CN116754663A - 药物中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测方法。该检测方法包括如下步骤：通过高效液相色谱法检测供试品溶液，根据外标法或标准曲线法计算含量即可；其中，供试品溶液为含有待测药物的溶液；高效液相色谱法中，流动相A为磷酸‑水，流动相B为磷酸‑乙腈；流动相A和流动相B中磷酸含量独立地为0.01～0.1％，％指磷酸占水或乙腈的体积比。本发明的检测方法灵敏度高、分离度好、专属性强，能够有效、快捷地检测苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄，且具有良好的重复性，易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测方法。
背景技术
苯甲酸苄酯是秘鲁香胶内的一种成分，存在于多种植物中，在体内迅速水解成苯甲酸和苯甲醇，苯甲醇进一步代谢成马尿酸，通过尿液排泄。
苯甲酸苄酯制备工艺一般为以下3种：
1)苯甲酸与苯甲醇直接酯化：
2)苯甲酸甲酯与苯甲醇进行酯交换：
3)氯化苄与苯甲酸钠酯化：
其中路线3)为工业上常用的合成路线，在原料来源、物料成本、反应转化率、反应条件及设备要求等方面，均具有明显优势。然而，该合成路线可能有氯化苄的残留，氯化苄进一步水解为杂质苯甲酸、苯甲醛和苯甲醇。根据EMEA中《遗传毒性杂质限度指导原则》，氯化苄为基因毒性杂质，其能直接或间接作用于DNA，从而引起基因突变。苯甲酸苄酯已收载于FDA“上市药品非活性成分数据库”，口服给药：最大剂量5.6mg；肌肉注射：最大剂量371mg。以TTC(毒理学关注阈值)为1.5μg/天进行评估，要求苯甲酸苄酯中任一单一基因毒性杂质限度为50ppm。氯化苄为2A类致癌物、1类基因毒性杂质，ICH M7附录中以该化合物举例计算其可接受摄入量AI值为40.6μg/天。该浓度限度极低，且基因毒性杂质反应活性高、稳定性差，极易水解为苯甲醇、进一步氧化为苯甲酸和苯甲醛。因此药物中此类痕量杂质的分析极具挑战性，要求分析方法具有较高的灵敏度和专属性。
氯化物(如氯化苄)的测定通常采用中国药典2020版通则0801氯化物测定法，限度控制为氯化物不得超过0.035％；苯甲醛和苯甲酸的测定采用国外药典中醛含量和酸含量等检测项目，如采用特征理化反应，利用醛的还原性，在USP中醛的测定原理可以为醛与盐酸羟胺反应成肟，用氢氧化钠滴定液滴定；酸的测定可以基于酸碱中和原理。换算后限度控制以苯甲酸计不得超过0.07％、以苯甲醛计不得超过0.05％、氯化苄不得超过0.035％。然而，上述方法均缺乏专属性，判断受主观因素影响，且属于限度检测法，无法定量各杂质含量，例如：氯化物测定以是否产生沉淀为判断依据；醛含量测定以颜色从黄色变成浅绿色为判断依据，且存在黄绿色等中间色干扰；酸含量测定通过消耗氢氧化钠滴定液体积计算。
苯甲酸、苯甲醛和氯化苄均含有苯环特征官能团，均有紫外吸收，如USP药典中苯扎氯铵即用液相色谱法对苯甲醛和氯化苄的液相色谱法。该方法采用梯度洗脱方式，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐Symmetry C18柱或YMC ODS-Hypersil柱，5μm，4.6mm*25cm)，以钠盐溶液(1-己烷磺酸钠1.09g与磷酸二氢钠6.9g加水稀释至1000mL，摇匀，用磷酸调节pH至3.5)为流动相A，甲醇为流动相B；柱温为40℃；流速为1.0mL/min。按下表进行梯度洗脱，苯甲醇及氯化苄的检测波长为210nm，苯甲醛的检测波长为257nm。
上述方法操作较为复杂，采用离子对试剂为流动相A，且检测时间长达65min，苯甲醛出峰在梯度洗脱波峰上，苯甲醇和氯化苄检测波长为210nm，受离子对影响，基线不稳。
因此，需要设计一种高效检测苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测分析方法。
发明内容
本发明实际所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏高效检测苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的定量分析方法的缺陷，提供了一种药物中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测方法。本发明的检测方法灵敏度高、分离度好、专属性强，能够有效、快捷地检测苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄，且具有良好的重复性，易于推广。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
在对苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄进行检测时，由于苯甲酸极性大且易电离，出现分子形式与离子形式共存，使得苯甲酸和苯甲醇出峰接近，不易分离，甚至难以分离基线。发明人创造性地发现，在流动相A和流动相B中加入特定浓度的磷酸，配合其他技术特征，不仅可以有效分离苯甲酸和苯甲醇，还能够同时有效分析苯甲醛和氯化苄。
本发明提供了一种药物中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测方法，其包括如下步骤：通过高效液相色谱法检测供试品溶液，根据外标法或标准曲线法计算含量即可；
其中，所述供试品溶液为含有待测药物的溶液；
所述高效液相色谱法中，流动相A为磷酸-水，流动相B为磷酸-乙腈；所述流动相A和所述流动相B中磷酸含量独立地为0.01～0.1％，％指磷酸占水或乙腈的体积比。
本发明中，所述高效液相色谱法中，若采用盐类试剂(如磷酸盐或乙酸铵)代替流动相A或流动相B中的磷酸，或将流动相B改为其他有机试剂(如甲醇)，会导致出峰太晚、产生基线噪声、干扰检测等问题。同时，若磷酸含量太低，则苯甲酸出峰峰形异常，若磷酸含量过高，将影响色谱柱寿命。
本发明中，所述高效液相色谱法中，所述流动相A中磷酸含量优选为0.02～0.1％，例如0.05％。
本发明中，所述高效液相色谱法中，所述流动相B中磷酸含量优选为0.02～0.1％，例如0.05％。
本发明中，所述高效液相色谱法中，优选地，采用梯度洗脱方式，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 90～50 | 10～50 |
| 15 | 50～10 | 50～90 |
| 30 | 50～90 | 50～10 |
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比。
上表中的梯度洗脱程序如下：初始状态流动相A的体积百分比为90～50％，流动相B的体积百分比为10～50％；在0～15min的时间段内，流动相A的体积百分比由90～50％线性降低至50～10％，流动相B的体积百分比由10～50％线性上升至50～90％；在15～30min的时间段内，流动相A的体积百分比由50～10％线性上升至50～90％，流动相B的体积百分比由50～90％线性降低至50～10％。所述流动相A和所述流动相B的体积百分比以所述流动相总体积为基准。
更优选地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 80～60 | 20～40 |
| 15 | 40～20 | 60～80 |
| 30 | 60～80 | 40～20 |
上表中的梯度洗脱程序如下：初始状态流动相A的体积百分比为80～60％，流动相B的体积百分比为20～40％；在0～15min的时间段内，流动相A的体积百分比由80～60％线性降低至40～20％，流动相B的体积百分比由20～40％线性上升至60～80％；在15～30min的时间段内，流动相A的体积百分比由40～20％线性上升至60～80％，流动相B的体积百分比由60～80％线性降低至40～20％。所述流动相A和所述流动相B的体积百分比以所述流动相总体积为基准。
进一步优选地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
| 时间/min | 流动相A/％ | 流动相B/％ |
| 0 | 70 | 30 |
| 15 | 30 | 70 |
| 30 | 70 | 30 |
上表中的梯度洗脱程序如下：初始状态流动相A的体积百分比为70％，流动相B的体积百分比为30％；在0～15min的时间段内，流动相A的体积百分比由70％线性降低至30％，流动相B的体积百分比由30％线性上升至70％；在15～30min的时间段内，流动相A的体积百分比由30％线性上升至70％，流动相B的体积百分比由70％线性降低至30％。所述流动相A和所述流动相B的体积百分比以所述流动相总体积为基准。
本发明中，所述高效液相色谱法中，进样量可为5～20μL，例如20μL。
本发明中，所述高效液相色谱法中，流速可为0.8～1.2mL/min，例如1.0mL/min。
本发明中，所述高效液相色谱法中，柱温可为25～35℃，例如30℃。
本发明中，所述高效液相色谱法中，检测波长可为220～257nm，例如220nm、225nm、238nm、254nm或257nm。
本发明中，所述高效液相色谱法中，色谱柱中填充剂的种类可为十八烷基键合硅胶。
本发明中，所述高效液相色谱法中，色谱柱中填充剂的颗粒度可为本领域常规，优选为3～5μm，例如5μm。
本发明中，所述高效液相色谱法中，色谱柱柱长可为本领域常规，优选为15～25cm，例如25cm。
本发明中，所述高效液相色谱法中，色谱柱内径可为本领域常规，优选为3～6mm，例如4.6mm。
本发明中，所述高效液相色谱法中，色谱柱可购自安捷伦公司或菲罗门公司。
本发明中，所述待测药物可为本领域常规的以氯化苄为原料制得的药物，例如苯甲酸苄酯、苯甲酸钠或苯扎氯铵。
本发明中，所述供试品溶液的制备方法可为本领域常规，优选地，将所述待测药物溶解于稀释剂中制得。其中，所述稀释剂可为磷酸-水-乙腈。
所述稀释剂中磷酸、水和乙腈的配比可根据药物溶解性进行调整。所述磷酸和水的体积比优选为0.05:1。所述水和乙腈的体积比优选为1:(1～10)，例如1:1。
本发明中，所述供试品溶液的浓度可为1～5mg/mL，例如1mg/mL、2mg/mL或5mg/mL。若供试品溶液的浓度过高，则对色谱柱有较高要求，易出现过载和色谱峰分叉的问题；同时，当药物为苯甲酸苄酯时，由于苯甲酸苄酯不溶于水，而稀释剂中含水，易产生溶剂效应，不利于高浓度的苯甲酸苄酯的溶解性，苯甲酸苄酯易析出。若供试品溶液的浓度过低，易造成在同一波长上实现物质分析的响应较低，使得待测药物无响应检测不出。
本发明中，所述外标法公式为：Cx＝Cr*Ax/Ar，Cx为供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇或氯化苄的浓度(mg/mL)；Cr为混合对照品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇或氯化苄的浓度(mg/mL)；Ax为供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇或氯化苄的峰面积；Ar为混合对照品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇或氯化苄的峰面积。
优选地，采用外标法进行计算时，供试品溶液中待测杂质与混合对照品溶液中的待测杂质是一一对应的。例如，当待测杂质为苯甲酸时，Cx为供试品溶液中的苯甲酸的浓度(mg/mL)，Cr为混合对照品溶液中苯甲酸的浓度(mg/mL)；Ax为供试品溶液中苯甲酸的峰面积；Ar为混合对照品溶液中苯甲酸的峰面积。
其中，所述混合对照品溶液可通过本领域常规方法制得，优选地，将苯甲酸对照品、苯甲醛对照品、苯甲醇对照品和氯化苄对照品分别稀释为特定浓度的苯甲酸储备溶液、苯甲醛储备溶液、苯甲醇储备溶液和氯化苄储备溶液，将其混合并稀释即可。
所述稀释操作可采用制备供试品溶液的稀释剂。
所述特定浓度优选为2～4mg/mL。
所述混合对照品溶液中，苯甲酸的浓度可为2ng/mL～2μg/mL，例如1μg/mL。
所述混合对照品溶液中，苯甲醛的浓度可为2ng/mL～2μg/mL，例如1μg/mL。
所述混合对照品溶液中，苯甲醇的浓度可为2～20μg/mL，例如10μg/mL。
所述混合对照品溶液中，氯化苄的浓度可为2～20μg/mL，例如1μg/mL。
本发明中，较佳地，所述供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度Cx通过下述方法获得：
将所述供试品溶液按所述高效液相色谱法进行检测，得到供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的峰面积Ax；将所述混合对照品溶液按所述高效液相色谱法进行检测，得到混合对照品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的峰面积Ar，所述混合对照品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度Cr是已知的；
根据外标法公式Cx＝Cr*Ax/Ar，分别计算得到供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度Cx。
本发明中，所述标准曲线法可通过下述步骤制得：将浓度为混合对照品溶液50％、80％、100％、120％和150％的溶液进样，进行所述高效液相色谱法检测，根据测得的峰面积和相应溶液的浓度，得到回归方程，获得标准曲线；所述标准曲线中，优选以所述峰面积为纵坐标，相应溶液的浓度为横坐标。
本发明中，优选地，所述标准曲线法中苯甲酸的线性方程为y＝81.559x-0.4419，R2＝0.9995。
本发明中，优选地，所述标准曲线法中苯甲醛的线性方程为y＝105.83x-0.1088，R2＝0.9998。
本发明中，所述苯甲酸的定量限可为2.450ng/mL。
本发明中，所述苯甲醛的定量限可为2.770ng/mL。
本发明中，所述苯甲醇的定量限可为2.489μg/mL。
本发明中，所述氯化苄的定量限可为0.113μg/mL。
本发明中，所述苯甲酸的浓度检测范围可为0.00245～1.4685μg/mL。
本发明中，所述苯甲醛的浓度检测范围可为0.00277～1.6605μg/mL。
本发明中，所述苯甲醇的浓度检测范围可为2.4890～25μg/mL。
本发明中，所述氯化苄的浓度检测范围可为0.1130～2.5μg/mL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明的检测方法可同时检测苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄。该方法专属性强；分离度好；灵敏度高，苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的定量限分别可以实现2.450ng/mL、2.770ng/mL、2.489μg/mL和0.113μg/mL；重复性好，不同实验人员、不同时间运用不同仪器对同批次供试品溶液进行检测，各组分含量的RSD值低于3％；耐用性好；准确度高，苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的加标回收率均在90～110％范围内；线性范围良好。
2、本发明可以在30分钟内实现对苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的定量测定，减少药物副作用，提高产品质量；且操作简便，对色谱柱及仪器要求低，既适用于实验室的检测，更适用于企业大规模生产的产品质量控制，对于产品中控等能较快得到检测结果，易于推广。
附图说明
图1为实施例1检测供试品溶液A的色谱图。其中，1为苯甲酸(6.486min)，2为苯甲醛(8.933min)，3为苯甲酸苄酯(19.823min)。
图2为实施例1检测供试品溶液B的色谱图。其中，1为苯甲醇(5.470min)，2为苯甲酸(6.498min)，3为苯甲醛(8.937min)，4为氯化苄(15.682min)，5为苯甲酸苄酯(19.822min)。
图3为实施例2检测供试品溶液B的色谱图。其中，1为苯甲醇(6.623min)，2为苯甲酸(8.022min)，3为苯甲醛(10.330min)，4为氯化苄(16.717min)，5为苯甲酸苄酯(20.483min)。
图4为对比例1检测供试品溶液B的色谱图。其中，1为苯甲酸(1.682min)，2为苯甲醇(3.201min)；3为苯甲醛(4.896min)，4为氯化苄(9.742min)。
图5为对比例2检测供试品溶液B的色谱图。其中，1为苯甲酸(4.821min)，2为苯甲醇(5.984min)；3为苯甲醛(9.825min)，4为氯化苄(16.742min)。
图6为对比例3的检测色谱图。其中，1为苯甲醇(16.556min)；3为苯甲醛(18.513min)，4为氯化苄(37.840min)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，苯甲酸苄酯购自湖北葛店人福药用辅料有限责任公司。
实施例1
1溶液配制
稀释剂：磷酸-水-乙腈(0.05:1:1)。
1.1储备溶液配制
取苯甲酸0.025g、苯甲醛0.025g、苯甲醇0.025g和氯化苄0.025g，分别加入100mL容量瓶中，加稀释剂溶解后定容，得到0.25mg/mL苯甲酸储备溶液、0.25mg/mL苯甲醛储备溶液、0.25mg/mL苯甲醇储备溶液和0.25mg/mL氯化苄储备溶液。
1.2混合对照品溶液配制
具体地，取“1.1”项制得的0.4mL苯甲酸储备溶液和0.4mL苯甲醛储备溶液，加入100mL容量瓶，用稀释剂稀释定容至刻度，得到1μg/mL苯甲酸和1μg/mL苯甲醛的混合对照品溶液A。
取“1.1”项制得的储备溶液各2mL，于100mL容量瓶中，得到浓度为5μg/mL的混合对照品溶液B。
1.3供试品溶液配制
供试品溶液A：取苯甲酸苄酯约0.1g于50mL容量瓶中，用稀释剂稀释定容至刻度，得到2mg/mL的供试品溶液A。
供试品溶液B：取“1.1”项制得的储备溶液各2mL，于100mL容量瓶中，在该容量瓶中加入苯甲酸苄酯100mg，用稀释剂定容至刻度，得到供试品溶液B，其中，苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸和氯化苄的浓度均为5μg/mL，苯甲酸苄酯的浓度为1mg/mL。
2.高效液相色谱条件
色谱柱：C18柱(安捷伦XDB)，25cm*4.6mm*5μm；
流动相A：0.05％磷酸-水；流动相B：0.05％磷酸-乙腈。
进样条件
流动相梯度
| 时间/min | 0.05％磷酸-水/％ | 0.05％磷酸-乙腈/％ |
| 0 | 70 | 30 |
| 15 | 30 | 70 |
| 30 | 70 | 30 |
3.检测结果
取“1.3”项制得的供试品溶液A按上述条件进样检测，由于本实施例选用的苯甲酸苄酯纯度较高，供试品溶液A的检测图谱中仅出现了苯甲酸和苯甲醛的峰(如图1所示)。考虑到随着苯甲酸苄酯样品存储的延长，杂质苯甲醇和氯化苄可能会出现，因此本实施例通过加标方式制备供试品溶液B，模拟苯甲酸苄酯、苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄同时存在的情况。
取“1.2”项制得的混合对照品溶液B和供试品溶液B按上述条件进样检测，根据所得峰面积，以外标法计算苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度，再根据“药物的浓度/供试品溶液B中苯甲酸苄酯的浓度”，计算得到苯甲酸和苯甲醛的含量，结果如图2和下表1、2所示。
表1
表2
| 供试品溶液B | 苯甲酸 | 苯甲醛 | 苯甲醇 | 氯化苄 |
| 峰面积 | 382.04 | 796.93 | 3.74 | 33.25 |
| 浓度/μg/mL | 5.7114 | 5.3106 | 4.9934 | 4.6488 |
| 含量/％ | 0.57％ | 0.53％ | 0.50％ | 0.50％ |
由上表可知，供试品溶液B中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度分别为5.7114μg/mL、5.3106μg/mL、4.9934μg/mL和4.6488μg/mL，含量分别为0.57％、0.53％、0.50％和0.50％。
实施例2
在实施例1的基础上，仅将流动相梯度洗脱程度修改如下，其他条件不变，将供试品溶液B进样检测。
流动相梯度
| 时间/min | 0.05％磷酸-水/％ | 0.05％磷酸-乙腈/％ |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 10 | 90 |
| 30 | 90 | 10 |
结果显示(如图3所示)，苯甲醇在6.623min出峰，相比实施例1，苯甲酸苄酯出峰时间较晚，在20.483min时出峰，5种物质的峰能够在30min内实现基线分离。
对比例1
将实施例1中流动相A和流动相B的磷酸均改为0.02mmol/L乙酸铵，其他条件不变。
根据图4可知，在乙酸铵的条件下，苯甲酸出峰时间1.6min，出峰时间过早，且由于乙酸铵的紫外截止波长高，造成基线漂移，在2min前后出现较多杂峰，基线不稳。
对比例2
将实施例1中流动相A改为水、流动相B改为乙腈，其他条件不变。
根据图5可知，当流动相中无磷酸时，苯甲酸出峰形态不统一，峰形较差。
对比例3
采用背景技术中USP药典中苯扎氯铵的检测方法对苯甲醇、苯甲醛和氯化苄进行检测。
根据图6可知，该方法检测时间长达65min，且检测结果中基线不稳。
效果实施例1方法学考察
(1)专属性检测
将“1.3”项制得的供试品溶液B，按照“2”项下的高效液相色谱条件依次进样检测，检测结果见表3。
表3专属性检测结果
结果显示：苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄相互之间的分离度均大于1.5，可以实现较好的基线分离，由此可知，本发明的检测方法专属性良好。
(2)定量限考察
配制定量限溶液：将“1.1”项制得的苯甲酸储备溶液、苯甲醛储备溶液、苯甲醇储备溶液和氯化苄储备溶液依次逐级稀释后进行液相检测，将信噪比约10时的溶液作为定量限溶液。
分别取三份苯甲酸定量限溶液、苯甲醛定量限溶液、苯甲醇定量限溶液和氯化苄定量限溶液，按照“2”项下的高效液相色谱条件依次进样检测，检测结果见表4。
表4定量限检测结果
结果显示：苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的定量限分别为2.450ng/mL、2.770ng/mL、2.489μg/mL和0.113μg/mL，本发明的检测方法的灵敏度高。
(3)重复性考察
取2份“1.2”项制得的混合对照品溶液A和6份“1.3”项制得的供试品溶液A，分别按照“2”项下的高效液相色谱条件依次进样检测，记录色谱图，根据表5，以外标法计算供试品溶液A中苯甲酸和苯甲醛的浓度，再根据“药物的浓度/供试品溶液A的浓度”，计算得到苯甲酸和苯甲醛的含量。
检测结果见表6。
表5混合对照品溶液A峰面积及浓度
表6重复性检测结果
注：表格中“SD”是指平均偏差，“SD”是指相对标准偏差。
结果显示：苯甲酸平均含量为0.058％，RSD为1.3％；苯甲醛平均含量为0.037％，RSD为1.3％。由此可以表明，本发明的检测方法的重复性良好。
(4)耐用性考察
取10份“1.3”项制得的供试品溶液A，分为五组，每组在“2”项下的高效液相色谱条件下进行如下修改：降低流速、提高流速、降低柱温、升高柱温，每组平行进样2次，记录色谱图，根据表5，以外标法计算供试品溶液A中苯甲酸和苯甲醛的浓度，再根据“药物的浓度/供试品溶液A的浓度”，计算得到苯甲酸和苯甲醛的含量。
检测结果见表7。
表7耐用性检测结果
注：表格中“SD”是指平均偏差，“SD”是指相对标准偏差。
结果显示：苯甲酸平均含量为0.062％，RSD为3.95％；苯甲醛平均含量为0.033％，RSD为3.04％。由此可以表明，本发明的检测方法的耐用性良好。
(5)准确度考察
在“1.2”项制得的混合对照品溶液A的基础上，配制浓度为50％、100％和150％的加标溶液。以苯甲酸为例，混合对照品溶液A中苯甲酸的浓度为1μg/mL，50％加标溶液浓度约为0.5μg/mL。
取“1.1”项制得的苯甲酸储备溶液0.1mL，于50mL容量瓶中，在该容量瓶中加入苯甲酸苄酯100mg，用稀释剂定容至刻度，得到50％准确度溶液，其中，苯甲酸的浓度均为0.5μg/mL，苯甲酸苄酯的浓度为2mg/mL。同样地，配制苯甲酸100％和150％的加标溶液，以及苯甲醛50％、100％和150％的加标溶液。每组平行配制3份溶液。
按照“2”项下的高效液相色谱条件依次进样检测，记录色谱图，根据表5，以外标法计算苯甲酸和苯甲醛的加标浓度，再根据“加标浓度/50％(100％或150％)/混合对照品溶液A中每种药物的浓度”，计算得到供试品溶液A中苯甲酸和苯甲醛的回收率情况。
检测结果见表8。
表8准确度检测结果
结果显示：苯甲酸和苯甲醛回收率均在90～110％范围内，RSD值均小于3.0％。由此可以表明，本发明的检测方法的准确性良好。
(6)线性范围考察
在“1.2”项制得的混合对照品溶液A的基础上，配制浓度为50％、80％、100％、120％和150％的溶液，以及效果实施例1“(2)定量限考察”中的定量限溶液作为线性溶液。按照“2”项下的高效液相色谱条件依次进样检测，记录色谱图。
检测结果见表9。
表9线性范围检测结果
结果显示：苯甲酸浓度的检测范围为0.00245～1.4685μg/mL，苯甲醛浓度的检测范围为0.00277～1.6605μg/mL，苯甲酸和苯甲醛的线性相关系数(R2)均大于99.95％。由此可以表明，本发明的线性范围良好。
Claims (10)
1.一种药物中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：通过高效液相色谱法检测供试品溶液，根据外标法或标准曲线法计算含量即可；
其中，所述供试品溶液为含有待测药物的溶液；
所述高效液相色谱法中，流动相A为磷酸-水，流动相B为磷酸-乙腈；所述流动相A和所述流动相B中磷酸含量独立地为0.01～0.1％，％指磷酸占水或乙腈的体积比。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，所述流动相A中磷酸含量为0.02～0.1％，例如0.05％；
和/或，所述高效液相色谱法中，所述流动相B中磷酸含量为0.02～0.1％，例如0.05％。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，采用梯度洗脱方式，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比；
优选地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
更优选地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中，进样量为5～20μL，例如20μL；
和/或，所述高效液相色谱法中，流速为0.8～1.2mL/min，例如1.0mL/min；
和/或，所述高效液相色谱法中，柱温为25～35℃，例如30℃；
和/或，所述高效液相色谱法中，检测波长为220～257nm，例如220nm、225nm、238nm、254nm或257nm；
和/或，所述高效液相色谱法中，色谱柱中填充剂的种类为十八烷基键合硅胶；
和/或，所述高效液相色谱法中，色谱柱中填充剂的颗粒度为3～5μm，例如5μm；
和/或，所述高效液相色谱法中，色谱柱柱长为15～25cm，例如25cm；
和/或，所述高效液相色谱法中，色谱柱内径为3～6mm，例如4.6mm。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤：将所述待测药物溶解于稀释剂中制得；其中，所述稀释剂优选为磷酸-水-乙腈；优选地，所述稀释剂中，所述磷酸和水的体积比为0.05:1；所述水和乙腈的体积比为1:(1～10)，例如1:1；
和/或，所述供试品溶液的浓度为1～5mg/mL，例如1mg/mL、2mg/mL或5mg/mL。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述苯甲酸的定量限为2.450ng/mL；
和/或，所述苯甲醛的定量限为2.770ng/mL；
和/或，所述苯甲醇的定量限为2.489μg/mL；
和/或，所述氯化苄的定量限为0.113μg/mL。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述苯甲酸的浓度检测范围为0.00245～1.4685μg/mL
和/或，所述苯甲醛的浓度检测范围为0.00277～1.6605μg/mL；
和/或，所述苯甲醇的浓度检测范围为2.4890～25μg/mL；
和/或，所述氯化苄的浓度检测范围为0.1130～2.5μg/mL。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外标法中，混合对照品溶液通过以下步骤制得：将苯甲酸对照品、苯甲醛对照品、苯甲醇对照品和氯化苄对照品分别稀释为特定浓度的苯甲酸储备溶液、苯甲醛储备溶液、苯甲醇储备溶液和氯化苄储备溶液，将其混合并稀释即可；
优选地，所述特定浓度为2～4mg/mL；
和/或，所述外标法中，混合对照品溶液中苯甲酸的浓度为2ng/mL～2μg/mL，例如1μg/mL；
和/或，混合对照品溶液中苯甲醛的浓度为2ng/mL～2μg/mL，例如1μg/mL；
和/或，混合对照品溶液中苯甲醇的浓度为2～20μg/mL，例如10μg/mL；
和/或，混合对照品溶液中氯化苄的浓度为2～20μg/mL，例如1μg/mL。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度Cx通过下述方法获得：
将所述供试品溶液按所述高效液相色谱法进行检测，得到供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的峰面积Ax；将混合对照品溶液按所述高效液相色谱法进行检测，得到混合对照品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的峰面积Ar，混合对照品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度Cr是已知的；
根据外标法公式Cx＝Cr*Ax/Ar，分别计算得到供试品溶液中苯甲酸、苯甲醛、苯甲醇和氯化苄的浓度Cx。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线法通过下述步骤制得：将浓度为混合对照品溶液50％、80％、100％、120％和150％的溶液进样，进行所述高效液相色谱法检测，根据测得的峰面积和相应溶液的浓度，得到回归方程，获得标准曲线；所述标准曲线中，优选以所述峰面积为纵坐标，相应溶液的浓度为横坐标；
优选地，所述标准曲线法中苯甲酸的线性方程为y＝81.559x-0.4419，R2＝0.9995；
优选地，所述标准曲线法中苯甲醛的线性方程为y＝105.83x-0.1088，R2＝0.9998。
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