CN116254103B - 纳米荧光标记微球、pgⅰ/pgⅱ单克隆抗体探针以及pgⅰ/pgⅱ检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医药领域，具体公开了一种纳米荧光标记微球、PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针以及PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒。纳米荧光标记微球为由羧基修饰的铕铽配合物，所述纳米荧光标记微球的直径为0.2μm；PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针由PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体负载在上述纳米荧光标记微球而得；PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒包括包被有上述PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针的PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡。本申请的纳米荧光标记微球具有较高的荧光强度和较强的荧光寿命，且与抗体的交联物具有较高的结构稳定性，有利于提高PGⅠ/PGⅡ结合的稳定性，有效提高了PGⅠ/PGⅡ检测产品的稳定性。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，更具体地说，它涉及一种纳米荧光标记微球、PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针以及PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒。
背景技术
胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，根据其生化性质和免疫原性将其分成2个亚群，分别为由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌的胃蛋白酶原Ⅰ，以及除由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌外，也可由贲门腺、胃窦的幽门腺的黏液颈细胞和十二指肠上段产生的胃蛋白酶原Ⅱ。血清胃蛋白酶原水平反映了不同部位胃粘膜的形态和功能。其中，PGⅠ是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PGⅠ升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGⅠ降低；PGⅡ与胃底粘膜病变的相关性较大，其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PGⅠ/PGⅡ比值和PGⅠ水平对于诊断慢性萎缩性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病有很高的价值。
目前，胃蛋白酶原的检测方法较多，有酶联免疫吸附法、化学发光法、时间分辨荧光免疫分析法、乳胶增强免疫比浊法等。在很长一段时间内，针对PGⅠ/PGⅡ检测产品或方法的研究以提高检测灵敏度为主，如公开号为CN110596393A，公开日为2019年12月20日的中国发明专利公开了一种胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的联合检测方法，其检测胃蛋白酶Ⅰ抗原的灵敏度为0.5ng/mL，线性范围为0～500ng/mL，相关系数R2为0.991；检测胃蛋白酶Ⅱ抗原的灵敏度为0.5ng/mL，线性范围为0～500ng/mL，相关系数R2为0.9881。再如公开号为CN107132359A，公开日为2017年9月5日的中国发明专利公开了一种胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ检测方法及其试剂盒，其检测胃蛋白酶Ⅰ抗原的灵敏度为0.5ng/mL，线性范围为0～500ng/mL，相关系数R2为0.9994；检测胃蛋白酶Ⅱ抗原的灵敏度为0.5ng/mL，线性范围为0～500ng/mL，相关系数R2为0.9983。
随着研究的不断深入，发明人发现仅以提高灵敏度为研究方向已不能很好满足发展的需要，如何在保证较高灵敏度的前提下，提高PGⅠ/PGⅡ检测产品的稳定性，或者说重复性，是目前亟待解决的另一大问题。
发明内容
为了在保证较高灵敏度的前提下，提高PGⅠ/PGⅡ检测产品的稳定性，有效降低PGⅠ/PGⅡ检测产品检测的变异系数，本申请提供一种纳米荧光标记微球、PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针以及PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒。
近年来，由于稀土元素离子具有特别的电子层结构和丰富的能级数量，使它成为了一个巨大的发光材料宝库，其价值和应用日益受到广泛的关注。稀土配合物发光材料具有发光谱带窄、色纯度高、Stokes位移大、荧光寿命长、物理和化学性质稳定等优良特性，使得稀土配合物在生物医药领域，尤其是作为药物载体得以广泛应用。基于此，发明人在经过大量的分析、试验之后，研究出了一种具有较好稳定性的纳米荧光标记微球，并在此基础上制备出了可应用于检测待测样液PGⅠ/PGⅡ水平的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针以及PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒。
本申请的主要构思为：以稀土铕离子和稀土铽离子为原料制备掺杂稀土配合物，利用稀土配合物荧光强度高、荧光寿命长、Stokes位移大、发光峰尖锐、激发所需能量低等优点，并使用含羧基基团的配合物对稀土配合物进行表面功能化修饰，提高纳米荧光标记微球与抗体的交联物的结构稳定性，进而提高对PGⅠ/PGⅡ结合的稳定性。通过在纳米荧光标记微球表面负载PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体而得到PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针，该探针相较于相关技术中的探针，具有相当的检测灵敏度，同时具有更好的稳定性，检测结果的CV较小。以下从多个方面做出更为详细的阐述。
第一方面，本申请提供一种纳米荧光标记微球，采用如下的技术方案：
一种纳米荧光标记微球，所述纳米荧光标记微球为由羧基修饰的铕铽配合物，所述纳米荧光标记微球的直径为0.2μm；
所述纳米荧光标记微球的制备方法包括如下步骤：
(一)稀土混合溶液的制备：将氧化铕与氧化铽按Eu3+与Tb3+的摩尔比为(20～500):1混合后，溶于质量浓度为0.5％的盐酸中，加热除去多余盐酸，在加热搅拌回流的条件下溶解于乙醇中，得到稀土混合溶液；
(二)配体A溶液的制备：在加热搅拌回流的条件下将配体A溶于乙醇中，得到配体A溶液；
其中，配体A为氟化物、复合氧化物、碳酸盐、钛酸盐、草酸盐和钒酸盐中的一种或多种；
配体A的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:(3～4)；
(三)表面功能化修饰：在不断搅拌的条件下将步骤(一)得到的稀土混合溶液和步骤(二)得到的配体A溶液混合，并在惰性气体保护氛围下加热至140～150℃，保温搅拌1～1.5h后，以3～5℃/min的升温速率升温至220～230℃，保温搅拌2～4h后，冷却至100～120℃，加入配体B，再次加热至220～230℃保温搅拌6～8h，自然冷却，在10000～20000rpm转速下离心8～10min，依次用乙醇和去离子水洗涤沉淀，再次重复离心和洗涤过程2～3次，真空干燥，即得；
其中，配体B为至少含有一个羧基的有机物；
配体B的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:(105～110)。
通过采用上述技术方案，本申请将稀土铕离子和稀土铽离子混合后，再与氟化物等配体聚合形成稀土离子配合物，在同一配体不同键位掺杂了铕和铽两种稀土离子，通过稀土离子的共激发以及稀土离子之间的敏化作用，进一步提高了稀土配合物的各项性能，有利于提高配体的荧光强度，延长荧光寿命，还有利于提高荧光标记微球与抗体交联的稳定性。进一步的，通过对上述步骤所得的稀土配合物进行表面功能性修饰，接枝羧基基团，进一步提高了纳米荧光标记微球与抗体的交联物的结构稳定性，进而提高对PGⅠ/PGⅡ结合的稳定性，应用于PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒中，有效降低了检测结果的CV值，提高了PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测的稳定性。
发明人在实现本申请的过程中，评估了标准直径≈0.1μm、≈0.2μm、≈0.3μm三种不同粒径的纳米荧光标记微球。从测试结果上看，标准直径≈0.3μm的纳米荧光标记微球单个亮度高，灵敏度高，但粒径大导致纳米荧光标记微球在结合垫上分布不均，最终测试结果CV值较大；标准直径≈0.1μm的微球粒径小，比表面积大，有效基团数量多，耦联载量高，但单个微球的重量较轻，离心后损耗较大。因此，发明人在灵敏度、耦联载量、生产得率上寻求平衡，最终选择了标准直径≈0.2μm的纳米荧光标记微球。
通过对稀土铕离子和稀土铽离子掺杂比例的控制，并通过对配合物A和配合物B种类及使用量的控制，进一步提高了纳米荧光标记微球的荧光强度，延长了荧光寿命，并且提高了纳米荧光标记微球的与抗体的交联物的结构稳定性，提高了PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针与PGⅠ/PGⅡ结合的稳定性，应用于PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒中，有效降低了试剂盒检测结果的CV值，提高了PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测的稳定性。
可选的，步骤(一)中，氧化铕与氧化铽按Eu3+与Tb3+的摩尔比为100:1混合。
可选的，步骤(二)中，配体A的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:4。
可选的，步骤(三)中，配体B的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:108。
通过采用上述技术方案，对氧化铕与氧化铽中Eu3+与Tb3+摩尔比、配体A与Eu3+与Tb3+总摩尔数的摩尔比，以及配体B与Eu3+与Tb3+总摩尔数的摩尔比进一步优化，所得的纳米荧光标记微球最终应用于PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒中，以PGⅠ和PGⅡ抗原作为待测样品，PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测PGⅠ和PGⅡ的灵敏度均可达0.5ng/mL。其中，荧光强度比值T1/C与PGⅠ浓度的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0306x+0.0329，R2＝0.9995，线性范围为0～500ng/mL，当PGⅠ浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL时，重复检测10次的CV值均低于3.9％；荧光强度比值T2/C与PGⅡ浓度的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0359x+0.1461，R2＝0.9912，线性范围为0～500ng/mL，当PGⅡ浓度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL时，重复检测10次的CV值均低于5.5％。由此表明了，氧化铕与氧化铽按上述比例混合制得的纳米荧光标记微球应用于PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，可在保证试剂盒高灵敏度的前提下，提高试剂盒检测的稳定性。
第二方面，本申请提供一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针，采用如下的技术方案：一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针，由PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体负载在上述纳米荧光标记微球而得。
通过采用上述技术方案，得到的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针具有较高的检测灵敏度，同时具有较好的稳定性，应用于PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒中，检测结果的CV值较低，有效提高了PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测的稳定性。
第三方面，本申请提供一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针的制备方法，采用如下的技术方案：
一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针的制备方法，包括如下步骤：
S1，将上述纳米荧光标记微球与活化缓冲液混匀，离心获得微球沉淀a；
S2，用耦联缓冲液将微球沉淀a超声复悬，得到微球溶液a；
S3，向微球溶液a中加入NHS和EDC，混合反应0.8～1.2h后，离心获得微球沉淀b；
S4，用耦联缓冲液将微球沉淀b超声复悬，得到微球溶液b；
S5，向微球溶液b中加入PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体，混匀反应2.8～3.2h，离心获得微球沉淀c；
S6，用封闭缓冲液将微球沉淀c超声复悬，即得。
可选的，步骤S3中，NHS的加入量为0.2～1mg/mL微球溶液a；EDC的加入量为0.04～0.2mg/mL微球溶液a。
可选的，步骤S5中，PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体的加入量为1～5mg/mL微球溶液b。
可选的，活化缓冲液为PB缓冲液、Borax缓冲液和MES缓冲液中的任意一种，活化缓冲液的pH＝5.8～7.2；
可选的，耦联缓冲液为PB缓冲液、Borax缓冲液和MES缓冲液中的任意一种，耦联缓冲液的pH＝7.2～8.5；
可选的，封闭缓冲液为含有BSA、Glycine、Casein、Fish skin gelatin、JeffamineD-2000、PEG 2000中的一种或几种的封闭缓冲液。
通过采用上述技术方案，在将PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体负载到纳米荧光标记微球的过程中，同时使用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)作为耦联剂，利用EDC/NHS的共价耦联提高微球与抗体的交联物的结构稳定性，该耦联过程需要羧基基团参与，具体过程为，EDC首先与纳米荧光标记微球上的羧基耦合形成一个O-异酰基脲结构，这一活化中间物与抗体上的-NH2基团形成酰胺交联，再利用NHS形成更稳定的酯而增强EDC交联产物的稳定性。过程中，由于EDC和NHS本身并没有成为实际交联的一部分，而是转变成水溶性的脲衍生物，因此可以消除并被清洗掉。最后使用封闭缓冲液对标记好的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体-纳米荧光标记微球复合物进行封闭和储存，得到PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针。由上述步骤得到的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针具有较高的检测灵敏度和稳定性，检测结果的CV值较低。
第四方面，本申请提供一种PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，包括PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡，所述PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡包被有上述PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针。
本申请的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测PGⅠ抗原的灵敏度可达0.5ng/mL，线性范围0～500ng/mL，相关系数R2＞0.999，CV＜4.5％；检测PGⅡ抗原的灵敏度可达0.5ng/mL，线性范围0～500ng/mL，相关系数R2＞0.99，CV＜6.0％。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请采用稀土铕和稀土铽离子掺杂制备铕铽配合物，利用铕、铽离子之间的共激发和敏化作用，提高了稀土配合物的各项发光性能及与抗体交联的稳定性，然后通过对铕铽配合物表面进行功能化修饰，进一步提高了纳米荧光标记微球与抗体的交联物的结构稳定性，将该纳米荧光标记微球应用于检测试剂盒中，使检测试剂盒在具有较高检测灵敏度的同时，还具有较好的稳定性；
2、本申请通过对稀土铕离子和稀土铽离子掺杂比例的控制，进一步提高了纳米荧光标记微球的荧光强度，延长了荧光寿命，提高了纳米荧光标记微球与抗体结合的稳定性；
3、本申请通过对配合物A和配合物B种类及使用量的控制，提高了纳米荧光标记微球的与抗体的交联物的结构稳定性，使PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针与PGⅠ/PGⅡ抗原稳定结合，进而提高了PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测的稳定性；
4、本申请的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针具有较高的检测灵敏度和较好的稳定性，应用于PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒中，检测结果的CV值较低，有效提高了PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测的稳定性。
附图说明
图1是本申请实施例3a中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图2是本申请实施例3b中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图3是本申请实施例3c中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图4是本申请实施例3d中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图5是本申请实施例3e中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图6是本申请实施例3f中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图7是本申请对比例3a中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线；
图8是本申请对比例3b中荧光强度比值与PGⅠ/PGⅡ抗原浓度的标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请的各实施例中所用的原料，除下述特殊说明之外，其他均为市售：PGⅠ单克隆抗体采自昆明云大单抗中心，编号P1-12；
PGⅡ单克隆抗体采自昆明云大单抗中心，编号P2-14；
羊抗鼠IgG抗体采自上海羽朵生物科技有限公司，编号LY252，货号LY252-1mg；
PGⅠ抗原采自上海羽朵生物科技有限公司，编号HF538，货号HF538-100T；
PGⅡ抗原采自上海羽朵生物科技有限公司，编号HF539，货号HF539-100T。
实施例1：制备纳米荧光标记微球
实施例1a
一种纳米荧光标记微球，为由羧基修饰的铕铽配合物，其制备方法如下：
(一)稀土混合溶液的制备：将35.2g(1mol)氧化铕与1.83g(0.05mol)氧化铽混合后，溶于800mL质量浓度为0.5％的盐酸中，加热至40℃除去多余盐酸，随后在80℃加热搅拌回流的条件下溶解于500mL乙醇中，得到稀土混合溶液；
(二)配体A溶液的制备：在80℃加热搅拌回流的条件下将14.7g(0.35mol)配体A溶于500mL乙醇中，得到配体A溶液；
本实施例中，配体A为氟化钠，该选择并不是对本申请的限制，在实际实现本申请的过程中，配体A可选为氟化物、复合氧化物、碳酸盐、钛酸盐、草酸盐和钒酸盐中的一种或多种，在使用其他配体实现本申请时，需要根据摩尔比相应的改变配体加入的质量；
(三)表面功能化修饰：在不断搅拌的条件下将步骤(一)得到的稀土混合溶液和步骤(二)得到的配体A溶液混合，并在惰性气体(本实施例中使用氩气)保护氛围下加热至145℃，保温搅拌1.5h后，以4℃/min的升温速率升温至225℃，保温搅拌3h后，冷却至110℃，加入1.76g(0.01mol)配体B，再次加热至225℃保温搅拌6h，自然冷却，在15000rpm转速下离心8min，依次用乙醇和去离子水洗涤沉淀，再次重复离心和洗涤过程2次，真空干燥，即得；
本实施例中，配体B为戊二酸二钠盐，该选择并不是对本申请的限制，在实际实现本申请的过程中，配体B可选为至少含有一个羧基的有机物，在使用其他配体实现本申请时，需要根据摩尔比相应的改变配体加入的质量。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
实施例1b
一种纳米荧光标记微球，与实施例1a的不同之处在于：
步骤(一)中，氧化铕的使用量为35.2g(1mol)，氧化铽的使用量为3.66g(0.01mol)。
步骤(二)中，配体A(氟化钠)的使用量为14.154g(0.337mol)。
步骤(三)中，配体B(戊二酸二钠盐)的使用量为1.690g(0.0096mol)。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
实施例1c
一种纳米荧光标记微球，与实施例1a的不同之处在于：
步骤(一)中，氧化铕的使用量为35.2g(1mol)，氧化铽的使用量为0.732g(0.002mol)。
步骤(二)中，配体A(氟化钠)的使用量为14.028g(0.334mol)。
步骤(三)中，配体B(戊二酸二钠盐)的使用量为1.672g(0.0095mol)。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
实施例1d
一种纳米荧光标记微球，与实施例1b的不同之处在于：
步骤(二)中，配体A(氟化钠)的使用量为10.605g(0.2525mol)。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
实施例1e
一种纳米荧光标记微球，与实施例1d的不同之处在于：
步骤(三)中，配体B(戊二酸二钠盐)的使用量为1.637g(0.0093mol)。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
实施例1f
一种纳米荧光标记微球，与实施例1d的不同之处在于：
步骤(三)中，配体B(戊二酸二钠盐)的使用量为1.619g(0.0092mol)。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
对比例1a
一种纳米荧光标记微球，与实施例1a的不同之处在于，为由羧基修饰的铕配合物。
该标记微球的制备方法中，与实施例1a除步骤(一)中使用相同摩尔数的氧化铕代替氧化铽之外，其他步骤均相同。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
对比例1b
一种纳米荧光标记微球，与实施例1a的不同之处在于，其为未经羧基修饰的铕铽配合物。
该标记微球的制备方法中，步骤(一)和步骤(二)与实施例1a完全相同，其制备步骤(三)具体为：在不断搅拌的条件下将步骤(一)得到的稀土混合溶液和步骤(二)得到的配体A溶液混合，并在惰性气体(本实施例中使用氩气)保护氛围下加热至145℃，保温搅拌1.5h后，以4℃/min的升温速率升温至225℃，保温搅拌9h后，自然冷却，在15000rpm转速下离心8min，依次用乙醇和去离子水洗涤沉淀，再次重复离心和洗涤过程2次，真空干燥，即得。
经检测，得到的纳米荧光标记微球的平均直径为0.2μm。
实施例2：制备PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针
实施例2a-2f
一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针，由PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体分别负载在实施例1a-1f制得的纳米荧光标记微球而得，其制备方法如下：
S1，取实施例1a-1f制得的纳米荧光标记微球10g，加入相当于纳米荧光标记微球体积3～9倍(本实施例为5倍)的活化缓冲液(0.01M，pH7.2的PB缓冲液)混匀，10000rpm离心3min获得微球沉淀a；
S2，用相当于微球沉淀a体积3～9倍(本实施例为5倍)的耦联缓冲液(0.01M，pH7.8的PB缓冲液)将微球沉淀a于400w超声复悬30s，得到微球溶液a；
S3，取步骤S2得到的微球溶液a 20mL，加入10mg NHS和2mg EDC，在25℃下混合反应1h后，10000rpm离心3min获得微球沉淀b；
S4，用相当于微球沉淀b体积3～9倍(本实施例为5倍)的耦联缓冲液(0.01M，pH7.8的PB缓冲液)将微球沉淀b于400w超声复悬30s，得到微球溶液b；
S5，取步骤S4得到的微球溶液b 20mL，加入40mg PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体，在25℃下混合反应3h后，10000rpm离心3min获得微球沉淀c；
S6，用相当于微球沉淀c体积2～5倍(本实施例为3倍)的封闭缓冲液(质量浓度为5％的NSA封闭缓冲液)将微球沉淀c于400w超声复悬30s，即得。
对比例2a-2b
一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针，与实施例2a除步骤S1中使用的纳米标记荧光微球分别由对比例1a-1b制得外，其他条件均相同。
实施例3：制备PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒
实施例3a-3f
一种PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，包括PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡、样本稀释液和IC卡。
PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡包括PVC底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫，NC膜上有两条检测线(T1线、T2线)和质控线(C线)。T1线包被有抗PGⅠ单克隆抗体，T2线包被有抗PGⅡ单克隆抗体，C线包被有羊抗鼠IgG。结合垫包被有实施例2a-2f制得的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针。
样品稀释液为0.1M的PB缓冲液；IC卡中拷贝有使用本试剂盒检测过程的相关参数、操作步骤等信息。
本检测试剂盒的使用仪器包括上海凯创医药生物科技有限公司生产的KD-VF干式荧光免疫分析仪、KD-F1600干式荧光免疫分析仪。
对比例3a-3b
一种PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，与实施例3a除结合垫分别包被有对比例2a-2b制得的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针外，其他条件均相同。
实施例4：灵敏度检测以胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原为待测样品来测定实施例3a-3f、对比例3a-3b制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒的灵敏度。
将胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原分别用含5％小牛血清的PBS缓冲液(0.02M，pH 7.4)配制成系列浓度(0；0.5ng/mL；1ng/mL；5ng/mL；10ng/mL；50ng/mL；100ng/mL；500ng/mL)的样液，用移液枪取80μL样液分别加入样品垫中，10分钟后，采用上海凯创医药生物科技有限公司生产的KD-VF干式荧光免疫分析仪检测荧光强度，计算荧光强度比值T1/C、T2/C，并记入下表1和表2中。
表1荧光强度比值T1/C
表2荧光强度比值T2/C
通过分析表1、表2数据可知，实施例3a-3f制得的试剂盒检测PGⅠ抗原的灵敏度均可达0.5ng/mL，同样的，检测PGⅡ抗原的灵敏度也均可达0.5ng/mL。对比例3a制得的试剂盒检测PGⅠ抗原和PGⅡ抗原的灵敏度均为1ng/mL；对比例3b制得的试剂盒检测PGⅠ抗原和PGⅡ抗原的灵敏度均为0.5ng/mL。
根据荧光强度比值与抗原浓度绘制标准曲线，结果如图1-图8所示。
参照图1，实施例3a中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0335x+0.0497，R2＝0.9997，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0388x+0.0014，R2＝0.9982，线性范围为0～500ng/mL。
参照图2，实施例3b中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0358x+0.0539，R2＝0.9997，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-5E-05x2+0.0436x+0.0213，R2＝0.9962，线性范围为0～500ng/mL。
参照图3，实施例3c中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0324x+0.0473，R2＝0.9997，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0392x+0.0008，R2＝0.995，线性范围为0～500ng/mL。
参照图4，实施例3d中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-3E-05x2+0.0344x+0.0508，R2＝0.9996，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0404x+0.0617，R2＝0.9994，线性范围为0～500ng/mL。
参照图5，实施例3e中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0306x+0.0329，R2＝0.9995，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0359x+0.1461，R2＝0.9912，线性范围为0～500ng/mL。
参照图6，实施例3f中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0326x+0.0437，R2＝0.9999，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0379x+0.0991，R2＝0.9967，线性范围为0～500ng/mL。
参照图7，对比例3a中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-1E-05x2+0.0299x+0.0435，R2＝0.9999，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-3E-05x2+0.0359x+0.0908，R2＝0.9967，线性范围为0～500ng/mL。
参照图8，对比例3b中，检测PGⅠ抗原的标准曲线方程为y＝-2E-05x2+0.0329x+0.0251，R2＝0.9998，线性范围为0～500ng/mL；检测PGⅡ抗原的标准曲线方程为y＝-4E-05x2+0.0369x+0.1019，R2＝0.9954，线性范围为0～500ng/mL。
综上所述，本申请实施例3a-3f制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测灵敏度高，且在PGⅠ/PGⅡ抗原浓度为0～500ng/mL的浓度范围内，线型关系良好，相关系数R2均可达0.99以上。而对比例3a中制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测灵敏度相较于实施例3a-3f中有所下降，分析其原因可能是由于对比例3a中仅使用羧基修饰的铕配合物作为标记微球，其荧光强度有所下降，进而导致检测灵敏度受到相应的影响。由此表明了使用稀土铕与稀土铽掺杂制备纳米荧光标记微球，受铕与铽之间的共激发作用，提高了标记微球的荧光强度，从而提高了试剂盒的检测灵敏度。而对比例3b中制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒具有与实施例3a-3f相当的检测灵敏度，由此表明了标记微球是否由羧基修饰对试剂盒的检测灵敏度的影响较小。
实施例5：稳定性检测以胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原为待测样品来测定实施例3a-3f及对比例3a-3b制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒的稳定性。
将胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ抗原分别用含5％小牛血清的PBS缓冲液(0.02M，pH 7.4)配制成1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL三种浓度的待测样液，用移液枪取80μL样液分别加入样品垫中，10分钟后，采用上海凯创医药生物科技有限公司生产的KD-VF干式荧光免疫分析仪检测荧光强度。每个实施例或对比例制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒针对不同浓度的样品分别重复检测10次，根据10次检测结果计算平均偏差CV值，并记入下表3中。
表3 PGⅠ抗原稳定性检测CV值(％)
表4 PGⅡ抗原稳定性检测CV值(％)
通过分析表3和表4数据可知，当以1ng/mL的PGⅠ抗原作为测试样品时，连续检测10次，实施例3a-3f的检测试剂盒检测结果CV值仅为3.89～4.39％；当以10ng/mL的PGⅠ抗原作为测试样品时，连续检测10次，实施例3a-3f的检测试剂盒检测结果CV值仅为3.42～4.02％；当以100ng/mL的PGⅠ抗原作为测试样品时，连续检测10次，实施例3a-3f的检测试剂盒检测结果CV值仅为3.77～4.31％；当以1ng/mL的PGⅡ抗原作为测试样品时，连续检测10次，实施例3a-3f的检测试剂盒检测结果CV值仅为5.44～5.98％；当以10ng/mL的PGⅡ抗原作为测试样品时，连续检测10次，实施例3a-3f的检测试剂盒检测结果CV值仅为4.99～5.57％；当以100ng/mL的PGⅡ抗原作为测试样品时，连续检测10次，实施例3a-3f的检测试剂盒检测结果CV值仅为5.34～5.88％。而对比例3a与对比例3b的检测试剂盒，无论是检测PGⅠ抗原还是PGⅡ抗原，在上述浓度下，其CV值均相较于实施例3a-3f有明显升高。
由此表明了，本申请实施例3a-3f制得的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测的稳定性高。分析其原因可能是由于，通过将稀土铕离子和稀土铽离子掺杂复配制备稀土离子配合物，在同一配体不同键位掺杂了铕和铽两种稀土离子，通过铕和铽离子之间的共激发和敏化作用，不仅提高了配体的荧光强度，延长了荧光寿命，提高了纳米荧光标记微球与抗体的交联物的结构稳定性，进而提高了PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒检测结果的稳定性。并且，通过对标记微球表面进行功能化修饰，接枝羧基基团，也可提高试剂盒检测的稳定性，降低检测CV值。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种纳米荧光标记微球，其特征在于，所述纳米荧光标记微球为由羧基修饰的铕铽配合物，所述纳米荧光标记微球的直径为0.2μm；
所述纳米荧光标记微球的制备方法包括如下步骤：
(一)稀土混合溶液的制备：将氧化铕与氧化铽按Eu3+与Tb3+的摩尔比为(20～500):1混合后，溶于质量浓度为0.5%的盐酸中，加热除去多余盐酸，在加热搅拌回流的条件下溶解于乙醇中，得到稀土混合溶液；
(二)氟化钠溶液的制备：在加热搅拌回流的条件下将氟化钠溶于乙醇中，得到氟化钠溶液；
氟化钠的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:(3～4)；
(三)表面功能化修饰：在不断搅拌的条件下将步骤(一)得到的稀土混合溶液和步骤(二)得到的氟化钠溶液混合，并在惰性气体保护氛围下加热至140～150℃，保温搅拌1～1.5h后，以3～5℃/min的升温速率升温至220～230℃，保温搅拌2～4h后，冷却至100～120℃，加入戊二酸二钠盐，再次加热至220～230℃保温搅拌6～8h，自然冷却，在10000～20000rpm转速下离心8～10min，依次用乙醇和去离子水洗涤沉淀，再次重复离心和洗涤过程2～3次，真空干燥，即得；
戊二酸二钠盐的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:(105～110)。
2.根据权利要求1所述的纳米荧光标记微球，其特征在于，步骤(一)中，氧化铕与氧化铽按Eu3+与Tb3+的摩尔比为100:1混合。
3.根据权利要求1所述的纳米荧光标记微球，其特征在于，步骤(二)中，氟化钠的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:4。
4.根据权利要求1所述的纳米荧光标记微球，其特征在于，步骤(三)中，戊二酸二钠盐的摩尔数与步骤(一)中Eu3+与Tb3+总摩尔数的比值为1:108。
5.一种PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针，其特征在于，由PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体负载在权利要求1-4任一项所述的纳米荧光标记微球而得。
6.权利要求5所述PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将权利要求1-4任一项所述的纳米荧光标记微球与活化缓冲液混匀，离心获得微球沉淀a；
S2，用耦联缓冲液将微球沉淀a超声复悬，得到微球溶液a；
S3，向微球溶液a中加入NHS和EDC，混合反应0.8～1.2h后，离心获得微球沉淀b；
S4，用耦联缓冲液将微球沉淀b超声复悬，得到微球溶液b；
S5，向微球溶液b中加入PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体，混匀反应2.8～3.2h，离心获得微球沉淀c；
S6，用封闭缓冲液将微球沉淀c超声复悬，即得。
7.根据权利要求6所述的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针的制备方法，其特征在于，步骤S3中，NHS的加入量为0.2～1mg/mL微球溶液a；EDC的加入量为0.04～0.2mg/mL微球溶液a。
8.根据权利要求6所述的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针的制备方法，其特征在于，步骤S5中，PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体的加入量为1～5mg/mL微球溶液b。
9.一种PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，其特征在于，包括PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡，所述PGⅠ/PGⅡ检测试剂卡包被有权利要求5所述的PGⅠ/PGⅡ单克隆抗体探针。
10.根据权利要求9所述的PGⅠ/PGⅡ检测试剂盒，其特征在于，检测PGⅠ抗原的灵敏度可达0.5ng/mL，线性范围0～500ng/mL，相关系数R2＞0.999，CV＜4.5%；检测PGⅡ抗原的灵敏度可达0.5ng/mL，线性范围0～500ng/mL，相关系数R2＞0.99，CV＜6.0%。
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