CN116251129A

CN116251129A - 桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途

Info

Publication number: CN116251129A
Application number: CN202111498398.2A
Authority: CN
Inventors: 陈劲初; 吴宗远; 吴亮宜; 李宜蓁; 朱心彤
Original assignee: Grape King Bio Ltd
Current assignee: Grape King Bio Ltd
Priority date: 2021-12-09
Filing date: 2021-12-09
Publication date: 2023-06-13

Abstract

本发明提供一种桑黄(Phellinus linteus)GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途。桑黄GKPl菌丝体之萃取物可于体外增加过氧小体增生活化受体γ辅启动因子(peroxisome proliferator‑activated receptor gamma coactivator，PGC)‑1α及其下游基因的表达，使棕色脂肪细胞量增加，故有潜力做为改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的有效成分。

Description

桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途

【技术领域】

本发明系有关于一种桑黄菌丝体之用途，特别是关于一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途。

【先前技术】

肥胖是一种脂肪不正常或过度累积的身体状况，与许多疾病的发生呈正相关，如：代谢症候群、心血管疾病及/或糖尿病。其次，肥胖还与肌肉骨骼疾病(如：退化性关节炎)、某些癌症及/或气喘等疾病的发生呈正相关。再者，肥胖亦影响传染性疾病的病程发展及愈后。举例而言，严重特殊传染性肺炎(coronavirus disease of 2019，COVID-19)的患者中，肥胖患者的入院比例、重症医疗照护需求及/或死亡率系高于非肥胖患者。

当热量的摄取超过热量的消耗时，多余的热量会以脂肪的形式储存。因此，改善肥胖的基本原则可包含但不限于饮食控制与运动，其中运动不仅可直接燃烧热量，还可改变身体利用脂肪的方式，例如增加棕色脂肪细胞，其可藉由代谢脂肪酸，以产生热。然而，可增加棕色脂肪细胞量之有效成分少有研究。

有鉴于此，亟需一种可用于改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物，以解决上述问题。

【发明内容】

因此，本发明之一样态是提供一种桑黄(Phellinus linteus)GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其中组成物可包含但不限于有效剂量之桑黄GKPl菌丝体之萃取物做为有效成分，藉以于体外增加过氧小体增生活化受体γ辅启动因子(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator，PGC)-1α的表达量。

本发明之另一态样系提供一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其中组成物可包含但不限于有效剂量之桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物做为有效成分。

本发明之又一态样系提供一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，其中组成物可包含但不限于有效剂量之桑黄GKPl菌丝体之萃取物做为有效成分，且萃取物于体外之有效剂量可例如为150μg/mL至250μg/mL。

根据本发明之上述之态样，提出一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其中组成物可包含但不限于有效剂量之桑黄GKPl菌丝体之萃取物做为有效成分，藉以于体外增加PGC-1α的表达量。上述桑黄GKPl菌丝体可例如为于2020年11月12日保藏于日本国家技术评估学会(National Institute of Technology and Evaluation，NITE)专利微生物保藏中心(Patent Microorganisms Depositary，地址：日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室；邮政编码：292-0818)，保藏编号为NITE BP-03321。

依据本发明上述之实施例，萃取物可包含但不限于桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物。依据本发明上述之实施例，萃取物于体外之有效剂量可例如为150μg/mL至250μg/mL。依据本发明上述之实施例，相较于未施用组成物之前脂肪细胞，施用组成物之前脂肪细胞的第三型纤维连接蛋白结构域包含蛋白(fibronectintype III domain-containing protein，FNDC)5之表达量增加。依据本发明上述之实施例，相较于未施用组成物之前脂肪细胞，施用组成物之前脂肪细胞的解偶联蛋白(uncouplingprotein，UCP)1之表达量增加。

根据本发明之另一态样，提出一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其中组成物可包含但不限于有效剂量之桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物做为有效成分，藉以于体外增加前脂肪细胞之PGC-1α的表达量，且桑黄GKPl菌丝体的保藏编号可例如为NITE BP-03321。依据本发明上述之实施例，热水萃取物及/或乙醇萃取物于体外之有效剂量可例如为150μg/mL至250μg/mL。依据本发明上述之实施例，相较于未施用组成物之前脂肪细胞，施用组成物之前脂肪细胞的UCP1及FNDC5之表达量增加。

根据本发明之又一态样，提出一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，其中组成物可包含但不限于有效成分之桑黄GKPl菌丝体之萃取物做为有效成分，藉以于体外增加前脂肪细胞PGC-1α的表达量。此萃取物对前脂肪细胞之有效剂量可例如为150μg/mL至250μg/mL，且桑黄GKPl菌丝体之保藏编号可例如为NITE BP-03321。依据本发明上述之实施例，桑黄GKPl菌丝体之萃取物可包含但不限于桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物。

应用本发明之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，可于体外增加前脂肪细胞的PGC-1α及其下游基因(如：FNDC5及UCP1)的表达量，使棕色脂肪细胞增加，故有潜力改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病。

桑黄GKPl菌丝体系于2020年11月12日保藏于日本国家技术评估学会(NationalInstitute of Technology and Evaluation，NITE)专利微生物保藏中心(PatentMicroorganisms Depositary，地址：日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室；邮政编码：292-0818)，保藏编号为NITE BP-03321。

【图式简单说明】

为让本发明之上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之详细说明如下：

[图1A]至[图1C]分别是显示根据本发明一实施例之空白组、对照组及实验组之细胞的显微影像。

[图2]是绘示根据本发明之一实施例之不同组别之细胞的PGC-1α的相对基因表达量之柱形图。

[图3A]至[图3F]分别是显示根据本发明之一实施例之对照组的可见光及蓝光之显微影像、第一实验组的可见光及蓝光之显微影像、第二实验组的可见光及蓝光之显微影像。

[图4]是绘示根据本发明之一实施例之不同组别之细胞的UCP1的相对基因表达量的柱形图。

【实施方式】

承上所述，本发明提供一种桑黄(Phellinus linteus)GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，其中此组成物可包含但不限于有效剂量的桑黄GKPl菌丝体之萃取物做为有效成分。

在一实施例中，桑黄GKPl(又称为菌株GKPl)系于2020年11月12日保藏于日本国家技术评估学会(National Institute of Technology and Evaluation，NITE)专利微生物保藏中心(Patent Microorganisms Depositary，地址：日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室；邮政编码：292-0818)，保藏编号为NITE BP-03321。

在一实施例中，桑黄GKPl菌丝体之萃取物可例如为对桑黄GKPl菌丝体进行多培养步骤处理及萃取处理后获得。上述多培养步骤处理可利用习知培养方法进行。在一具体例中，多培养步骤处理可选择性包含固态培养步骤、液态培养步骤及酦酵步骤。详细而言，固态培养步骤可例如为在15℃至30℃之条件下培养桑黄GKPl菌丝体于固态培养基上达7天至14天，以获得第一培养物。上述固态培养基可例如为习知固态培养基。在一具体例中，固态培养基系含碳源及氮源的马铃薯糊精培养基(potato dextrose agar，PDA)。

液态培养步骤可例如为在15℃至30℃、pH 2至pH 6及震荡速率110rpm至130rpm之条件下培养第一培养物于液态培养基中达3天至21天，以获得第二培养物。液态培养基的成分无特别限制，可视需求调整。在一实施例中，基于液态培养基为100重量％，液态培养基可包含但不限于1.00重量％至3.00重量％的综合性碳氮源、1.00重量％至4.00重量％的糖类、0.10重量％至1.00重量％的酵母萃取物、0.10重量％至1.00重量％的蛋白胨、0.01重量％至0.50重量％的无机盐类及平衡量的水。综合性碳氮源可例如为谷类(如：麦粉)及/或豆类(如：黄豆粉、绿豆粉及/或肉桂粉)，糖类可例如为葡萄糖、果糖、麦芽糖及/或蔗糖，且无机盐类可例如为硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾及/或硫酸铁。

酦酵步骤可例如为在15℃至30℃、pH2至pH6、震荡速率50rpm至150rpm之条件下培养第二培养物于酦酵培养基中达3天至21天，以获得桑黄GKPl菌丝体之酦酵物(亦称为GKPl酦酵物)。在一实施例中，酦酵步骤可例如为在酦酵槽中进行。在酦酵培养步骤进行时，导入气体于此酦酵槽中，其中气体可包含但不限于空气、氧气、二氧化碳及/或氦气，使槽压达0.5kg/cm²至1.0kg/cm²，且导入气体之通气速率可例如0.1导入气体体积/酦酵液体积/分钟(vvm)至1.5vvm。酦酵培养基的成分无特别限制，且可例如为上述液态培养基。

在一实施例中，在酦酵步骤后，可选择性对GKPl酦酵物进行干燥处理及研磨处理，以获得GKPl干燥物。干燥处理可利用习知干燥方法进行，例如：冷冻干燥法、真空干燥法或喷雾干燥法。研磨处理可利用习知研磨方法进行，例如：机械力研磨法、滚筒式研磨法或气动研磨法。在一实施例中，GKPl酦酵物对GKPl干燥物的体积重量比例可例如为100：3。

上述萃取处理可例如利用习知萃取方法进行，以获得桑黄GKPl菌丝体之萃取物(以下称为GKPl萃取物)。在一实施例中，萃取处理可例如为以100℃之热水萃取GKPl酦酵物及/或GKPl干燥物达30分钟，以获得桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物。在一示例中，GKPl酦酵物及/或GKPl干燥物对热水的体积比值可为1/50至1/1、1/30至1/10，或1/20。在一实施例中，萃取处理可例如为以乙醇萃取GKPl酦酵物及/或GKPl干燥物达60分钟，且可选择性进行超音波处理，从而获得桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物。在一示例中，GKPl酦酵物及/或GKPl干燥物对乙醇的重量比值可为1/50至1/1、1/30至1/10，或1/20。

在一实施例中，可选择性对GKPl萃取物进行上述干燥处理及研磨处理。在一实施例中，可选择性对GKPl萃取物进行固液分离处理及浓缩处理。固液分离处理可例如为离心步骤及/或过滤步骤。浓缩处理可利用习知浓缩方法进行，例如：减压浓缩法、蒸发浓缩法或膜浓缩法。

经体外细胞实验证实，GKPl萃取物可促进前脂肪细胞分化为棕色脂肪细胞。详细而言，相较于未施用桑黄GKPl菌丝体的萃取物之前脂肪细胞，前脂肪细胞在施用桑黄GKPl菌丝体的萃取物后，可分化成细胞内的油滴小且多、过氧小体增生活化受体γ辅启动因子(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC)-1α的基因表达量、第三型纤维连接蛋白结构域包含蛋白(fibronectin type III domain-containing protein，FNDC)5的启动子活性及解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)1的基因表达量增加的细胞。

上述「前脂肪细胞(preadipocyte)」是脂肪细胞的前驱物。在一实施例中，前脂肪细胞并无特别限制，可例如为成纤维细胞(fibroblast)及/或间质干细胞(mesenchymalstem cell)。上述脂肪细胞可包含但不限于白色脂肪细胞及棕色脂肪细胞，其中增加棕色脂肪细胞的数量意味着改善肥胖。详细而言，上述「棕色脂肪细胞」广义是指具有类棕色脂肪细胞的表现型(brown adipocyte-like phenotype)的脂肪细胞。上述类棕色脂肪细胞的表现型的特征之一为含有较多的小油滴及较多的粒线体，因此可较有效的消耗储存于油滴的脂肪，从而改善肥胖。另一方面，白色脂肪细胞含有较少的粒线体，且具有单一大油滴[即单房的(unicular)]，以将多余的热量以脂肪的形式储存。一般而言，新生儿体内具有较大的棕色脂肪细胞库，其在婴儿期后变小。然而，近来研究显示，成年人类的棕色脂肪细胞数量可在特定刺激下(如：运动、冷的环境)增加。如上所述，GKPl萃取物已证实可促进前脂肪细胞分化为棕色脂肪细胞，因此有潜力改善肥胖。

除了含量较多的棕色脂肪细胞可改善肥胖，棕色脂肪细胞的粒线体还有UCP1表达量高的特征，其中UCP1可消耗储存于粒线体电化学浓度差的能量，从而增加细胞的静止代谢率。UCP1的表达量受到PGC-1α及其下游基因的调控。详细而言，PGC-1α转录共活化因子，可调控FNDC5的表达。FNDC5是鸢尾素的前驱物，其中鸢尾素可增加提高UCP1的表达量。因此，类棕色脂肪细胞的表现型可由PGC-1α及其下游基因之表达量评估，其中PGC-1α的下游基因可包含但不限于鸢尾素的前驱物FNDC5、鸢尾素及UCP1。

在一实施例中，表达量可例如为基因表达量、蛋白质表达量及/或启动子活性，其中启动子活性可藉由操作性连接于启动子(即位于启动子的下游)的报告基因(reportergene)之表达量评估。在一实施例中，报告基因可例如为绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)、β-半乳糖苷酶基因及/或荧光素酶(luciferase)。在一实施例中，启动子活性可藉由绿色荧光蛋白的荧光强度评估，其中荧光是绿色荧光蛋白在暴露于蓝光至紫外光范围的光后产生。

上述「肥胖」可由身体质量指数(body mass index，BMI)评估。根据世界卫生组织提供的定义，对于成人，BMI大于25为过重，且BMI大于30为肥胖。肥胖可提高全身性慢性发炎及胰岛素抗性的风险，从而引起肥胖相关代谢性疾病。上述「肥胖相关代谢性疾病」可包含但不限于由肥胖引起的代谢症候群及由代谢症候群引起的疾病。上述「代谢症候群」是对于一群危险因子的称呼，其中危险因子包含腹部肥胖、高血压、高血糖、高血中三酸甘油脂及低血中高密度脂蛋白胆固醇之至少三者，且这些危险因子引起的疾病(即由代谢症候群引起的疾病)可包含但不限于心血管疾病(如：心脏病及/或中风)及第二型糖尿病。其次，此些危险因子还会促进慢性肾脏病、脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化及/或肝炎等疾病的发展。

上述「改善肥胖」是指降低身体累积的脂肪量，其中改善肥胖的具体方法可包含但不限于减少热量的摄取及/或增加热量的消耗。在一实施例中，改善肥胖的目标系透过改变身体利用脂肪的方式达成，如：增加棕色脂肪细胞量。在一实施例中，肥胖可藉由施用GKPl萃取物获得改善。

在一实施例中，GKPl萃取物于体外的有效剂量可例如为150μg/mL至250μg/mL，以促进前脂肪细胞分化为棕色脂肪细胞。在一实施例中，桑黄GKPl菌丝体之萃取物可包含但不限于热水萃取物及/或乙醇萃取物。在一实施例中，桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及乙醇萃取物的重量比值可例如为0.1至10，或0.5至5，或1。

以下利用数个实施例以说明本发明之应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰。

实施例一、菌株来源

桑黄GKPl系分离自中国采集的野生桑黄子实体，并于2020年11月12日保藏于日本国家技术评估学会(National Institute of Technology and Evaluation，NITE)专利微生物保藏中心(Patent Microorganisms Depositary)，保藏编号为NITE BP-03321，其中保藏机构的地址系日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室；邮政编码：292-0818。补充说明的是，虽然Phellinus linteus为桑黄常用的学名，但分子系统学的研究认为桑黄的学名应替换成Sanghuangporus sanghuang。关于桑黄GKPl之微生物学性质及培养方式，请参阅日本专利申请案(申请号JP 2021-84633)，此处一并列为参考文献。

实施例二、制备桑黄GKPl菌丝体之萃取物

桑黄GKPl菌丝体之萃取物(以下称为GKPl萃取物)的制备方法简述如下：将桑黄GKPl菌丝体接种于PDA上，并于25℃下培养7天，以获得第一培养物。然后，以25℃、pH 4.5且震荡速率120rpm之条件下培养第一培养物于培养液中达14天，以获得第二培养物。上述培养液包含1重量％的综合性碳氮源、1.5重量％的糖类、0.3重量％的酵母萃取物、0.3重量％的蛋白胨及0.1重量％的无机盐类。综合性碳氮源、糖类及无机盐类之具体成分为本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知，可视实际需求任意调整，并不影响酦酵步骤之进行，在此不另赘述。

接着，在25℃、pH 6、震荡速率80rpm且空气的通气速率1.0vvm的条件下培养第二培养物于上述培养液中达14天，以获得桑黄GKPl菌丝体的酦酵物。然后，对桑黄GKPl菌丝体的酦酵物进行冷冻干燥，以获得桑黄GKPl菌丝体的冻干粉(以下简称为GKPl冻干粉)。

接下来，分别制备桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及乙醇萃取物(以下分别简称为GKPl热水萃取物及GKPl乙醇萃取物)。GKPl热水萃取物是将GKPl冻干粉加入蒸馏水后，于100℃进行热水萃取达30分钟，再进行冷冻干燥后获得，其中GKPl冻干粉对蒸馏水的体积比值是1/20。GKPl乙醇萃取物是将GKPl冻干粉加入乙醇后，以25℃以600W、40kHz超音波处理达60分钟后，进行离心以获得上清液，再对上清液进行减压浓缩后获得，其中GKPl冻干粉对乙醇的重量比值是1/20。GKPl热水萃取物及GKPl乙醇萃取物系回溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，以利后续评估之进行。

实施例三、评估前GKPl萃取物增加棕色脂肪细胞量的功效

1.前脂肪细胞的培养及分化

3T3-L1细胞[保藏于美国典型保养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，且保藏编号为ATCC CL-17]系衍生自小鼠胚胎的NIH 3T3细胞，其中3T3-L1细胞的细胞种类是成纤维细胞(fibroblast)，且可分化为白色脂肪细胞或棕色脂肪细胞，因此3T3-L1细胞可做为前脂肪细胞(preadipocyte)。将3T3-L1细胞接种于6孔细胞培养盘中，使每孔的细胞密度为2×10⁵细胞/mL。以细胞生长培养基[含有10％胎牛血清的高浓度葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)]于37℃、5％CO₂下培养3T3-L1细胞2天，当3T3-L1细胞的汇合度(confluency)达70％时，将3T3-L1细胞分为空白组、对照组及实验组。

对空白组的3T3-L1细胞进行继代处理、对对照组的3T3-L1细胞进行分化处理，并对实验组的3T3-L1细胞进行GKPl萃取物处理。继代处理系以细胞生长培养基培养3T3-L1细胞达8天。分化处理系以含有0.1％的DMSO之分化培养基[含有10％胎牛血清、0.5mM的异丁基-1-甲基黄嘌呤(isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、1μM的地塞米松(dexamethasone，DEX)、10μg/mL的胰岛素及高浓度葡萄糖的DMEM]培养3T3-L1细胞达8天，期间每2天更换一次新鲜的含DMSO之分化培养基。GKPl萃取物处理系以含有200μg/mL的混合GKPl萃取物(由100μg/mL的GKPl热水萃取物及100μg/mL之GKPl乙醇萃取物组成)的分化培养基培养3T3-L1细胞达8天，期间每2天更换一次新鲜的含有混合GKPl热水萃取物的分化培养基。值得注意的是，分化培养基中的DMSO总浓度需小于或等于0.1％，以避免其毒性影响3T3-L1细胞的生长。

2.油红O染色评估不同组别的细胞内之油滴的分布

利用油红(Oil-red)O染剂将细胞内的油滴染成红色，藉以观察油滴于不同组别的细胞内的分布。详细而言，以1倍的磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)润洗不同组别的细胞2次，再以4％的甲醛(formaldehyde)固定不同组别的细胞达1小时。移除多余的液体后，以油红O染剂覆盖不同组别的细胞达1小时，再先后以二次水及40％的乙醇溶液润洗不同组别的细胞1次。移除多余的液体后，以适量的二次水覆盖不同组别的细胞上加入，从而利用光学显微镜观察并拍照。

图1A至图1C分别是显示根据本发明一实施例之空白组(图1A)、对照组(图1B)及实验组(图1C)的细胞显微影像。如图1A所示，空白组的细胞内无油滴，说明空白组的细胞是未分化的3T3-L1细胞。如图1B所示，对照组的细胞具有巨大的油滴，证实3T3-L1细胞经分化处理后，可分化为白色脂肪细胞。如图1C所示，实验组的细胞内的油滴小而分散，证实3T3-L1细胞经GKPl萃取物处理后，可分化为棕色脂肪细胞。

3.qPCR评估不同组别之细胞的PGC-1α的相对基因表达量

利用市售RNA纯化套组(GeneJET RNA Purification Kit，赛默飞世尔科技有限公司，美国)纯化不同组别的细胞之mRNA，再利用市售RNA反转录套组(RevertAid H MinusFirst Strand cDNA Synthesis Kit，赛默飞世尔科技有限公司，美国)将mRNA反转录成cDNA。接着，利用核甘酸序列系如序列识别号(SED ID NO)：1所示的PGC-1α上游引物及核甘酸序列系如SED ID NO：2所示的PGC-1α下游引物，对上述cDNA进行实时定量聚合酶连锁反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)，并以2^-ΔΔCt法计算不同组别之细胞的PGC-1α的相对基因表达量(以空白组的细胞之PGC-1α的相对基因表达量为1.0)。进行三重复。利用成对t检定(paired t test)分析实验结果，并将结果记录于表1及图2中，其中表1的结果系以平均值±平均值标准误差(standard error of the mean，SEM)表示。

图2是绘示根据表1之不同组别之细胞的PGC-1α的相对基因表达量之柱形图，其中横轴表示组别，且纵轴表示PGC-1α的相对基因表达量。表1及图2的符号「**」表示相对于对照组具有统计上的显著差异(p<0.01)。

表1

细胞	PGC-1α的相对基因表达量
		空白组	1.000±0.013
对照组	1.042±0.007
		实验组	1.409±0.021**

如表1及图2所示，空白组及对照组之细胞的PGC-1α的相对基因表达量没有统计上的显著差异，说明3T3-L1细胞未经分化处理及经分化处理后的PGC-1α的相对基因表达量没有统计上的显著差异。然而，实验组之PGC-1α的相对基因表达量系显著高于对照组，证实GKPl萃取物具有促进3T3-L1细胞分化成棕色脂肪细胞、甚至增加棕色脂肪细胞量的功效。

4.藉由转染细胞产生的荧光强度评估不同组别的细胞之FNDC5的启动子活性

将含有小鼠的FNDC5启动子及绿色荧光蛋白基因的质粒转染于人胚胎肾细胞HEK293细胞(保藏编号：ATCC CRL-1573)，以获得转染细胞，其中绿色荧光蛋白基因操作性连接于FNDC5启动子。当FNDC5的启动子活性增加时，绿色荧光蛋白的表达量增加，使得转染细胞在蓝光的下产生强度较强的绿色荧光。将转染细胞接种于96孔细胞培养盘中，使每孔的细胞密度为1×10⁴细胞/mL至5×10⁴细胞/mL。以细胞培养液(含有10％胎牛血清的DMEM)培养转染细胞于37℃、5％CO₂达3天，以达90％汇合度。小鼠的FNDC5启动子及绿色荧光蛋白基因为本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知，在此不另赘述。

接着，将转染细胞分为对照组、第一实验组及第二实验组，并于37℃、5％CO₂下培养转染细胞达24小时，其中对照组的转染细胞系培养于细胞培养液中，第一实验组的转染细胞系培养于含有200μg/mL之GKPl热水萃取物的细胞培养液中，且第二实验组的转染细胞系培养于含有200μg/mL之GKPl乙醇萃取物的细胞培养液中。值得注意的是，GKPl热水萃取物及GKPl乙醇萃取物系回溶于DMSO后，再以适量的体积加入细胞培养液中，藉以达到上述浓度，且相同体积的DMSO系加入对照组的细胞培养液中。

然后，利用荧光显微镜观察并记录转染细胞在可见光及蓝光(激发波长为488nm)之显微影像。请参阅图3A至图3F，其中图3A至图3F分别是显示根据本发明之一实施例之对照组的可见光(图3A)及蓝光(图3B)之显微影像、第一实验组的可见光(图3C)及蓝光(图3D)之显微影像、第二实验组的可见光(图3E)及蓝光(图3F)之显微影像。如图3B所示，对照组的转染细胞在蓝光下几乎没有绿色荧光产生。如图3D及图3F所示，第一实验组及第二实验组的转染细胞在蓝光下产生高强度的绿色荧光，证实第一实验组及第二实验组的转染细胞之FNDC5的启动子活性较佳。

以裂解缓冲液(lysis buffer)裂解对照组、第一实验组及第二实验组的转染细胞，以获得细胞裂解液。然后，以6000×g的转速在4℃下离心细胞裂解液，以获得上清液。接着，将上清液搜集于96孔细胞培养盘中，再利用荧光分光光度计以蓝光(波长：488nm)照射上清液，以检测其产生的绿色荧光(波长：520nm)的强度。结果系记录于表2中，其中符号「*」表示利用成对t检定进行统计，与对照组具有统计上的显著差异。

表2

上清液	相对荧光强度
		对照组	1.00±0.10
第一实验组	1.31±0.16*
		第二实验组	2.96±0.45*

如表2所述，第一实验组及第二实验组之相对荧光强度系显著高于对照组之相对荧光强度，证实GKPl热水萃取物及/或GKPl乙醇萃取物具有增加FNDC5的启动子活性之功效。

5.qPCR评估不同组别之细胞的UCP1的相对基因表达量

承上所述，空白组的cDNA是获取自经继代处理的3T3-L1细胞、对照组的cDNA是获取自经分化处理的3T3-L1细胞，且实验组的cDNA是获取自经GKPl萃取物处理在的3T3-L1细胞。将上述不同组别的细胞之cDNA利用核甘酸序列系如SED ID NO：3所示的UCP1上游引物及核甘酸序列系如SED ID NO：4所示的UCP1下游引物，进行实时定量聚合酶连锁反应，并以2^-ΔΔCt法计算不同组别之UCP1的相对基因表达量(以空白组PGC-1α的基因表达量为1.0)。进行三重复。利用成对t检定(paired t test)分析实验结果，并将结果记录于表3及图4中，其中表3以平均值±平均值标准误差表示结果。

图4是绘示根据表3之不同组别之细胞的UCP1的相对基因表达量的柱形图，其中横轴表示组别，且纵轴表示UCP1的相对基因表达量。表3及图4的符号「#」表示相对于空白组具有统计上的显著差异相(p<0.05)，且图号「*」表示与对照组具有统计上的显著差异(p<0.05)。

表3

细胞	UCP1的相对基因表达量
		空白组	0.393±0.144
对照组	5.257±0.305#
		实验组	7.187±0.311*

如表3及图4所示，实验组的UCP1相对基因表达量系显著高于对照组，证实GKPl萃取物具有促进3T3-L1细胞分化成棕色脂肪细胞、甚至增加棕色脂肪细胞量的功效。

综上所述，GKPl萃取物可增加PGC-1α、FNDC5及UCP1之表达量增加，证实GKPl萃取物具有促进棕色脂肪细胞的分化、甚至增加棕色脂肪细胞的功效，其中因为棕色脂肪细胞可燃烧脂肪，说明GKPl萃取物有潜力做为改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的有效成分。

综言之，本发明虽以特定的培养方法、特定的制程、特定的施用方式、特定的实验模型及特定的评估方法做为例示，说明本发明之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，惟本发明所属技术领域中具有通常知识者应可理解，本发明不限于此，在不脱离本发明的精神及范围内，本发明亦可使其他的培养条件、其他的制程、其他的施用方式、其他的实验模型及其他的评估方法进行。

虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但可对前述揭露内容进行各种润饰、各种更动及替换，而且应可理解的是，在不脱离本发明之精神和范围内，某些情况将采用本发明实施例之某些特征但不对应使用其他特征。因此，本发明的精神和权利要求范围不应限于以上例示实施例所述。

序列表

<110> 葡萄王生技股份有限公司

<120> 桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖及肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途

<130> 无

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PGC-1α上游引物

<400> 1

cgcaggtcga acgaaactga ctt 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> PGC-1α下游引物

<400> 2

gttacctgcg caagcttctc tga 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> UCP1上游引物

<400> 3

gctttgcctc actcaggatt gg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> UCP1下游引物

<400> 4

ccaatgaaca ctgccacacc tc 22

Claims

1.一种桑黄(Phellinus linteus)GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中该组成物包含一有效剂量之该桑黄GKPl菌丝体之一萃取物做为一有效成分，藉以于体外增加过氧小体增生活化受体γ辅启动因子(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator，PGC)-1α的一表达量，且该桑黄GKPl菌丝体系于2020年11月12日保藏于日本国家技术评估学会(National Institute of Technology andEvaluation，NITE)专利微生物保藏中心(Patent Microorganisms Depositary)，保藏编号为NITE BP-03321。

2.如权利要求1所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中该萃取物包含该桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或该桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物。

3.如权利要求1所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中该萃取物于体外的该有效剂量系150μg/mL至250μg/mL。

4.如权利要求1所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中相较于未施用该组成物之一前脂肪细胞，施用该组成物之该前脂肪细胞的第三型纤维连接蛋白结构域包含蛋白(fibronectin type III domain-containing protein，FNDC)5之一表达量增加。

5.如权利要求4所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中相较于未施用该组成物之该前脂肪细胞，施用该组成物之该前脂肪细胞的解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)1之一表达量增加。

6.一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中该组成物包含一有效剂量之该桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或该桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物做为一有效成分，藉以于体外增加一前脂肪细胞之PGC-1α的一表达量，且该桑黄GKPl菌丝体的保藏编号系NITE BP-03321。

7.如权利要求6所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中该热水萃取物及/或该乙醇萃取物于离体之该有效剂量系150μg/mL至250μg/mL。

8.如权利要求6所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖之组成物的用途，其特征在于，其中相较于未施用该组成物之该前脂肪细胞，施用该组成物之该前脂肪细胞的UCP1及FNDC5之一表达量增加。

9.一种桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，其特征在于，其中该组成物包含一有效剂量之该桑黄GKPl菌丝体之一萃取物做为一有效成分，藉以于体外增加一前脂肪细胞之PGC-1α的一表达量，该萃取物于体外之该有效剂量系150μg/mL至250μg/mL，且该桑黄GKPl菌丝体之保藏编号系NITE BP-03321。

10.如权利要求9所述之桑黄GKPl菌丝体用于制备改善肥胖相关代谢性疾病之组成物的用途，其特征在于，其中该萃取物包含该桑黄GKPl菌丝体之热水萃取物及/或该桑黄GKPl菌丝体之乙醇萃取物。