水，在室温下200 rpm/min震荡30 min，使透明质酸完全溶解，5000 rpm/min 离心 20 min 后，倾倒弃去上清液，保留沉淀物，分离出了复合材料中的壳聚糖。再加50 mL 1%乙酸-水溶液（v/v）溶解沉淀物，在室温下200 rpm/min震荡30 min，使复合材料中的壳聚糖完全溶解。然后，用流动相A稀释约200倍至复合溶液体系质量浓度约为1000~2000 ng/mL，溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液200 μL置于2 mL进样瓶中。按照4.3.2节中的UPLC-MS/MS方法采集并分析壳聚糖-透明质酸复合海绵样品中的壳聚糖成分，计算样品中壳聚糖的含量，检验建立的定量分析方法在检测复合壳聚糖材料中的适用性。
2.4.5 壳聚糖-泊洛沙姆复合海绵的制备
称取壳聚糖CS200-87和泊洛沙姆适量，分别用1%乙酸-水溶液（v/v）溶解并稀释至浓度约为1 mg/mL，待完全溶解后，将泊洛沙姆溶液分别按不同比例一次性加入壳聚糖溶液中，得到壳聚糖占比分别为16.39%，28.93%，34.09%，50.75%，51.11%，67.24%和82.27%的壳聚糖-泊洛沙姆混合溶液，在室温下1200 rpm/min搅拌2 h，制备聚电解质复合物（PEC）。然后用2M NaOH将PEC调节至pH 7.0，在20 ℃下进行超声处理以去除气泡，充分搅拌后冷冻干燥，得到复合海绵。
2.4.6 壳聚糖-泊洛沙姆复合海绵水溶液的制备
取7种壳聚糖-泊洛沙姆复合海绵适量，粉碎，各精密称定3份。加50 mL 1%乙酸-水溶液（v/v）溶解，在室温下200 rpm/min震荡30 min，使复合材料完全溶解。用流动相A稀释约200倍至复合海绵溶液体系质量浓度约为1000~2000 ng/mL，复合海绵溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液200 μL置于2 mL进样瓶中。按照4.3.2节中的UPLC-MS/MS方法采集并分析壳聚糖-泊洛沙姆复合海绵样品中的壳聚糖成分，计算样品中壳聚糖的含量，检验建立的定量分析方法在检测复合壳聚糖材料中的适用性。
2.5 数据处理
数据的采集及处理和计算通过Masslynx 4.2软件完成。用待测物的峰面积和待测物的浓度线性拟合回归方程，应用此方程计算QC样品和复合海绵中壳聚糖的浓度。使用计算机Excel for Windows软件进行数据处理和制图。
3. 结果与讨论
3.1 分析方法的确证
分析方法的确证是按照2020年版《中国药典》中“9101 分析方法验证指导原则”的相关内容进行。
3.1.1 方法的专属性
在该方法中，评价了6份CS200-87样品溶液，以证明CS水溶液的选择性。空白溶液、125 ng/mL CS200-87溶液和1000 ng/mL CS200-87溶液样品的代表性MRM总离子流色谱图及13个特征离子对分别的色谱图见图1和图2。供试空白样品的MRM色谱图清楚地显示，在CS200-87的洗脱时间处未获得干扰峰，其专属性良好。
3.1.2 线性和范围
以标示浓度为横坐标（X），以CS200-87的13个特征离子对总离子流（TIC）的峰面积为纵坐标(Y)，两者通过加权（1/X2）最小二乘法回归分析线性。在125~4000 ng/mL的浓度范围内拟合线性回归。分析中包括零和空白样品，以确认样品制备不存在流动相和溶剂干扰，并确认样品制备的重现性。在各验证批次中，标准曲线显示出良好的线性，总离子流（TIC）拟合线性回归相关系数（r2）大于0.999，13个特征离子对分别拟合线性回归相关系数（r2）均大于0.99。设定LLOQ（125 ng/mL）具有足够的灵敏度（S/N>10），可用于CS200-87水溶液中含量测定的研究，考察结果符合要求。CS200-87的13个特征离子对及TIC的峰面积分别与标示浓度拟合线性回归方程见表2；拟合的标准曲线图见图3（TIC和13个壳聚糖特征离子通道）；准确度和偏差均小于±5%，见图4，图中虚线之间的灰色区域为偏差±5%的范围，图中黑色实线位置与壳聚糖理论浓度偏差为0。实验结果表明，检测壳聚糖的13个特征离子中的任意一个均可用于对壳聚糖建立标准曲线实现定量，其中，运用检测壳聚糖的13个特征离子总离子流（TIC）的方法线性关系最好，检测多个特征离子可以更好的描述壳聚糖的质谱特征，排除基质中可能存在的化合物对检测方法的干扰。
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3.1.3 重复性考察
3000 ng/mL的质控样品工作液，连续进样6次，测定壳聚糖CS200-87的13个特征离子对和总离子流（TIC）的峰面积的RSD值分别为：TIC的RSD为0.51%、D（162.18→84.23 m/z）RSD 1.47%、A（204.18→126.15 m/z）RSD 2.68%、D2A0（323.30→162.19 m/z）RSD 0.56%、H-D2A0-OH（341.44→162.18 m/z）RSD 1.86%、D3A0（484.49→162.18 m/z）RSD 1.16%、H-D3A0-OH（502.44→162.18 m/z）RSD 1.08%、D2A1（526.50→162.18 m/z）RSD 1.04%、D4A0（645.60→162.17 m/z）RSD 0.88%、H-D4A0-OH（663.57→162.17 m/z）RSD 1.38%、D5A0（806.73→162.17 m/z）RSD 1.07%、H-D5A0-OH（824.69→162.17 m/z）RSD 1.57%、D6A0（967.83→162.17 m/z）RSD 2.37%、D7A0（1128.92→162.17 m/z）RSD 2.22%，均小于3%，表明方法重复性良好。
3.1.4 准确度和精密度考察
在3000 ng/mL水平下，对CS200-87的13个特征离子对和总离子流（TIC）的准确度和精密度进行了6份样品重复评价，重复3个批次。对于3000 ng/mL QC水平，3个分析批样品准确度的RE为-4.98%至4.11%，RE在±5%范围内，考察结果符合要求。此外，3000 ng/mL QC样品的日内和日间精密度的RSD分别在0.47%~1.88%之间和1.03%~4.39%之间，均在可接受范围内。表3中所示的结果表明，所建立的方法具有良好的精密度和准确度。
表3 UPLC-MS/MS法测定CS200-87的13个特征离子对和特征离子对总离子流（TIC）的准确度和精密度（n=18）
3.1.5 溶液稳定性
测定CS200-87水溶液的稳定性，数据见表4。结果表明，样品在环境温度（25 ℃）放置24 h, 在自动进样器（10 ℃）中放置48 h，储备液在4℃储存10 d的稳定性良好，CS200-87的不同特征离子对和总离子流（TIC）下的实测浓度的RE分别为-3.66%~1.29%，-2.69%~2.79%，-0.39%~1.82%，均在±5%范围内；RSD分别为0.29%~1.79%，0.75%~2.59%，0.38%~2.70%，均小于3%。样品在整个分析过程中稳定，所建立的方法可用于CS200-87溶液样品的常规分析。
表4 UPLC-MS/MS法测定CS200-87的溶液稳定性（13个特征离子对和特征离子对总离子流，n=6）
3.1.6 基质效应
为了验证壳聚糖与常见的基质共溶时，是否会影响本方法对壳聚糖定量，实验分析了壳聚糖在2.3.6节中的基质溶液中检测方法的适用性。在存在不同基质的情况下，通过UPLC-MS/MS方法检测壳聚糖CS200-87（Mw = 183.11 kDa，DD% = 86.76%）的浓度，基质效应产生的影响见表5。在图5中，实验检测的壳聚糖浓度与其理论浓度非常一致，灰色条状区域为理论值变异系数±5%的范围，黑色虚线位置与理论浓度偏差为0。在给定的检测溶液条件下（pH 2.8左右），牛血清白蛋白和壳聚糖都是带正电荷的，因此确保了相互排斥，不可能出现络合物。由于在样品制备过程中通过离心过滤可以去除不影响壳聚糖溶解的不溶性杂质，如果初始壳聚糖溶液中存在不溶性阳离子和中性大分子，那么后者不会影响壳聚糖的测量。对于检测时溶液中共存的大分子糖类聚合物、小分子糖类及糖代谢产物等未产生干扰信号，壳聚糖溶解和定量不受影响。对于含有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、低聚壳寡糖的壳聚糖溶液，在样品制备过程中不去除具有与壳聚糖相同结构单体（GlcN和GlcNAc）的低聚物，会产生与壳聚糖相似的特征离子质谱信号，但信号仅限于聚合度较低的特征离子且与壳聚糖的多个特征离子不完全对应，并经过色谱洗脱可以实现有效的分离，壳聚糖定量也不受影响。因此，在壳聚糖溶液中分别存在氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、低聚壳寡糖、葡聚糖、葡萄糖、蔗糖、糖代谢产物（柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸、果糖、α-酮戊二酸）、牛血清白蛋白、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸等基质时均不影响壳聚糖的溶解和测定。
3.2 检测复合壳聚糖材料中的壳聚糖含量
实验中利用UPLC-MS/MS方法建立壳聚糖CS200-87含量测定的标准曲线，分别对以壳聚糖CS200-87为原料制备的壳聚糖-海藻酸钠复合材料、壳聚糖-透明质酸复合材料、壳聚糖-泊洛沙姆复合材料中的壳聚糖成分的含量进行了测定。
3.2.1 检测壳聚糖-海藻酸钠复合材料中的壳聚糖含量
利用2.3.2项中的标准曲线对壳聚糖-海藻酸钠（CS-SA）复合材料样品中的壳聚糖进行检测，随行标准曲线见图6，检测结果见表6。
壳聚糖-海藻酸钠复合材料经分离壳聚糖后溶解配制成复合材料体系质量浓度约1000~2000 ng/mL的样品溶液，通过UPLC-MS/MS方法可以准确的测定其中壳聚糖的含量，7种配制比例的复合样品中壳聚糖含量的测定偏差分别为3.63%，-3.68%，-2.75%，0.60%，0.86%，0.45%，1.07%。说明，本研究建立的方法可以用于壳聚糖-海藻酸钠复合材料的定量分析。
UPLC-MS/MS方法测定CS-SA复合材料中的壳聚糖，需要在样品制备过程中使壳聚糖充分的溶解。在不能确保壳聚糖充分溶解的情况下，可先将壳聚糖分离，再充分溶解后测定。
3.2.2 检测壳聚糖-透明质酸复合材料中的壳聚糖含量
利用2.3.2项中的标准曲线对壳聚糖-透明质酸（CS-HA）复合材料样品中的壳聚糖进行检测，随行标准曲线见图7，检测结果见表7。
由于壳聚糖-透明质酸在1%乙酸-水溶液中也会发生静电吸附形成不溶性络合物，通过先将壳聚糖分离，再充分溶解后测定。将壳聚糖-透明质酸复合材料经分离壳聚糖后溶解配制成复合材料体系质量浓度约1000~2000 ng/mL的样品溶液，通过UPLC-MS/MS方法可以准确的测定其中壳聚糖的含量，7种配制比例的复合样品中壳聚糖含量的测定偏差分别为-2.19%，0.80%，-0.84%，3.41%，3.65%，3.20%，4.12%。说明，本研究建立的方法可以用于壳聚糖-透明质酸复合材料的定量分析。
3.2.3 检测壳聚糖-泊洛沙姆复合材料中的壳聚糖含量
利用2.3.2项中的标准曲线对壳聚糖-泊洛沙姆（CS-Poloxamer）复合材料样品进行检测，随行标准曲线见图8，检测结果见表8。
由于壳聚糖、泊洛沙姆188和CS-Poloxamer复合物均可溶于1%乙酸-水溶液中，直接溶解两者的复合物，可以确保壳聚糖充分的溶解。将壳聚糖-泊洛沙姆复合材料溶解配制成复合材料体系质量浓度约1000~2000 ng/mL的样品溶液，通过UPLC-MS/MS方法可以准确的测定其中壳聚糖的含量，7种配制比例的复合样品中壳聚糖含量的测定偏差分别为0.36%，-2.44%，1.26%，-1.36%，4.38%，2.34%，3.93%。说明，本研究建立的方法可以用于壳聚糖-泊洛沙姆复合材料的定量分析。
4. 总结
本研究中开发了一种新型的直接测定水溶液中壳聚糖含量的UPLC-MS/MS检测方法，通过检测一系列壳聚糖的特征离子对的响应强度，以壳聚糖样品浓度为横坐标，以壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流（TIC）响应的峰面积为纵坐标，对两者建立线性关系拟合，构建可靠的定量壳聚糖样品的标准曲线，测定范围为125~4000 ng/mL，在给定的检测条件下，方法的专属性、线性关系、精密度、准确度、稳定性良好，溶液中存在不与壳聚糖相互作用的一系列基质时测量不受干扰。该方法为壳聚糖含量的测定提供了一种思路和方法。具有较高的实用价值和经济效益。
样品制备过程中不需要进行过多的样品处理，无需长时间水解、荧光标记、同位素标记、染色等操作，没有其他复杂的反应条件，检测的时间大大缩短，提高了便捷性，以及可适用的色谱设备和液相性能相关参数调整空间较大，并且质谱的灵敏度较高可以检测低至ng/mL级别的水溶液样品，这些可以被认为是该方法相对于现有的壳聚糖定量方法的关键优势。
进一步，还可以对不同脱乙酰度的壳聚糖开发UPLC-MS/MS检测方法，用不同脱乙酰度的壳聚糖标准品建立可用于含量测定的标准曲线，即可实现对相应脱乙酰度的壳聚糖样品的定量分析，结合脱乙酰度对检测方法作适当的校正，这将突出该方法的通用性。因此，用于壳聚糖测定的UPLC-MS/MS方法有很高的潜力作为工业部门中质量控制的工具，这些都将为壳聚糖产品质量的稳定性和可控性提供简单、快捷、有效的检测手段，为科研人员特别是企业技术人员提供方便。再进一步，该研究思路和方法的开发可能为生物样品中的壳聚糖的定量分析方法的建立奠定基础，并有希望成为壳聚糖体内药代动力学的研究工具，对壳聚糖类材料和医疗器械的开发有重要的现实意义。
Claims (5)
1.一种准确测定壳聚糖含量的UPLC-MS/MS方法，包括下述步骤：
1）称取壳聚糖样品适量用体积分数为1%乙酸-水溶液溶解，得到待测壳聚糖样品溶液；
2）对得到的待测壳聚糖样品溶液采用UPLC-MS/MS法进行检测；
所述步骤2）中，所述采用UPLC-MS/MS法进行检测包括下述步骤：利用超高效液相色谱对待测壳聚糖样品溶液进行液相洗脱，随后用质谱检测得到物质峰并进行定性定量分析；
所述液相洗脱的条件为：壳聚糖的分离、检测在下述任意色谱柱上进行：Waters，ACQUITY UPLC peptide BEH300 C18 色谱柱，1.7 μm, 300 Å, 2.1 mm×100 mm, 或Waters，BEH Shield RP18色谱柱，1.7 μm, 130 Å, 2.1 mm×100 mm,或Waters，BEH C8 色谱柱，1.7 μm, 130 Å, 2.1 mm×100 mm,或Waters，BEH C18色谱柱，1.7 μm, 130 Å, 2.1mm×100 mm,或Waters，ACQUITY UPLC BEH450 SEC 色谱柱2.5 μm, 450 Å, 2.1 mm×150mm；
色谱柱温度设置为30~60 ℃，进样体积为 0.5~2.5 μL，流动相流速为 0.2~0.4 mL/min；
流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行等度洗脱；流动相 A：甲酸浓度为 0.1 v %的水溶液，流动相 B：甲酸浓度为 0.1 v %的乙腈溶液；
所述等度洗脱的流程如下：
0~2 min，体积分数60~95%的流动相A-体积分数40~5%的流动相B；
所述流动相中，所述流动相A的体积分数在60~95%之间均可，相应的流动相B比例为：100%-所述流动相A的体积分数；
洗针液为0.1v%甲酸-25v%甲醇-25v%异丙醇-49.9v%水溶液；密封件冲洗液为10v%乙腈-90v%水溶液；
所述质谱检测的条件如下：
质谱仪为Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪，配有ESI源，样品的测定在正离子模式下进行，ESI 源参数设置如下：毛细管电压：1800~3600 kV；锥孔电压：50~78 V；偏转电压：50~60 V；脱溶剂温度：300~400 ℃；ESI源温度：100~150 ℃；锥孔气流速：150~250 L/h；脱溶剂气流速：600~700 L/h；雾化气压：5.5~6.5 bar；碰撞气为氩气；检测模式为 MRM；将壳聚糖在ESI源中产生的碎片离子按照其由不同数量的脱乙酰化单体D和乙酰化单体A组合的形式命名，
壳聚糖在MRM模式下检测的离子对及锥孔电压和碰撞能量见下表：
所述步骤2)还包括建立壳聚糖标准曲线的步骤，具体方法如下：
a1)标准溶液配制
用壳聚糖标准品配制成一系列浓度的标准溶液，所述壳聚糖标准品应与待测壳聚糖样本的脱乙酰度一致；
b1)采用所述步骤2）中的方法对所述系列浓度的标准溶液进行检测，同时记录峰面积；以壳聚糖标准品溶液质量浓度为横坐标X，以壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流TIC响应的峰面积为纵坐标Y进行线性拟合，用加权最小二乘法W=1/X2进行回归运算，所得的直线回归方程即为标准曲线；
将所述步骤2)中对待测壳聚糖溶液采用UPLC-MS/MS法进行检测所得的壳聚糖产生的13个特征离子对的总离子流TIC响应的峰面积代入所述标准曲线，得到所述壳聚糖样品溶液中壳聚糖的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测壳聚糖样品溶液通过 AcquityI-class 超高效液相色谱串联 Xevo TQ-S 质谱系统洗脱和检测，仪器系统通过 Masslynx4.2软件控制。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述待测壳聚糖样品溶液需在25℃条件下用恒温振荡器 200 rpm/min 振荡 2 h，使样品充分溶解。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述a1)具体的配制方法为：精密称取壳聚糖标准品适量，用体积分数1%乙酸-水溶液溶解至浓度为 0.2 mg/mL，得到壳聚糖储备液；以所述流动相A为溶剂，取壳聚糖储备液用于配制标准曲线样品；用流动相A逐级稀释到最终浓度125，250，500，1000，2000，4000 ng/mL，配制成标准曲线样品工作溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述壳聚糖样品由单纯的壳聚糖提供，或由壳聚糖复合物中的壳聚糖提供；
所述壳聚糖复合物包括壳聚糖-海藻酸钠复合海绵、壳聚糖-透明质酸复合海绵、壳聚糖-泊洛沙姆复合海绵；
当壳聚糖样品为壳聚糖复合物时，首先需要将壳聚糖复合物加水震荡，然后离心弃去上清液，保留沉淀物，分离出复合物中的壳聚糖，然后再加入1%乙酸-水溶液溶解沉淀物，得到待测壳聚糖样品溶液。
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| CN104345102A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-02-11 | 中国科学院海洋研究所 | 一种测定特定聚合度范围壳寡糖含量的方法 |
| CN109884209A (zh) * | 2019-03-19 | 2019-06-14 | 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） | 一种保健品中壳寡糖含量的检测方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 高分子多糖——壳聚糖的定性、定量分析方法的探究;李京峰;中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑(第9期);第35-45页 * |
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