CN111721864A - 高效液相色谱法快速测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸三钠盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法快速测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸三钠盐的方法，样品中总三聚硫氰酸三钠盐用乙腈‑甲酸/甲酸铵缓冲溶液体系涡旋超声提取，以甲醇‑酸化醋酸铵为流动相梯度洗脱，Atlantis T3色谱柱进行分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量。所优化的乙腈‑甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取体系不仅能高效提不同形式的TMT，还能够很好的分散不同基质样品，克服小麦粉改良剂提取易“胶化”问题。该方法简便、高效、准确性好，适用于小麦粉及其处理剂中非法添加剂TMT的快速定性、定量分析，为保障小麦粉的质量安全提供技术支持。

Description

高效液相色谱法快速测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三 聚硫氰酸三钠盐的方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法。

背景技术

三聚硫氰酸三钠盐，又名三巯基均三嗪三钠盐，1,3,5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三硫醇三钠盐等，是一种纯白色结晶体，分子式为C₃N₃S₃Na₃，分子量为243.22，极易溶于水。三聚硫氰酸三钠盐（TMT）是重金属离子去除剂，多年来一直用于含重金属离子的工业废水处理。TMT最早由德固赛公司生产，能与水溶液中大多数一价和二价重金属离子，如Cu²⁺、Pd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Ti²⁺、Cd²⁺等离子形成稳定的化合物而沉淀出来，从而达到去除重金属离子的目的。尤其对传统碱中和方法不能处理的重金属离子具有很好的去除效果。随着工业废水的大量排放，重金属污染的日益加剧，TMT在含重金属废水处理工业中得到广泛的应用。小麦粉作为我国大宗消费食品，其质量一直是食品安全关注的重点，对于小麦粉中毒素、漂白剂及重金属残留等常规监测项目不放松的同时，对于其他风险项目也一直在进行。最近有检测到小麦粉中含有非食用物质TMT，引起了研究者的强烈关注。TMT的引入是污水处理带来的二次污染引起，还是不发分子非法添加还不明确。食品中残留TMT这种化工产品，为非食用物质，带了较严重的食品安全隐患。加强小麦粉及其相关产品中TMT的监测亟需开展，建立检测方法是首要任务。

对TMT的检测研究极少，小麦粉及其处理剂中的研究目前未见报道。目前调研的文献有三聚硫氰酸三钠盐药剂含量测定，分别利用酸碱滴定法和紫外分光光度计方法对其含量进行测定。还有报道，利用高效液相色谱法对三聚硫氰酸作为橡胶助剂的检测，添加离子对试剂增加其保留的反相色谱分离，该方法只是标准品的分析，不涉及前处理。高效液相色谱法具有普及率高、定量准确、兼容性好等特点，对于有紫外吸收的化合物是常用检测手段。三巯基均三嗪三钠根据溶液pH的不同，以4种形式存在：C₃N₃S₃ ^3-（pH≥12.5）、HC₃N₃ ^2-（pH=8~10）、H₂C₃N₃S^-（pH=5~8）、H₃C₃N₃S₃ ⁰（pH<5）。存在形式的复杂增加了对其提取的困难，如何将不同形式的TMT都提取出来是我们研究的重点。小麦粉主要含有淀粉、糖、蛋白等成分，基质已有较多研究。面粉处理剂（改良剂），能够改善国产面粉的品质，有面粉漂白剂、面团改良剂和营养强化剂等。面粉处理剂成分较复杂，有碳酸钙、维生素C及各种酶制剂。基质简单的面粉处理剂提取净化也较容易，而以食用玉米淀粉、淀粉酶等复合酶等基质为主的添加剂，基质较复杂，遇水易成胶状不适于很多溶剂，给提取带来较大难度。如何兼顾TMT各种形式的提取效率和基质的分散性是研究的关键。

发明内容

本研究对小麦粉及其处理剂经乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取，以乙腈-酸化醋酸铵为流动相梯度洗脱，Atlantis T3色谱柱进行分离，二极管阵列检测器检测，外标法定量，建立了检测小麦粉及其处理剂中总三聚硫氰酸三钠盐的快速检测方法。优化的乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取溶剂不仅有效的提取TMT的各种形式，还能很好的分散各种类型的面粉处理剂。该方法简便快捷，灵敏度高，重现性好，检测效率高，特别适合小麦粉及其处理剂中总三聚硫氰酸三钠盐的定性、定量检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理：称取均匀样品于聚丙烯具塞离心管中，加入提取液乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液，涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，提取液过PTFE滤膜，得预处理样品；

（2）标准溶液的配制：准确称取10 mgTMT标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，0℃-4℃避光保存，移取标准储备液用乙腈-甲酸/甲酸铵溶液稀释，得到标准工作液，0℃-4℃避光保存；

（3）测定：试样用高效液相色谱进行检测分析计算。

优选地，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5-3，浓度为10-500 mmol/L。

更优选地，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5，浓度为100 mmol/L。

优选地，所述的提取液的加入量为：1 g样品中的加入20mL乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（体积比8:2）。

上述所述的高效液相色谱条件为：

色谱柱：Atlantis T3 250 mm×4.6 mm, 5 µm；流动相: 甲醇(A) 和10 mmol/L 醋酸铵缓冲溶液（pH4.0）(B)；梯度洗脱程序: 0~9.0 min: 30%保持；9.0~10: 30%~90%；10.0~15.0 min: 90%保持；15.0~16.0min: 90%~30%；16.0~25 min: 30%保持；检测波长：296 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 µL。

有益效果

本文首次建立了适用于小麦粉及其处理剂中TMT总量的测定方法。方法详细优化了影响提取效率的几个因素，克服了基质复杂的面粉处理剂的特殊性和TMT存在形式的多样性带来的提取效率低的难题，通过乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲体系，结合定性定量准确的高效液相色谱法，实现了不同面粉及其处理剂中TMT总量的检测方法。该方法样品前处理简便快速，定性、定量准确，可满足小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸钠盐总量的快速检测，对于加强小麦粉质量控制提供技术支持。

附图说明

图1 Xbrige C18柱分离小麦粉（a1）和面粉改良剂（a2）中TMT与干扰峰的色谱图；

图2不同色谱条件对TMT及杂质的分离效果图；a1：甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH4.0)分离小麦粉中TMT及杂质的色谱图；a2：甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH4.0)分离面粉改良剂中TMT及杂质的色谱图；a3：标准溶液中TMT色谱图；b1：甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH5.0)分离小麦粉中TMT及杂质的色谱图；b2：甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH5.0)分离面粉改良剂中TMT及杂质的色谱图；c1：甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH6.1)分离小麦粉中TMT及杂质的色谱图；c2：甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH6.1)分离面粉改良剂中TMT及杂质的色谱图。

图3不同pH条件下TMT的光谱图；

图 4不同影响因素对TMT提取效率的影响：

图5不同取样量对TMT提取效率比较。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1实验部分

1.1 材料与试剂

三聚硫氰酸三钠盐（TMT）标准品(adamas-beta)；Atlantis T3色谱柱(250 mm×4.6mm，5 µm) 美国Waters公司；甲醇、乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司；甲酸、甲酸铵、磷酸氢二铵、醋酸铵(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。实验检测用的小麦粉及面粉处理剂均购自于超市。

1.2 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪(配备Waters 2998二极管阵列检测器) 美国Waters公司；AB204-S型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超声波清洗器 中国宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷冻离心机 德国Sigma公司；Milli-Q超纯水制备器美国MILLIPORE公司；涡旋混合器 德国IKA公司，PTFE微孔滤膜0.45µm 上海安谱科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取10 mg(精确至0.1mg)TMT标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，0℃-4 ℃避光保存。移取标准储备液用乙腈-甲酸/甲酸铵溶液稀释到适当的浓度得到标准工作液，0℃-4 ℃避光保存。

1.3.2样品前处理

称取均匀样品1 g（精确至0.0001 g）于50 mL聚丙烯具塞离心管中，加入20 mL乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8:2），涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，提取液过PTFE滤膜，供高效液相色谱测定。

1.3.3高效液相色谱条件

色谱柱：Atlantis T3 250 mm×4.6 mm, 5 µm；流动相: 甲醇(A) 和10 mmol/L 醋酸铵缓冲溶液(pH4.0)(B)。梯度洗脱程序: 0~9.0 min: 30%保持; 9.0~10: 30%~90%; 10.0~15.0 min: 90%保持; 15.0~16.0min: 90%~30%; 16.0~25 min: 30%保持; 检测波长：296nm；流速：1.0 mL/min。柱温：35℃；进样量：10 µL。

1.4 数据处理

通过与仪器配套的Empower 3色谱数据处理系统完成数据采集与处理，以及Origin8.0进行绘图。

结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1色谱柱的选择

TMT在C18上有一定的色谱保留。比较Xbrige C18（150 mm×4.6 mm, 3.5 µm）、SEVAC18 （150 mm×4.6 mm, 5 µm）、Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm, 5 µm）、AtlantisT3（250 mm×4.6 mm, 5 µm）四种色谱柱对TMT的保留及分离效果的影响。结果发现，XbrigeC18和 SEVA C18保留时间短（约4min），小麦粉中TMT与干扰峰分离度好，但面粉改良剂中TMT与干扰峰分离效果差(图1)。另外，TMT在SEVA C18色谱柱上响应低，仅是Atlantis T3柱分离出目标峰的1/3。Symmetry Shield C18分离目标峰时，峰宽为1.5min，比Atlantis T3柱宽0.7min，峰展宽明显。综合比较发现，在相同的流动相条件下，TMT在 Atlantis T3柱上保留最好、峰展宽小、且同干扰物分离更好。

流动相的选择

分别考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-10 mmol/L醋酸铵溶液(PH3)、甲醇-10 mmol/L磷酸氢二铵溶液(pH3)、甲醇-10 mmol/L磷酸二氢钾溶液(pH3)几种流动相对目标物的影响，结果发现，结果发现甲醇作为质子性溶剂，较乙腈在分离度上更好。甲醇-水较甲醇-缓冲盐溶液保留性能差，几种缓冲盐区别不大，鉴于磷酸盐对仪器和色谱柱的损伤，选择甲醇-醋酸铵作为流动相。

实验发现不同pH的流动相对TMT的色谱行为影响较大，比较甲醇-醋酸铵(10M,pH6.0)，甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH5.0)，甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH4.0)，甲醇-酸化醋酸铵(10M,pH3.0)对TMT的分离效果。结果发现，随着pH降低，保留性能提高，目标峰与杂峰的分离效果得到改善。pH=6.1（即醋酸铵本身pH）时，面粉改良剂的中TMT与杂峰的分离度差，如图(2,a2)，且标样与样品中TMT的保留时间不同，相差0.32 min，无法定性。分析原因应该是该流动相pH不能提供较好的缓冲能力。当pH=5时，保留时间在5.766min，小麦粉中TMT与杂峰合在一起，不能有效分离，影响结果的准确定量，见图(2,b1)。当pH=3和4时，小麦粉的保留性能和分离效果区别不大。考虑到色谱柱耐受性，选择pH4为流动相缓冲溶液的pH，一方面能有效排除假阳性结果的干扰，满足准确定性定量的目的，另一方面能有效延长色谱柱寿命。

目标物定性讨论

实验发现随着流动相pH的变化，标准溶液中目标峰光谱图不同。当醋酸铵pH为5.0和6.0时，TMT在285nm附近有最大吸收，而当醋酸铵pH为3.0和4.0时,TMT在295nm附近有最大吸收。不同pH下TMT吸收波长明显不一致，推测原因可能是TMT在不同pH条件下，存在形式不同，见图3。实际检测时须仔细核对目标峰的光谱吸收。

2.2 前处理条件优化

2.2.1提取溶液的选择

小麦粉基质复杂，不同配方的面粉处理剂基质差异大，特别是一些含复合酶的面粉处理剂在大部分溶液中易胶化，给提取带来难度。TMT在不同溶液中的存在形式多样， TMT的有效提取是研究的难点。分别考察水、甲醇、乙腈、乙腈+水（体积比，1+1）、乙腈+1%甲酸水（体积比,1+1）、乙腈+100mmNH4FA（pH3,体积比,1+1）等溶液作为提取剂的提取效果。结果发现（表1），水作为提取溶剂无法获得提取清液，不适合作为提取溶剂。乙腈较甲醇在提取效率上略好，对小麦粉和改良剂2（盐式改良剂）回收率只有75.4%和74.1%，对于改良剂1（酶式改良剂）回收率只有66.0%。乙腈+水（体积比,1+1）、乙腈+1%甲酸水（体积比,1+1）对小麦粉和改良剂2（盐式改良剂）中TMT的提取效率分别提高到有85%和95%左右，但对改良剂1均发生胶化现象，无法测定。乙腈+100mmNH4FA（pH3,体积比,1+1）提取回收率同乙腈+1%甲酸水（体积比,1+1）相当，对于阳性样品提取效率稍高些。值得注意的是，实验发现乙腈+100mmNH4FA（pH3,体积比,1+1）提取体系不仅能够较好的分散样品，不成胶，且缓冲溶液能够应对不同配方的处理剂，小麦粉和改良剂2（盐式改良剂）提取效果也较好，对于改良剂1（酶式改良剂）提取效率仍需进一步优化。

表1不同提取溶剂下小麦粉及面粉处理剂中TMT提取效率比较

Table 1 Average recoveries of TMTwith different extraction solvent (n=3)

2.2.2提取缓冲盐溶液的选择

通过对不同提取溶剂选择发现，加入缓冲盐溶液不仅提高提取效率，对于酶式处理剂有较好的分散作用，但是对于酶式改良剂的提取效率为73.1%仍需进一步优化。对乙腈+100mmNH4FA（pH3,体积比,1+1）、乙腈+20mm(NH4)2HPO4（pH3,体积比,1+1）、乙腈+20mmKH2PO4（pH3,体积比,1+1）、乙腈+100mmNH4FA-10mmEDTA (pH3,体积比,1+1）几种不同缓冲盐溶液进行比较，结果分析发现（表1），将酸化的甲酸铵缓冲盐更换为磷酸氢二氨和磷酸二氢钾时，对于小麦粉和盐式改良剂提取效率无明显改善，对酶式改良剂却发生了胶化现象，无法检测。酶式改良剂成分较复杂，主要配方有玉米淀粉、各种酶制剂、碳酸钙、维生素C等成分，其中有些成分遇水易胶化，甲酸铵缓冲盐可能能够破坏这些成分的胶化。此外，我们也尝试在提取体系中加入鳌合试剂EDTA来提高提取效率，结果发现效果并不明显。因此提取溶液选择甲酸铵缓冲盐作为提取溶液。

缓冲盐溶液pH的优化

在前面从提取溶剂选择讨论来看，乙腈+1%甲酸水（体积比,1+1）较乙腈+水（体积比,1+1）对小麦粉和改良剂2（盐式改良剂）中TMT的提取效率有明显提高，我们推测TMT的提取与提取溶剂的pH有一定的关系。对乙腈+100mmNH4FA（pH3,体积比1+1）提取体系的pH及盐浓度进行进一步优化。分别对pH为2，2.5，3，4，6.5（约为小麦粉本身pH值）几个水平进行考察，结果见图，可以看到小麦粉和酶式面粉处理剂分别在pH为3和2.5时得到有效pH环境，随着pH值的进一步降低，TMT的提取效率变化不大。综合考虑选择pH2.5作为提取溶剂的提取pH值，在此pH下，酶式处理剂的提取液pH也较好的控制在5以下，酶式面粉处理剂中TMT提取效率提高至81.3%。

缓冲盐溶液盐浓度的优化

在前面讨论中我们可以看到加入一定浓度的甲酸铵缓冲盐后，提取效率和分散效果均有明显提升，应该是溶液的离子强度对于提取效率有一定的影响。对于酶式处理剂在优化的pH下仍然存在提取不完全的问题，是否是因为溶液的离子强度未满足酶式处理剂中TMT的提取需求。我们对乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比1:1）的不同缓冲盐浓度进行考察，设计浓度点为10 mmol/L，20 mmol/L，50 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，500mmol/L。通过对小麦粉和酶式处理剂的加标回收率及阳性小麦粉的测定含量进行分析，结果发现缓冲溶液的盐浓度对TMT的提取有一定的影响。随着盐浓度的升高，提取效率呈升高趋势，当达到100 mmol/L时提取效率最高，进一步提高盐浓度有轻微的下降，推测原因可能是过高的盐浓度对于TMT的离子转化有抑制作用，因此我们选100 mmol/L作为我们提取溶液的缓冲盐浓度。

提取溶剂中有机相含量的优化

通过对不同形式的TMT进行分析发现，在pH<5时，主要以分子状态存在，该状态不易溶于水，是否是我们提取溶剂的有机相含量存在影响，对此我们对乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5）提取体系的不同有机相含量进行考察，分别为40%，50%，60%，70%，80%，90%。结果发现随着有机相的提高，酶式面粉处理剂中TMT的提取效率有较明显的提高，回收率从65.8%到96%，阳性样品的含量测定值从11.58mg/kg到14.69 mg/kg。该结果说明在该提取体系中，TMT的主要存在形式为分子状态更容易被高比例有机相提取，但是有机相比例过高，影响缓冲溶液所提供的离子强度和pH时，提取效率会有所下降，综合考虑我们选择80%的乙腈-缓冲溶液体系。

通过对提取溶液的pH值、缓冲溶液盐浓度及有机相含量分别进行优化发现，影响TMT的提取因素是三者的综合作用。另一方面我们发现小麦粉中TMT的提取回收率区别不大，但是阳性样品对不同因素有明显波动，推测原因应该是通过加入标准溶液计算回收率的方式时，TMT同基质中的金属离子或杂质结合不紧密，较容易被提取。酶式处理剂是我们考察的重点，该种基质配方复杂，不同品牌差异较大。其中TMT的提取行为同小麦粉中差异较大，推测原因应该是酶式处理剂中含有各种复合酶（蛋白）容易同TMT-金属离子复合物相互作用，或存在一定的包裹，提取难度较大。所优化的乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）提供高比例有机相和缓冲盐体系，一方面最大程度破坏蛋白等杂质的影响，另一方面能够提高以分子状态存在的TMT目标物的提取效率。我们确定乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）为我们的提取溶剂。

称样量的选择

取样量是影响方法的一个直接因素，它关系到取样的代表性、方法灵敏度及方法的提取效率，综合三方面的需求才能更好的确定方法的称样量。分别对0.5 g、1g、2 g、3 g及4 g五个不同取样量进行实验，结果发现随着取样量的降低，TMT的回收率有明显提高，阳性样品测定量也有所提高，说明过高取样量影响样品的分散和有效提取。小麦粉及面粉处理剂属于样品较均匀基质，综合考虑取样代表性及方法灵敏度，我们确定取样量为1g。

提取体积及提取次数的考察

以乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）为提取剂，考察不同提取体积对TMT提取效率的影响。分别以10 mL、20 mL及30 mL0.05%的甲酸-乙腈按照1.3.2方法处理和1.3.3的色谱条件测定，结果发现10 mL的提取效率明显较低，分散较差，提取不完全。20 mL与30 mL目标成分提取回收率无明显差异，说明20 mL提取剂即可完全提取目标物。综上，提取体积确定为20 mL。分别对提取1次、2次、3次提取次数进行考察，发现提取1次回收率即满足要求，进一步增加提取次数，回收率无明显提高，因此以10 mL乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液（pH2.5，体积比8+2）提取1次进行试验。

方法学评价

2.3.1 线性范围、检出限和定量限

将标准储备液用甲醇逐级稀释得质量浓度为0.05、0.2、1.0、5.0、10.0 µg/mL的系列标准工作溶液。将系列标准工作溶液按质量浓度从低到高的顺序，按1.3.3节条件进行测定，以TMT峰面积（Y）对质量浓度（X）作标准曲线。以信噪比S/N=10得到目标物的定量限(LOQ)为0.5 mg/kg，以信噪比S/N=3得到目标物的检出限(LOD)为1.0 mg/kg。TMT在0.05～10.0 µg/mL之间线性关系良好，线性回归方程为：Y=9.75×10⁴X-1.32×10³，R²=0.9997。

回收率和精密度

分别在小麦粉、酶式面粉处理剂、盐式面粉处理剂中添加1.0、5.0、10.0 mg/kg三个浓度水平的TMT标准溶液，每个浓度水平重复测定6次，按照1.3.2所述前处理方法进行提取净化，最后经HPLC测定，回收率及精密度的数据如表2所示，平均回收率在90.3%~105.1%之间，相对标准偏差均小于3.62%。

表2 小麦粉及面粉处理剂中TMT的回收率及精密度（n=6）

Table 2 Recoveries and RSD of TMT in wheat flour and flour treatmentagents (n = 6)

2.4实际样品测定

应用本方法对市售的小麦粉及面粉处理剂等40 批次样品进行分析，TMT检测结果为：小麦粉有3批次样品检出，含量最高达14.9 mg/kg，面粉处理剂均未检出。

表3 不同小麦粉及其处理剂中TMT的检出情况

Table 3 The sample of wheat flour and flour treatment agents

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品前处理：称取均匀样品于聚丙烯具塞离心管中，加入提取液乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液，涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，提取液过PTFE滤膜，得预处理样品；

（2）标准溶液的配制：准确称取10 mgTMT标准物质，用甲醇溶于10mL棕色容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，0℃-4℃避光保存，移取标准储备液用乙腈-甲酸/甲酸铵溶液稀释，得到标准工作液，0℃-4℃避光保存；

（3）测定：试样用高效液相色谱进行检测分析计算。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，其特征在于，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5-3，浓度为10-500 mmol/L。

3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，其特征在于，所述的甲酸/甲酸铵缓冲溶液的pH为2.5，浓度为100 mmol/L。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，其特征在于，所述的提取液的加入量为：1 g样品中的加入20mL乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液，乙腈与甲酸/甲酸铵缓冲溶液的体积比8:2。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐的方法，其特征在于，高效液相色谱条件：

色谱柱：Atlantis T3 250 mm×4.6 mm, 5 µm；流动相: 甲醇(A) 和10 mmol/L 醋酸铵缓冲溶液（pH4.0）(B)；梯度洗脱程序: 0~9.0 min: 30%保持；9.0~10: 30%~90%；10.0~15.0 min: 90%保持；15.0~16.0min: 90%~30%；16.0~25 min: 30%保持；检测波长：296 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：10 µL。

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